健脾復(fù)方對大腸癌CD44和β-catenin表達(dá)的調(diào)控作用

劉 靜，范佳瑋，呂 祥

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院，上海 200041)

大腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一，也是主要的腫瘤死因之一[1]。以上海市為例，2003—2007年大腸癌粗發(fā)病率和病死率分別為43.35/10萬和22.42/10萬，大腸癌的發(fā)病率位居全部惡性腫瘤的第2位，病死率位居全部惡性腫瘤的第4位[2]，發(fā)病率增速遠(yuǎn)超2%的國際水平。2013年6月召開的第九屆上海國際結(jié)直腸癌高峰論壇上報道，我國大腸癌有15%～25%結(jié)直腸癌患者在確診時即合并有肝轉(zhuǎn)移，而有15%～25%的患者在結(jié)直腸癌原發(fā)灶根治術(shù)后發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，其中絕大多數(shù)(80%～90%)的肝轉(zhuǎn)移灶無法獲得根治性切除。因此優(yōu)化大腸癌治療方案是亟待解決的問題。中醫(yī)藥治療大腸癌已在臨床上獲得廣泛應(yīng)用，本實(shí)驗(yàn)擬對健脾復(fù)方治療大腸癌的機(jī)制進(jìn)行探討。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動物 SW620小鼠30只，雌雄不同，正常同養(yǎng)。

1.2血清制備方法 方藥血清制備：裸小鼠予健脾復(fù)方(由黃芪30 g、黨參12 g、炒白術(shù)12 g、茯苓12 g、炙甘草6 g、半夏6 g、天龍6 g、紅藤30 g、藤梨根30 g、生牡蠣30 g等組成，生藥由上海市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科提供，根據(jù)處方比例，取適量生藥，第1次加13倍水煮沸后1 h保溫2 h將藥液濾出；第2次加11倍水煮沸后1 h保溫2 h將藥液濾出。濾液合并濃縮，加入95%乙醇適量(依公式V×60/(95-60))，冷藏靜置24 h濾出。將濾液濃縮至流浸膏樣，配制成濃度為含生藥量3 g/mL，由上海市中醫(yī)醫(yī)院制劑室協(xié)助制備)灌胃1 mL/d，連續(xù)給藥1周，最后一次給藥后1 h，麻醉后心臟采血，分離健脾復(fù)方血清，過濾后滅菌，-80 ℃冰箱保存。正常裸小鼠血清制備：每天用生理鹽水灌胃，劑量及血清制備方法同制備。

1.3細(xì)胞分離培養(yǎng)方法及分組 大腸癌細(xì)胞株SW620由上海市腫瘤研究所提供，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃ 5%二氧化碳常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，取處于指數(shù)生長期的SW620細(xì)胞，消化、離心、分離成單細(xì)胞懸液。將SW620單細(xì)胞懸液分別取細(xì)胞數(shù)5×105接種于96孔板，然后分為3組，空白對照組予正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，藥物空白組用正常裸小鼠血清按15%濃度與正常培養(yǎng)基混合后培養(yǎng)，健脾復(fù)方組用健脾復(fù)方含藥血清，按15%的濃度與正常培養(yǎng)基混合后培養(yǎng)。貼壁后分別加入透明質(zhì)酸原液250 μL，終濃度為500 μg/mL。

1.4檢測指標(biāo) 培養(yǎng)72 h后，采用流式細(xì)胞技術(shù)分析各組CD44的表達(dá)情況，采用Western Blot方法檢測β-鏈蛋白(β-catenin)的表達(dá)情況。

