香菇多糖提取方法的研究

石來寶，陳 靜，殷 霞

(瑞陽制藥有限公司，山東淄博256100)

香菇(Lentinusedodes)為擔(dān)子菌亞門，擔(dān)子菌綱，傘菌目，側(cè)耳科。香菇屬真菌，因其口味鮮美，香味濃郁，營養(yǎng)豐富，有顯著的藥用及滋補作用而被譽為“蘑菇皇后”、“抗癌新兵”、“菌中之秀”［1］、“諸菌之冠蔬菜之魁”，它的學(xué)名很多，有冬菇、花菇、香草、香信等。香菇不僅是一種美味佳肴，也是一種著名的藥用菌。我國歷代的醫(yī)藥學(xué)家對香菇的藥性及功能均有著述，如《日用本草》認為香菇“益氣、不饑、治風(fēng)、破血”［2］。香菇多糖(Lentinan，LNT)是香菇中的重要藥用成分，是一種天然人體免疫調(diào)節(jié)劑，具有抗腫瘤、抗感染和調(diào)節(jié)免疫力等作用。1969年日本學(xué)者千原率先證實了香菇熱水提取物的抗腫瘤活性，并對其進行了分析測定，證實此類物質(zhì)主要是一些高分子多糖(LNT)，它能提高巨噬細胞的吞噬能力，誘導(dǎo)白細胞介素－l(IL－1)和腫瘤壞死因子(TNF)的生成;促進T淋巴細胞增殖，誘導(dǎo)其分泌白細胞介素－2(IL－2);提高B淋巴細胞活性，增加多種抗體的分泌，增強機體的體液免疫調(diào)節(jié)功能，從而增強機體的抗病能力，并作為優(yōu)良的免疫調(diào)節(jié)劑進入臨床，國內(nèi)于1988年引進并實現(xiàn)國產(chǎn)化［3］。羽田、佐木進一步研究證實其有效成分是香菇多糖，CoroChi－h(huán)ara從香菇子實體中浸提出6種香菇多糖，并證明其中一種具有明顯的抗腫瘤作用，定名為Lentinan［4］。另一些香菇中的多糖物質(zhì)由D－葡萄糖、D－半乳糖、D－甘露糖、L－阿拉伯糖及D－木糖構(gòu)成。1980年恂二等確認香菇多糖為Th細胞激活劑，它使機體免疫功能得到恢復(fù)和提高而殺滅腫瘤細胞，可用于輔助癌癥治療［5］。自此，世界各地掀起了從大型真菌中尋找抗腫瘤藥物的熱潮，有關(guān)香菇多糖的研究尤其活躍。目前，我國已將槐耳制劑(一類新藥)、香菇多糖注射液(二類新藥)、云芝糖肽膠囊(二類新藥)、褐藻多糖硫酸酯、真菌多糖等多糖的研發(fā)列入高新技術(shù)產(chǎn)品開發(fā)的重點支持項目。

香菇多糖是一種以β－D［1→3］葡聚糖殘基為主鏈，側(cè)鏈為(1→6)葡聚糖殘基的葡聚糖［6］。關(guān)于香菇多糖的提取研究很多，大致分為酶法提取、酸法提取、堿法提取和水浸提法提取以及微波提取、超聲提取。水提醇沉法為最經(jīng)典的提取香菇多糖的方法，以工藝簡單、易于推廣等優(yōu)點為人們所接受。

