NKX2-5與先天性心臟病發(fā)病關(guān)系的研究進(jìn)展

李金綜述，唐燕華審校

NKX2-5與先天性心臟病發(fā)病關(guān)系的研究進(jìn)展

李金綜述，唐燕華審校

NKX2-5是最早被發(fā)現(xiàn)與心臟發(fā)育及成熟相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，其異常的表達(dá)將影響胚胎心臟發(fā)育，最終可能導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)畸形和傳導(dǎo)功能受損，甚至死亡。本文簡(jiǎn)要地回顧了NKX2-5的生物學(xué)特性及其在心臟發(fā)育中的作用，并匯總了近幾年來(lái)在先天性心臟?。–HD）患者樣本中新發(fā)現(xiàn)的NKX2-5 基因突變，為后繼臨床研究提供參考。

轉(zhuǎn)錄因子；先天性心臟病；心臟發(fā)育；基因突變

先天性心臟?。–HD）是指在胚胎發(fā)育時(shí)期心臟及大血管的形成障礙或發(fā)育異常，或出生后應(yīng)自動(dòng)關(guān)閉的通道未能閉合的一類(lèi)常見(jiàn)先天畸形。流行病學(xué)資料顯示，活產(chǎn)嬰兒先天性心臟病發(fā)病率約為0. 5%～0.8%[1]，由于CHD 表現(xiàn)形式多，病因復(fù)雜，其具體的發(fā)病機(jī)制至今仍不明確。隨著遺傳學(xué)研究的深入開(kāi)展及分子生物技術(shù)的廣泛應(yīng)用，人們對(duì) CHD 的分子遺傳學(xué)研究已取得了令人矚目的成就，目前已有 NKX2-5、GATA4、TBX5、MYH6、ACTC1、 NOTCH1 等基因突變被證實(shí)與CHD的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)[2]。其中NKX2-5最早被發(fā)現(xiàn)與心臟的發(fā)育及成熟相關(guān)，是心臟發(fā)育過(guò)程中的重要轉(zhuǎn)錄因子之一。自1998年 Schott 等[3]首次在 CHD 患者中檢測(cè)到NKX2-5基因的三個(gè)突變位點(diǎn)以來(lái)，在人群中開(kāi)展 NKX2-5基因突變掃描已成為研究的熱點(diǎn)。本文就轉(zhuǎn)錄因子 NKX2-5在心臟發(fā)育中的作用及近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的基因突變位點(diǎn)與單純型 CHD 的關(guān)系進(jìn)行闡述。

1 先天性心臟病簡(jiǎn)述

CHD 是人類(lèi)出生缺陷中最常見(jiàn)的畸形，約有80%的患者僅表現(xiàn)為心臟畸形，而不伴有其他系統(tǒng)的先天異常，稱(chēng)之為單純型 CHD。CHD 多為散發(fā)病例，也有少數(shù)呈家族性發(fā)病。根據(jù) CHD 臨床表現(xiàn)有無(wú)紫紺可分為紫紺型心臟病和非紫紺型 心臟病。紫紺型心臟病是因心臟和大血管結(jié)構(gòu)異常而導(dǎo)致心內(nèi)血液右向左分流的一類(lèi)疾病，早期即可出現(xiàn)肺動(dòng)脈高壓，包括法樂(lè)四聯(lián)癥（TOF）、單心室（SV）、大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位（TGV）等。而非紫紺型心臟病表型則更為復(fù)雜多樣，臨床上常見(jiàn)的類(lèi)型有：房間隔缺損（ASD）、室間隔缺損（VSD）、動(dòng)脈導(dǎo)管未閉（PDA）和房室傳導(dǎo)阻滯（AVB）等。

2 NKX2.5 生物學(xué)特征

人類(lèi) NKX2-5基因在進(jìn)化過(guò)程中高度保守，也常被稱(chēng)為CSX 基因或心臟特異性同源盒基因，其定位于染色體 5q35，具有兩個(gè)外顯子，互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA）全長(zhǎng)1 585bp，可編碼含有324個(gè)氨基酸的蛋白[4]。NKX2.5 蛋白分子量為35 kDa，含有三個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域，它們分別是 TN 結(jié)構(gòu)域（氨基酸10-21）、同源結(jié)構(gòu)域（氨基酸138-197）及 NK2-SD結(jié)構(gòu)域（氨基酸212-234）[3，4]。其中同源結(jié)構(gòu)域又稱(chēng)為 HD結(jié)構(gòu)域，蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為3個(gè) a-螺旋，為可辨識(shí)螺旋，可特異結(jié)合于 DNA 順式作用元件5’-T（C/T）AAGTG-3’（NKE）序列，從而啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄[5]。NK2-SD 結(jié)構(gòu)域在體外基因?qū)嶒?yàn)中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用，而關(guān)于 TN區(qū)域的作用目前尚不明確。以上信息提示 HD 結(jié)構(gòu)域可能是NKX2-5發(fā)揮下游基因調(diào)控作用的核心部位。