1.4.1流式細(xì)胞檢測方法 采用流式細(xì)胞儀分析各組CD44的表達(dá)情況，計算CD44-APC通過FL4通道的百分率。

1.4.2Western Blot檢測方法 試劑由上?；鶢栴D生物科技有限公司提供。將需要抽提蛋白的細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，適量預(yù)冷的1×PBS洗滌2次，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液，4 ℃充分裂解細(xì)胞，將細(xì)胞刮入1.5 mL EP管中，95 ℃以上加熱10 min，12 000 g離心 10 min，取上清，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后貯存于-80 ℃冰箱。配10%分離膠，每孔上樣20 μg蛋白，濃縮膠電泳80 V 20 min，分離膠120 V 60 min，半干轉(zhuǎn)膜，并于5%脫脂奶粉封閉，4 ℃過夜。根據(jù)說明書，配置1∶1 000稀釋抗體的抗β-catenin(Abcam公司，貨號Ab86714)的一抗工作液，4 ℃過夜。TBST洗膜3×5 min，根據(jù)用量按照1∶1 000稀釋HRP標(biāo)記的二抗(碧云天公司，貨號A0208)，與膜37 ℃孵育1 h，用TBST洗膜5 min×3次。發(fā)光成像，并與GAPDH灰度值比較，判斷蛋白相對表達(dá)的變化。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)法。

2 結(jié) 果

2.13組CD44表達(dá)量比較 空白對照組、藥物空白組和健脾復(fù)方組的CD44相對表達(dá)量分別為0.791±0.008，0.737±0.007，0.533±0.018。經(jīng)方差分析，3組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=384.102，P<0.001)；經(jīng)LSD法兩兩比較，健脾復(fù)方組與空白對照組以及健脾復(fù)方組與藥物空白組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。

2.23組β-catenin表達(dá)量比較 空白對照組、藥物空白組和健脾復(fù)方組的β-catenin相對表達(dá)量分別為1.396±0.437，1.491±0.467，0.671±0.213。經(jīng)方差分析，3組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=7.978，P=0.004)；經(jīng)LSD法兩兩比較，健脾復(fù)方組與空白對照組以及健脾復(fù)方組與藥物空白組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。

3 討 論

透明質(zhì)酸是一種由2 000～25 000個葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺組成的黏多糖，分子量105～107Da，廣泛分布于細(xì)胞外基質(zhì)中。研究顯示腺癌釋放的因子可刺激腸道間質(zhì)細(xì)胞合成HA[3]，新合成的HA被分泌到細(xì)胞表面與其主要的受體CD44相互作用，或釋放入周圍細(xì)胞和細(xì)胞外間質(zhì)中[4]。CD44是黏附分子家族的成員，HA-CD44相互作用可促進(jìn)SW620腫瘤細(xì)胞的侵襲[5]，并可在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生包含CD44和ErbB2或上皮生長因子受體(epithe，EGFR)的復(fù)合物，而阻斷HA-CD44相互作用可抑制這一復(fù)合受體信號復(fù)合物的合成[6]。由此可見，內(nèi)源性HA激活CD44，可影響其下游一系列因子，最終調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生存和增殖，抑制CD44 表達(dá)可降低腫瘤細(xì)胞的數(shù)量和生長[7]。β-catenin是另一個黏附分子家族的重要成員，參與大腸癌的腫瘤侵潤和轉(zhuǎn)移，大腸癌中CD44與β-catenin的表達(dá)具有一定的相關(guān)性[8]，因此阻斷細(xì)胞黏附分子也可能是大腸癌防治的重要靶點(diǎn)之一。

健脾復(fù)方以黃芪合四君子湯健脾益氣，以資后天之本，脾氣得健，則氣生血運(yùn)，正氣得復(fù)；配以半夏、天龍、紅藤、藤梨根、生牡蠣等解毒散結(jié)之品，使腫塊得以徐徐消之，全方寓攻于補(bǔ)，攻補(bǔ)兼施，共奏扶正祛邪之功。筆者先前通過大腸癌裸小鼠原位移植瘤模型研究顯示健脾復(fù)方可顯著減輕瘤質(zhì)量，減少瘤體積和轉(zhuǎn)移灶個數(shù)[9]，對HA-CD44下游的因子如EGFR、環(huán)氧化酶-2、前列腺素E2、血管上皮生長因子[10-11]等的表達(dá)有顯著抑制作用，并可進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]。本研究結(jié)果顯示健脾復(fù)方可以抑制HA-CD44相互作用，抑制CD44的表達(dá)，并可下調(diào)另一重要的細(xì)胞黏附分子β-catenin的表達(dá)，綜合本實(shí)驗(yàn)及以往實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果，筆者推測健脾復(fù)方通過抑制CD44和β-catenin表達(dá)，從而可能影響其下游一系列與大腸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的因子，因此起到抑制大腸癌的作用。

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