烷化劑環(huán)磷酰胺和異環(huán)磷酰胺對大鼠肝微粒體CYP2C19酶活性的影響

王紅梅，張 震，張平平

(1.齊都醫(yī)院，山東 淄博255400;2.山東省藥學(xué)會，山東 濟南250101;3.山東萬杰醫(yī)學(xué)院，山東 淄博255213)

環(huán)磷酰胺(CTX)和異環(huán)磷酰胺(IFO)為目前臨床上常用的烷化劑類抗腫瘤藥物，直接破壞DNA結(jié)構(gòu)和功能，屬細胞周期非特異性藥物［1］。本研究采用奧美拉唑(OMZ)作為測定CYP2C19酶活性的指針，通過測定大鼠體外培養(yǎng)體系中5－羥基奧美拉唑(5－OHOMZ)與奧美拉唑德的濃度比值，反映CYP2C19 酶的活性［2，3］，研究 CTX、IFO 對 CYP2C19酶活性的影響，為臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 高效液相色譜系統(tǒng)(日本Shimadzu公司):紫外分光光度計、SCL－10Avp中央控制器、LC－10ATvp高壓泵、SIL－10ADvp自動進樣器及CLASS－VP 5.0色譜數(shù)據(jù)工作站;乙腈(色譜純，天津市西華特種試劑廠，批號:20050818);NADPH(北京拜爾迪生物公司，批號:20060810);奧美拉唑(珠海威爾凱化工有限公司，批號:20060730);磷酸氫二鈉(天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠，批號:20060803);磷酸二氫鈉(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號:20061031);5－羥基奧美拉唑(分析純，購自Sigma公司);非那西丁(中國生物制品檢定所，批號:100113－200302);二氯甲烷(分析純，南京中山集團公司化工廠，批號:20060115);甲醇(色譜純，天津市化學(xué)試劑三廠，批號:20070125);環(huán)磷酰胺及異環(huán)磷酰胺(中國藥品生物制品檢定所，批號分別為:100113－200302、100595－200501)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱:Phenomenex C8柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);島津 Shim － pack C8預(yù)柱(4.6 mm ×10 mm，5 μm);流動相為乙腈 －0.02 mol·L－1磷酸(26∶74，V/V)，用前經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾并經(jīng)超聲脫氣;檢測波長為302 nm;流速:1.0 mL·min－1;柱溫:30 ℃;進樣量20 μL。

1.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取奧美拉唑、5－羥基奧美拉唑?qū)φ掌?，分別制成1 000 mg·L－1、1 mg·L－1的儲備液，內(nèi)標物非那西丁制成100 mg·L－1水溶液。

精密稱取磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉;分別制成0.1 mol·L－1、0.02 mol·L－1的磷酸鹽培養(yǎng)液及緩沖液。精密稱取 NADPH制成100 mmol·L－1的NADPH輔因子溶液。

1.2.3 CYP2C19酶體外培養(yǎng)體系以及活性測定初始的培養(yǎng)體系中包括大鼠肝微粒體蛋白混懸液50 μL(蛋白濃度為 0.5 mg，350 μmol·L－1奧美拉唑溶液 20 μL，藥物溶液 20 μL，50 mmol·L－1NADPH 溶液 20 μL，最后加入 0.1 mol·L－1的磷酸鹽培養(yǎng)液使其最終體積為1 mL。在渦旋振蕩器上混和30 s，在37℃的水浴搖床中反應(yīng)20 min后，加入2 mL冰冷的二氯甲烷及非那西丁內(nèi)標20 μL，渦旋混勻30 s(沉淀蛋白，中止反應(yīng))，以12 000 rpm離心5 min后，取有機層1 mL，N2氣下吹干，加入50 μL流動相溶解，渦旋混勻30 s，以12 000 rpm離心5 min后，吸取上清液20 μL進樣分析，同時以不含肝微粒體的平行空白對照實驗來消除奧美拉唑自身水解帶來的影響。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用 Excel 2007和 SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。結(jié)果均用±s表示，組間比較采用配對t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 方法專屬性 按選定的色譜條件測得的奧美拉唑標準溶液和5－羥基奧美拉唑標準溶液、空白大鼠肝微粒體蛋白、大鼠肝微粒體蛋白樣品處理后的色譜見圖1、2、3。結(jié)果表明，在選定的色譜條件下，大鼠肝微粒體混懸液中的物質(zhì)不影響奧美拉唑及5－羥基奧美拉唑的測定，且奧美拉唑、5－羥基奧美拉唑和內(nèi)標峰分離良好。樣品中5－羥基奧美拉唑、內(nèi)標和奧美拉唑的保留時間分別為7.292、11.996、24.674 min。

