萱草優(yōu)良單株花莖離體快繁1)

張潔茹 劉曉嘉 陳麗飛 趙春莉 董 然 顧德峰

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長春，130118)

萱草(Hemerocallis spp.)作為百合科萱草屬的極具經(jīng)濟(jì)價值和廣闊前景的宿根花卉［1－2］，越來越受到人們的青睞。但由于其自然分蘗繁殖的速度慢，遠(yuǎn)不能滿足城市綠化日益增長的需求，而利用組培快繁技術(shù)可以極大地提高萱草的繁殖倍數(shù)，加快繁殖速度，實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。目前，國內(nèi)關(guān)于萱草組培快繁的研究諸多，主要是對國外引進(jìn)的萱草新品種進(jìn)行組培快繁的研究［3－6］，而對萱草品種雜交后選育的優(yōu)良單株再進(jìn)行離體快繁無性系研究少見報道［7］;并且很多研究中，多數(shù)以花莖作為外植體，但由于萱草整株花莖很長又有分蘗，具體哪個部位啟動效果好，并未做出細(xì)節(jié)上的研究。因萱草品種間差異大，不同品種的誘導(dǎo)途徑、所需的激素種類及濃度存在差異性，所以針對每一品種系統(tǒng)地展開組培快繁的研究。

為能充分利用我國優(yōu)質(zhì)的萱草種質(zhì)資源、降低由國外引種產(chǎn)生的高額成本，本試驗以北京引進(jìn)的、資源有限的2 個萱草新品種和自行雜交后代優(yōu)選出的2 個萱草單株為試材，通過萱草花莖誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽的途徑對4 個萱草材料分別建立有效的離體快繁體系，并對花莖不同部位的啟動效果做了較詳盡的研究，還比較了4 個萱草材料在啟動培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)中的差異性，以期為不同萱草品種的工廠化育苗提供技術(shù)支撐，彌補(bǔ)品種單一的空缺，為我國的園林景觀多添新彩;并且還可以建立具有自主品種產(chǎn)權(quán)的萱草新品種，為下一步品種審定及品種推廣奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

以北京引進(jìn)的萱草新品種及吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)萱草試驗田經(jīng)多年栽培選育出的萱草雜交后代優(yōu)良單株為試材。選用的4 個萱草材料，分別編號為WNF(無名粉)、L － 1(綠色眼睛)、RBH、CC627，其中WNF 和L－1 為北京引進(jìn)的新品種:花為粉紅色系、花冠大，直徑約14 cm;RBH 和CC627 為選育出的優(yōu)良單株:植株矮化、花莖高約25 cm、花單瓣雙色。本試驗于天氣晴朗的清晨，截取抽葶20 cm、未開花、生長健壯、無病蟲害的萱草花莖作為外植體。

外植體滅菌:將抽葶20 cm 的萱草花莖分為上、中、下3 個部位，即距花托1.5 ～3.5 cm 處為花莖分枝處的“Y”型莖段，作為花莖上部;距花托3. 5 ～10.0 cm 處分節(jié)部位作為花莖中部;距花托＞10.0 cm 分節(jié)部位作為花莖下部。將取回的材料根據(jù)上、中、下部位分別剪切成2.0 ～2.5 cm 的小段(圖1中A、B)。因其幼嫩程度不同，對花莖上、中、下部位分別采用不同的方法滅菌，即花莖上部用75%酒精浸泡10 s 后再用0.1% HgCl2浸泡13 min;花莖中部用75%酒精浸泡20 s 后再用0.1% HgCl2浸泡14 min;花莖下部用75%酒精浸泡30 s 后再用0.1% HgCl2浸泡15 min，最終無菌水沖洗6 ～7 次，備用。