本研究采用熱水浸提法、三氯乙酸浸提法、熱水浸提/超聲波處理后提取法、超聲波處理后/熱水浸提提取法從香菇子實體中提取香菇多糖，旨在比較這幾種方法的優(yōu)劣、提高得率、降低成本。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 FW177型中草藥粉碎機(天津市泰斯特儀器公司);紫外可見分光光度計(Spectrumlab 54上海棱光技術(shù)有限公司);電子調(diào)溫電熱套(HDM－500，江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司);數(shù)控超聲波清洗器KQ－250DB型，昆山市超聲儀器有限公司);離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);電熱溫鼓風(fēng)干燥箱(山東濰坊集團股份有限公司醫(yī)療器械廠);電子分析天平(MP300D，上海恒平科學(xué)儀器有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE－52A，上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 材料和試藥 香菇(市售，55～60℃烘干，粉碎，備用);三氯乙酸(分析純，天津市巴斯夫化工有限公司);乙酸(分析純，天津市巴斯夫化工有限公司);無水乙醇(分析純，天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心);葡萄糖(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠);苯酚(分析純，天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心);硫酸(優(yōu)級純，天津市化學(xué)試劑三廠);乙醚(分析純，天津市巴斯夫化工有限公司);溴化十六烷基三甲銨(分析純，國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司);水為去離子水。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 香菇多糖的提?。?］取香菇子實體放入烘箱內(nèi)，調(diào)溫98～100℃烘干、粉碎，過60目篩，備用。

2.1.1 熱水浸提法提取 稱取香菇粉10 g，置于燒杯中，加200 mL蒸餾水，96℃水浴提取2 h，靜置12 h后過濾。收集沉淀再水浴提取兩次，過濾，合并3次濾液，濃縮至100 mL，加入200 mL無水乙醇，靜置1 d，4 000 rpm離心10 min，沉淀用無水乙醇、乙醚依次洗滌后，自然風(fēng)干得粗香菇多糖。

2.1.2 三氯乙酸浸提法提取 稱取香菇粉10 g，置于燒杯中，加0.2 mol·L－1三氯乙酸(TCA)200 mL，室溫浸提12 h，過濾。收集沉淀再提取兩次，過濾，合并3次濾液，濃縮至100 mL，加入200 mL無水乙醇，靜置1 d，4 000 rpm離心10 min，沉淀用無水乙醇、乙醚依次洗滌后，自然風(fēng)干得粗香菇多糖。

2.1.3 熱水浸提/超聲波處理后提取 稱取香菇粉10 g，置于燒杯中，加200 mL蒸餾水浸提2 h后，96℃水浴1 h，超聲波處理1 h，靜置20 h后過濾。收集沉淀再提取兩次，過濾，合并3次濾液，濃縮至100 mL，加入200 mL無水乙醇，靜置1 d，4 000 rpm離心10 min，沉淀用無水乙醇、乙醚依次洗滌后，自然風(fēng)干得粗香菇多糖。

2.1.4 超聲波處理后/熱水浸提法提取 稱取香菇粉10 g，置于燒杯中，加200 mL蒸餾水浸提2 h后，超聲波處理1 h后96℃水浴1 h，靜置20 h，過濾。收集沉淀再提取兩次，過濾，合并3次濾液濃縮至100 mL，加入200 mL乙醇，靜置1 d，4 000 rpm離心10 min，沉淀用乙醇、乙醚洗滌后，自然風(fēng)干得粗香菇多糖。

2.2 香菇粗多糖純化［8］取干燥粗香菇多糖稱量后加蒸餾水(W∶V=1∶50)溶解，再加等體積0.15 mol·L－1的溴化十六烷基三甲銨(CTAB)與硼酸－硼砂緩沖液充分混勻，靜置，離心，沉淀用2 mol·L－1乙酸溶解，離心，上清液加入等體積乙醇，靜置24 h，離心，沉淀用乙醇洗滌兩次，凍干即為純化香菇多糖。

2.3 香菇多糖含量測定

2.3.1 對照品溶液的配制 取葡萄糖約10 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，用水溶解稀釋至刻度，即得葡萄糖對照品溶液(100 mg·L－1)。

2.3.2 最大吸收波長的選擇［9］采用苯酚－硫酸法測定多糖含量。精密吸取0.6 mL對照品溶液，加蒸餾水至1.0 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，混勻，迅速加入5 mL濃硫酸，振搖5 min，置沸水浴中15 min，然后置水中冷卻30 min。同時做空白，在200～800 nm范圍內(nèi)測定吸收度，結(jié)果在490 nm處有最大吸收。