圖1 奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑色譜圖

圖2 空白大鼠肝微粒體蛋白色譜圖

圖3 大鼠肝微粒體蛋白樣品處理后色譜圖

2.2 標準曲線和線性關(guān)系 取試管分別加入20 μL奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑?qū)φ掌废盗袧舛热芤?，然后分別加入0.05 mL大鼠肝微粒體蛋白混懸液，最后加入0.1 mol·L－1的磷酸鹽培養(yǎng)液至1mL，使奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑在培養(yǎng)液中的最終濃度分別為:1、3、5、7、9、11、13、15 μmol·L－1和 0.1、0.5、1、2、3、4、5 μg·mL－1，從“加入冰冷的二氯甲烷2 mL”開始，按CYP2C19酶活性測定的處理方法進行操作。分別以測得奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑與內(nèi)標非那西丁的峰面積之比Y對濃度X(μg·mL－1)進行線性回歸，計算直線回歸方程，得奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑的標準曲線方程。奧美拉唑:Y=0.054 4X+0.035 5，r=0.999;5 － 羥基奧美拉唑:Y=0.259 5X －0.052 3，r=0.996。

結(jié)果表明，在大鼠肝微粒體培養(yǎng)體系中奧美拉唑在1 ～15 μmol·L－1(0.35 ～5.18 μg·mL－1)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，5 －羥基奧美拉唑在0.1 ～5 μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 最低檢測限和最低定量限 在上述色譜條件下，以引起3倍于噪聲的被測樣品的進樣量為最低檢測限，奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑分別為15 ng·mL－1和10 ng·mL－1。當(dāng)信噪比S/N=10時獲得最低定量限，結(jié)果顯示，奧美拉唑的最低定量限為(0.034±0.01)μg·mL－1，5 － 羥基奧美拉唑的最低定量限為(0.025 ±0.01)μg·mL－1。

2.4 精密度考察 在大鼠肝微粒體培養(yǎng)體系中分別加入高、中、低3個不同濃度的奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑?qū)φ掌啡芤?，混合均勻，得到最終濃度分別為 1、7、15 μmol·L－1和 1、3、5 μg·mL－1三種不同濃度的奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑樣品，按上述“1.2.3”項下方法操作，取上清液 20 μL 進樣，所測結(jié)果分別代入奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑標準工作曲線中計算濃度，每個濃度一天內(nèi)重復(fù)測5次，計算其日內(nèi)精密度;每個濃度每天測定一次，連續(xù)測定5 d，同樣測定結(jié)果分別代入奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑標準工作曲線中計算濃度，計算其日間精密度，結(jié)果見表1。

表1 奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑的日內(nèi)和日間精密度(±s，n=5)

表1 奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑的日內(nèi)和日間精密度(±s，n=5)

對照品 加入濃度(μg·mL －1)日內(nèi)精密度(μg·mL－1)RSD(%)日間精密度(μg·mL－1)RSD(%)奧美拉唑3.17 5－羥基奧美拉唑17.271 120.897 259.06 16.73 ±3.87 112.22 ±1.58 252.98 ±4.35 3.99 1.70 4.45 16.57 ±3.40 111.66 ±2.35 249.38 ±3.06 3.54 2.55 50 150 250 48.96 ±1.63 144.06 ±4.54 241.31 ±6.45 3.34 3.15 2.67 47.94 ±1.77 144.06 ±4.53 241.31 ±6.48 3.69 3.15 2.67

2.5 回收率試驗 在大鼠肝微粒體培養(yǎng)體系中分別加入高、中、低3個不同濃度的奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑?qū)φ掌啡芤?，混合均勻，得到最終濃度分別為 1、7、15 μmol·L－1和 1、3、5 μg·mL－1三種不同濃度的奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑樣品，按上述“1.2.3”項下方法操作，取上清液 20 μL 進樣，所測結(jié)果分別代入奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑標準工作曲線中計算濃度，以含藥樣品經(jīng)處理后測得的色譜峰面積與相應(yīng)濃度的對照品溶液直接進樣測得的色譜峰面積比作為提取回收率，計算以上3個濃度水平的提取回收率，結(jié)果見表2。