啟動培養(yǎng):將滅菌完畢的外植體分別接種于不同激素質(zhì)量濃度配比的啟動培養(yǎng)基上(表1)，每次處理100 瓶，每瓶1 個外植體，3 次重復(fù)。接種后觀察萌動時間、愈傷著生位置、愈傷類型等，30 d 后統(tǒng)計啟動率，以期篩選出4 個萱草材料的最佳取材部位、最適啟動培養(yǎng)基。啟動率=(萌動的外植體數(shù)/接種的無污染外植體數(shù))×100%;出愈率=(形成愈傷組織的外植體數(shù)/接種的無污染外植體數(shù))×100%;不定芽分化率=(愈傷組織分化不定芽的外植體數(shù)/形成愈傷組織的外植體數(shù))×100%;出芽率=(直接誘導(dǎo)出不定芽的外植體/接種的無污染外植體數(shù))×100%，見表2所示。

繼代增殖培養(yǎng):將分化不定芽的愈傷組織分切成0.5 cm×0.5 cm 小塊(圖1中J)和直接誘導(dǎo)出的不定芽(圖1中K)接種于不同激素質(zhì)量濃度配比的增殖培養(yǎng)基上(表3)，每次處理5 瓶，每瓶10 叢，1叢3 個芽，3 次重復(fù)。30 d 后統(tǒng)計不定芽的增殖率及系數(shù)，以期篩選出4 個萱草材料各自的最適增殖培養(yǎng)基。增殖率=(增殖的不定芽愈傷塊/接種總塊數(shù))×100%;增殖系數(shù)=增殖瓶數(shù)/接種總瓶數(shù)。

數(shù)據(jù)分析:試驗數(shù)據(jù)均用Excel 2003 和DPS v7.05 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

培養(yǎng)條件:試驗所用基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g/L、卡拉膠8 g/L，pH=5.8，培養(yǎng)溫度為(23±2)℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，光照時間為14 h/d。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素質(zhì)量濃度配比對外植體啟動效果的影響

接種30 d 后，在不加任何激素的Q1 處理下，4個萱草材料啟動率均為0，可見適宜外源激素添加對啟動培養(yǎng)的重要性。NAA 質(zhì)量濃度的高低對4個萱草材料的啟動效果無顯著影響，而6 －BA 和2，4－D 質(zhì)量濃度的高低對4 個萱草材料的啟動效果存在顯著差異。其中WNF、L －I 表現(xiàn)出一致性，適合二者的培養(yǎng)基6 －BA 質(zhì)量濃度均為1.0 mg/L，隨質(zhì)量濃度的不斷增加，啟動率逐漸降低，只在添加1.0 mg/L 2，4－D 的Q3 處理下啟動率最大，分別為45.00%和37.60%;CC627 隨6 －BA 質(zhì)量濃度增加，啟動率先升高后降低，當(dāng)6－BA 質(zhì)量濃度為2.0 mg/L、添加1.0 mg/L 2，4 －D 的Q5 處理下啟動率達(dá)到最大值62.53%;RBH 在添加2，4 －D 的培養(yǎng)基中均未出現(xiàn)萌動現(xiàn)象，而在未添加2，4 －D，6 －BA 質(zhì)量濃度為3.0 mg/L 的Q12 處理下啟動率達(dá)到最大值28.30%。

表1 不同激素組合中外植體的啟動狀況

啟動培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，以花莖為外植體出現(xiàn)間接和直接不定芽發(fā)生型［8］兩種途徑。不同激素質(zhì)量濃度配比下誘導(dǎo)的愈傷組織類型多樣，其中兩類較優(yōu)質(zhì)的愈傷組織為:①乳白或黃色，質(zhì)地緊實，表面凹凸不平，有顆粒感，剖開無褐化(圖1中E);②綠色，質(zhì)地較軟，表面凹凸不平，有黃白色小芽點(圖1中F)。當(dāng)6 －BA 與NAA 配比時易誘導(dǎo)出①號愈傷組織，而在6 －BA、NAA 和2，4 －D 三者共同作用下易誘導(dǎo)出②號愈傷組織;并且在添加2，4 －D 誘導(dǎo)出的愈傷組織較不添加2，4 －D 誘導(dǎo)出的愈傷組織質(zhì)地疏松，分化不定芽的速度快、數(shù)量多，可見2，4 －D是影響愈傷組織誘導(dǎo)的一個重要因素。綜合考慮，WNF 和L －1 最適啟動培養(yǎng)基為MS +6 － BA1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+2，4 －D1.0 mg/L;RBH 最適啟動培養(yǎng)基為MS +6 －BA3.0 mg/L +NAA1.0 mg/L;CC627 最適啟動培養(yǎng)基為MS+6－BA2.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+2，4 －D1.0 mg/L。