2.3.3 線性關(guān)系考察 精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 葡萄糖對照品溶液(100 mg·L－1)，加蒸餾水至1.0 mL，加入5%苯酚液1.0 mL搖勻，迅速滴加濃硫酸5 mL，振搖5 min，置沸水浴中15 min，再置水中冷卻30 min，在490 nm處測定吸收度。以吸收度(A)為縱坐標(biāo)，對照品量(C)為橫坐標(biāo)，得回歸方程如下:A=0.010 8 C+0.007，r=0.998 7，在(18 ～106 mg·L－1)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.4 精密度試驗 精密吸取對照品溶液0.6 mL，按“2.3.3”項下分別測定吸光度，RSD為1.95%(n=5)，表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 精密吸取0.6 mL對照品溶液，按“2.3.3”項下每隔30 min測一次吸光度，結(jié)果RSD=1.91%(n=5)，表明在3 h內(nèi)樣品穩(wěn)定。

2.4 不同溶劑和方法提取香菇多糖的結(jié)果如表1所示。

表1 不同溶劑與方法提取香菇多糖的結(jié)果

實驗顯示:三氯乙酸浸提干香菇所得粗多糖質(zhì)量較低，但多糖含量高，究其原因可能為TCA法脫蛋白效果較好，但糖保留率低和存在多糖水解的問題;另外TCA的濃度也對結(jié)果產(chǎn)生重要的影響，多糖溶液中蛋白質(zhì)的脫除率受TCA濃度的影響，同時多糖損失率也受TCA濃度的影響，且蛋白質(zhì)的脫除率大小與多糖損失率大小呈現(xiàn)對應(yīng)關(guān)系。由于TCA法脫蛋白時反應(yīng)較為劇烈，當(dāng)TCA濃度過高時可能會引起多糖結(jié)構(gòu)的破壞，產(chǎn)生不期望的結(jié)果。綜合考慮蛋白質(zhì)脫除率、多糖損失率以及TCA可能對多糖造成的影響，這里TCA選擇0.1%的用量為佳［10］。干香菇TCA浸提所得粗多糖經(jīng)純化處理多糖含量達93.10%，綜合分析TCA浸提香菇多糖得率最高。

熱水浸提所得粗多糖質(zhì)量較高，經(jīng)純化處理多糖損失較多，純化處理后多糖含量最高，達93.12%，但純化多糖的得率較低。

超聲波處理/熱水浸提及熱水浸提/超聲波處理所得粗多糖質(zhì)量均較高，但多糖含量較低，經(jīng)純化處理中多糖損失較多，且純化多糖含量和得率較低。

3 討論

3.1 香菇原藥材的粉碎情況對其多糖的溶出有比較大的影響。如果顆粒過大，則多糖不容易被提取出來，如果粉碎的過細，則比表面積反而減小，也不利于多糖的溶出。香菇顆粒的粒徑為2～3 mm時可以得到較多的多糖粗品［11］。

3.2 香菇多糖提取時，加水量要合適，原料/無離子水(W/W)=1∶20 ～1∶25 為好［11］。過少，在沒有達到最佳蒸煮時間之前，浸出液已經(jīng)變得很少，甚至糊鍋，從而影響多糖含量;若加水過多，則浸出液過多，不利于以后的分離濃縮。

3.3 蒸煮溫度要合適，經(jīng)研究表明，在96℃條件下蒸煮可以達到較高的多糖得率［11］。溫度過低(85℃)，溶劑的滲透能力和溶解能力降低，使多糖不能有效的溶出;溫度過高(100℃以上)導(dǎo)致多糖的裂解，使多糖得率大大降低。