2.6 環(huán)磷酰胺及異環(huán)磷酰胺對大鼠肝粒體CYP2C19酶活性的影響 結(jié)果見表3。

表2 奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑的提取回收率(±s，n=5)

表2 奧美拉唑和5－羥基奧美拉唑的提取回收率(±s，n=5)

對照品 加入濃度(μg·mL－1) 提取回收率(%)RSD(%)奧美拉唑17.271 120.897 259.06 95.79 ±4.20 93.45 ±1.86 98.10 ±4.77 4.38 1.99 4.86 5－羥基奧美拉唑50 150 250 96.60 ±3.87 95.36 ±1.72 96.31 ±1.86 4.01 1.80 1.93

表3 環(huán)磷酰胺及異環(huán)磷酰胺對大鼠CYP2C19酶活性的影響(±s，n=5)

表3 環(huán)磷酰胺及異環(huán)磷酰胺對大鼠CYP2C19酶活性的影響(±s，n=5)

藥物 濃度(mg·L －1)P值 抑制率(%)5－OHOMZ/OMZ不加入環(huán)磷酰胺1.06 ±0.01加入環(huán)磷酰胺 10 1.20 ±0.04不加異環(huán)磷酰胺 0 1.04 ±0.03異環(huán)磷酰胺0 0.000 2 20.7 ±3.47 10 1.26 ±0.040.001 12.63 ±6.32

3 討論

從表3中可以看出，環(huán)磷酰胺與異環(huán)磷酰胺對CYP2C19酶有顯著抑制作用。腫瘤化療藥物通常具有較小的治療指數(shù)，在臨床化療中往往很難預(yù)測腫瘤對藥物的反應(yīng)和機體毒性，因此抗腫瘤藥物的應(yīng)用及療效就受到很大的限制，集中表現(xiàn)為抗腫瘤藥物在患者體內(nèi)的藥效和毒性方面存在顯著的個體差異［4］。藥物代謝酶在抗腫瘤藥物的代謝中起著重要作用，對抗腫瘤藥的藥效及毒性的易感性有重要影響［5，6］。故實現(xiàn)臨床給藥個體化意義重大。而大多數(shù)化療藥物通常按經(jīng)驗給藥，很少實行劑量個體化給藥。腫瘤細胞對抗腫瘤藥物易產(chǎn)生耐藥性，其機制可能有多種［7～9］。腫瘤耐藥性的產(chǎn)生是多種分子機制共同作用的結(jié)果。事實上，藥物代謝酶滅活增加也是腫瘤耐藥的潛在重要機制［10］。因此研究抗腫瘤藥物的代謝性相互作用，也有利于了解抗腫瘤藥的耐藥性產(chǎn)生機制，為臨床合理應(yīng)用該類藥物，減少抗藥性的產(chǎn)生提供參考依據(jù)。

環(huán)磷酰胺與異環(huán)磷酰胺是臨床常用的氮芥類烷化劑抗腫瘤藥，主要用于大腸癌、乳腺癌、前列腺癌等實體瘤及再生障礙性貧血的治療［11］?，F(xiàn)已研究證實，環(huán)磷酰胺與異環(huán)磷酰胺在體內(nèi)都主要經(jīng)肝細胞色素P450代謝，而且均主要通過羥化代謝生成相應(yīng)的代謝產(chǎn)物。環(huán)磷酰胺與異環(huán)磷酰胺主要經(jīng)CYP2B6、CYP2C9、CYP2C19 及 CYP3A4 代謝［12～15］。實驗結(jié)果表明，環(huán)磷酰胺與異環(huán)磷酰胺不同程度地抑制CYP2C19酶的活性，環(huán)磷酰胺與異環(huán)磷酰胺的氧化代謝與奧美拉唑的氧化代謝有一定相關(guān)性，兩者同時應(yīng)用會對CYP2C19酶活性產(chǎn)生競爭抑制。故在臨床上環(huán)磷酰胺或異環(huán)磷酰胺與經(jīng)CYP2C19酶代謝的藥物聯(lián)合時，應(yīng)注意代謝性相互作用對相關(guān)藥物療效的影響。這一研究結(jié)果對于環(huán)磷酰胺或異環(huán)磷酰胺和相關(guān)藥物的用藥個體化具有重要的臨床意義。

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