2.2 外植體取材部位對啟動效果的影響

接種1 周后，外植體均有不同程度的翻卷，其中上部“Y”型莖段分叉處及切口與培養(yǎng)基接觸部位(圖1中C、D)、中部莖段分節(jié)處及切口與培養(yǎng)基接觸部位均略有白色瘤狀突起。隨培養(yǎng)時間增加，白色瘤狀突起逐漸變大，5 周后，“Y”型莖段分叉處及切口處的瘤狀突起形成團(tuán)狀愈傷組織;中部莖段分節(jié)處的瘤狀突起直接形成不定芽(圖1中H、I)、切口處形成團(tuán)狀愈傷組織，而下部莖段無萌動現(xiàn)象。

由表2顯示，花莖上部只呈現(xiàn)間接不定芽發(fā)生途徑，而中部呈現(xiàn)間接和直接不定芽發(fā)生兩種途徑。不同萱草材料、不同部位愈傷和不定芽誘導(dǎo)率差異較大，其中CC627 花莖上、中部出愈率最高，分別達(dá)到86.30%和65.73%，而RBH 出愈率最低，僅為36.56%和20.30%。CC627 花莖上、中部不定芽分化率分別高達(dá)91.30%和58.30%，RBH 花莖上部愈傷分化率最低為52.47%，而中部愈傷組織無分化現(xiàn)象。4 個萱草材料均只在花莖中部直接誘導(dǎo)出不定芽，其中RBH 出芽率最高為48.57%，而CC627出芽率最低為32.87%。綜合考慮，花莖上部愈傷組織形成與分化能力較花莖中部強(qiáng)，但花莖中部直接誘導(dǎo)出不定芽的能力較強(qiáng)，省略了脫分化環(huán)節(jié)，可以大大的縮短繁育周期，故花莖上部和中部為萱草離體快繁的最佳外植體。

表2 外植體不同取材部位的啟動狀況 %

2.3 不同質(zhì)量濃度激素配比對增殖狀況的影響

由表3顯示，(1)WNF 和L－1 呈現(xiàn)出一致的趨勢，NAA 質(zhì)量濃度為0.1 mg/L 或0.2 mg/L 時，細(xì)胞分類素KT 添加與否，對WNF 和L －1 的增殖率差異顯著。當(dāng)單獨添加6 －BA2.0 mg/L 與0.1 mg/L或0.2 mg/L NAA 配比時，WNF 在增殖率上無顯著差異，但比較增殖系數(shù)，添加0.2 mg/L NAA 在P＜0.05 水平上顯著差異于添加0.1 mg/L NAA;而L－1 增殖率在P ＜0. 01 水平上存在極顯著差異。(2)當(dāng)確定NAA 質(zhì)量濃度后，RBH 的增殖率隨細(xì)胞分裂素質(zhì)量濃度升高而不斷增大，但當(dāng)細(xì)胞分裂素質(zhì)量濃度(6 －BA +KT)為4.0 mg/L 時，增殖率明顯下降。在Z4 處理下添加(6 －BA +KT)3.0 mg/L與Z5 處理下單獨添加6 －BA3.0 mg/L 雖不存在顯著差異，但Z4 處理的增殖率明顯低于Z5 處理，并且Z4 處理下易出現(xiàn)增殖苗不整齊現(xiàn)象。當(dāng)6 －BA3.0 mg/L，NAA0.2 mg/L 時，RBH 增殖率和增殖系數(shù)均達(dá)到最大，分別為95.17%和3.28。(3)CC627 增殖能力極強(qiáng)，只要細(xì)胞分裂素在1.0 ～3.0 mg/L 時，無論單獨添加6 －BA 或6 －BA 與KT 共同作用，增殖率均為100%，比較增殖系數(shù)，Z8 處理下的增殖系數(shù)在P ＜0.05 水平下顯著差異于其它各處理。4 個萱草材料的增殖狀況不盡相同，綜合考慮，WNF 和L－1 最適增殖培養(yǎng)基為MS + 6 － BA2. 0 mg/L +NAA0.2 mg/L;RBH 最適增殖培養(yǎng)基為MS +6 －BA3.0 mg/L +NAA0.2 mg/L;CC627 最適增殖培養(yǎng)基為MS+6 －BA1.0 mg/L+KT1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L。