3.4 用苯酚－硫酸法測定多糖時，要保持硫酸足夠過量，因為該呈色反應(yīng)是以對多糖的水解和糖醛反應(yīng)為基礎(chǔ)的。

3.5 實驗中，分光光度計測定的吸光度數(shù)據(jù)是否準(zhǔn)確，與所用的苯酚有很大的關(guān)系。首先苯酚要純，本實驗用的苯酚為我們自行蒸餾配制。另外測定樣品用的苯酚和測標(biāo)準(zhǔn)曲線用的苯酚必須是一次配制的，這樣測得的數(shù)據(jù)才具有可信度，才有比較的價值。

3.6 由于真菌體內(nèi)有水解酶共存，所以必須采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄆ茐幕蛘咭种泼傅幕钚?，例如迅速加熱干燥、冷凍保存等?/p>

3.7 在多糖的醇沉過程中的醇的濃度對多糖的沉淀析出有較大的影響，一般情況下醇的濃度應(yīng)該為80%左右。

3.8 超聲法提取多糖有較多的優(yōu)點，可以縮短提取時間，提高工作效率，節(jié)省溶劑，提高有效成分的提取率，簡化提取操作步驟。另外，超聲提取一般是在常溫條件下進行，提取全過程無須加熱，避免了高溫對有效成分的破壞。超聲波破碎過程是一個物理過程，浸提過程中無化學(xué)反應(yīng)，可避免因結(jié)構(gòu)改變產(chǎn)生錯誤的結(jié)論。被浸提的生物活性物質(zhì)在一定時間內(nèi)保持不變，生物活性不減，該法適合于某些熱敏成分的提取。因此超聲技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物有效成分的提取。

在超聲法提取中，一種方法是先超聲波處理再熱水浸提，一種方法是先熱水浸提再超聲波處理，以比較處理方法的先后對結(jié)果是否有影響。根據(jù)實驗結(jié)果可知，先超聲波處理再熱水浸提效果較先熱水浸提再超聲波處理要好。

4 結(jié)論

本實驗采用不同溶劑和方法浸提香菇得到粗多糖，然后采用相同工藝純化粗多糖，結(jié)果表明用三氯乙酸從干香菇中提取香菇多糖，相對于其他溶劑方法提取的多糖純度好、得率高，香菇三氯乙酸浸提所得粗多糖經(jīng)純化處理多糖含量達93.10%。綜合分析香菇多糖提取以三氯乙酸浸提效果最佳。

［1］于淑池，林澤平.香菇的營養(yǎng)保健及免疫調(diào)節(jié)作用［J］.承德民族師專學(xué)報，2003，23(2):82 －83.

［2］楊新美.中國食用菌栽培學(xué)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1996:169－172.

［3］宋炳生，楊玉龍.香菇多糖抗腫瘤活性的研究概況［J］.中草藥，1998，29(7):492 －495.

［4］Chihara G，Hamuro J，Maeda Y，et al.Fractionation and purification of the polysaccharides with marked antitumor activity，especially Lentinan，from Lentinus edodes(Berk.)Sing.(an edible mushroom)［J］.Cancer Res，1970，30(11):2776－2781.

［5］方積年.多糖研究的現(xiàn)狀［J］.藥物學(xué)報，1987，21(12):944－950.

［6］Mashihi KN，Langle W.Immunotherapeutic Prospects of Infections Diseases［M］.Berlin:Springer Verlag，1990:9.

［7］楊勇杰，姜瑞芝，陳紅英，等.苯酚－硫酸法測定雜多糖含量的研究［J］.中成藥，2005，27(6):706 －708.

［8］郭亞貞，王慥，曲鵬鵬.香菇多糖的純化和結(jié)構(gòu)分析［J］.上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報，2000，9(1):35 －39.

［9］向曙光，劉思儉，朱萬洲.應(yīng)用苯酚法測定植物組織中的碳水化合物［J］.植物生理學(xué)通訊，1984，2:24 －27.

［10］朱美靜，童群義.猴頭多糖脫蛋白方法的研究［J］.河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2005，26(4):25－30.

［11］王衛(wèi)國，趙永亮.香菇多糖分離最佳工藝及最佳工藝原料探討［J］.中草藥，2000，31(8):584 －585.