3 結(jié)論與討論

以抽葶20cm 的萱草花莖為外植體進(jìn)行啟動培養(yǎng)，研究發(fā)現(xiàn)同一花莖上、中、下不同部位在誘導(dǎo)途徑、啟動效果上存在差異性。其中，花莖下部未見啟動，花莖上部和中部啟動能力強(qiáng)，視為最佳外植體，這與倪新等［9］研究有一些出入;并且花莖上部呈現(xiàn)間接不定芽發(fā)生途徑，中部呈現(xiàn)間接和直接不定芽發(fā)生兩種途徑，即花莖上部在分叉處和切口接觸培養(yǎng)基處先形成愈傷再分化產(chǎn)生不定芽，這與高鳳［5］、蘭麗婷［10］、畢曉穎［11］的研究結(jié)果一致;花莖中部在分節(jié)處和切口接觸培養(yǎng)基處也可先形成愈傷再分化產(chǎn)生不定芽，但愈傷量少于花莖上部分叉處，不過花莖中部還可以在分節(jié)處直接誘導(dǎo)出不定芽。這可能是由于花莖上部較中部存在更多的幼嫩組織，而幼嫩組織更有利于形成大量的愈傷組織。而花莖中部存在的組織正好處于幼嫩組織和成熟組織之間，一部分幼嫩組織可形成少量的愈傷組織，另一部分較成熟的組織可不經(jīng)過愈傷組織階段直接從外植體上產(chǎn)生不定芽。

啟動培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，花莖分叉處、分節(jié)處及切口處3 個不同位置均可形成較好愈傷組織(①號和②號)，這主要與不同激素質(zhì)量濃度的組合有關(guān)，而與愈傷著生位置無太大關(guān)系。其中，6 －BA 和2，4 －D質(zhì)量濃度的高低顯著影響啟動率的高低，而NAA 質(zhì)量濃度的高低對其無顯著影響，這一結(jié)果與蘭麗婷等［10］的研究相同。而過高質(zhì)量濃度的6 －BA(質(zhì)量濃度大于3.0 mg/L 時)易產(chǎn)生水漬狀愈傷和畸形不定芽(圖1中G)，故應(yīng)控制其用量;添加一定量的2，4 －D 對愈傷組織的疏松程度及分化有著一定影響，但應(yīng)與其它生長素類物質(zhì)配合使用效果才明顯，這與宋雪蓮［12］、楊麗莉［13］、時頌［14］的研究一致。

表3 4 種萱草在不同培養(yǎng)基中不定芽增殖狀況

圖1 萱草外植體處理、啟動培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)

激素配比是試管苗增殖的關(guān)鍵，細(xì)胞分裂素起主導(dǎo)作用［15－16］，增殖培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，KT 與6 －BA 相互作用配合低質(zhì)量濃度的NAA 對萱草不定芽增殖有一定影響，但要視不同品種而定，CC627 在KT 與6 －BA 相互作用下呈現(xiàn)出較好的增殖效果，而RBH卻呈現(xiàn)出增殖苗長勢不一致的現(xiàn)象。這可能與KT、6 －BA 二者促進(jìn)不定芽形成的效力不同及不同植株體內(nèi)所含內(nèi)源激素的差異性有關(guān)。

4 個萱草材料在啟動培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)中差異顯著，其中CC627 無論啟動還是增殖培養(yǎng)均呈現(xiàn)出較強(qiáng)的優(yōu)勢，而RBH 在啟動與增殖培養(yǎng)中較其它3 個材料均處于劣勢，但其花莖中部直接誘導(dǎo)不定芽的能力最強(qiáng)。這可能與激素質(zhì)量濃度配比和品種基因型有關(guān)［12］，表明不同品種的生長適應(yīng)性存在一定的差異。

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