3 NKX2-5 在心臟發(fā)育中的作用

心臟發(fā)育是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程。最初心臟起源于三胚層胚盤(pán)頭端、口咽膜前方的臟壁中胚層（生心區(qū)），經(jīng)歷了心臟細(xì)胞特化、心管發(fā)生、心臟環(huán)化，最終發(fā)育形成具有心房、心室、間隔和瓣膜等結(jié)構(gòu)的成熟心臟。這些結(jié)構(gòu)的形成和正常發(fā)育均涉及胚胎發(fā)育過(guò)程中的不同時(shí)間和空間的若干個(gè)特定基因或基因組的先后精準(zhǔn)表達(dá)[6]。

在心臟發(fā)育過(guò)程中，相關(guān)特定基因的正常表達(dá)是形成具有功能性心臟的關(guān)鍵，而 NKX2-5正是這些相關(guān)特定基因中最早表達(dá)產(chǎn)物之一，也是心臟前體細(xì)胞最早的標(biāo)志物。NKX2-5作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的起始端，參與了心臟前體細(xì)胞的分化、心臟環(huán)化、房室分隔、房室流出道和傳導(dǎo)系統(tǒng)的形成及成體心臟正常功能的維持，并持續(xù)表達(dá)于心肌細(xì)胞分化的各個(gè)階段，在胚胎、胎兒乃至成體心肌細(xì)胞中均保持一定的表達(dá)水平[6]。

早在上世紀(jì)90年代，人們就從果蠅身上分離出與果蠅心臟發(fā)育密切相關(guān)的 tinman 基因（NK-2 型基因），并在以后的研究中證實(shí)其與 NKX2-5基因高度同源，它的突變會(huì)導(dǎo)致果蠅心臟形成異常。為進(jìn)一步探討 NKX2-5基因的表達(dá)與人類(lèi)心臟發(fā)育的關(guān)系，研究者們?cè)谂c人類(lèi)基因組類(lèi)似的小鼠模型中初見(jiàn)端倪。Ueyama 等[7]報(bào)道了 NKX2-5從小鼠胚胎發(fā)育的第 7.5天開(kāi)始表達(dá)，NKX2-5基因缺失的小鼠心臟環(huán)化受阻，約在第 11天左右死亡。Terada 等[8]利用他莫昔芬誘導(dǎo)敲除胚胎發(fā)育第 12.5天的小鼠 NKX2-5基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠在第 16天時(shí)出現(xiàn)心律失常、結(jié)構(gòu)異常等現(xiàn)象，于第 17.5天時(shí)死亡。這些現(xiàn)象提示無(wú)論在胚胎發(fā)育的早期還是中期，NKX2-5基因的缺失都可能使心臟發(fā)育停滯在相應(yīng)階段，甚至導(dǎo)致胚胎死亡。此外，Kasahara 等[9]NKX2-5基因過(guò)表達(dá)的研究中，也發(fā)現(xiàn)了小鼠于胚胎發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)房室傳導(dǎo)阻滯和心臟結(jié)構(gòu)缺陷等表型。綜上可推測(cè)人類(lèi) NKX2-5基因表達(dá)的異常也可能對(duì)心臟正常形態(tài)、結(jié)構(gòu)和傳導(dǎo)系統(tǒng)等造成重要影響。

4 NKX2-5 基因突變與先天性心臟病的關(guān)系

NKX2-5作為目前研究與心臟發(fā)育相關(guān)最廣泛的轉(zhuǎn)錄因子之一，其基因的測(cè)序和突變篩查備受研究者們關(guān)注。以往報(bào)道了40余種 NKX2-5基因突變位點(diǎn)可能與 CHD 的各種表型發(fā)生相關(guān)[4]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在單純型 CHD 患者的血樣本或/和心肌組織樣本中至少探測(cè)出28種突變類(lèi)型[10-24]，它們大部分為新發(fā)現(xiàn)的基因突變位點(diǎn)，其中發(fā)生在 HD 結(jié)構(gòu)域的有4種，有1種發(fā)生在 NK2-SD結(jié)構(gòu)域。這些基因突變廣泛分布于 NKX2-5基因編碼區(qū)及非編碼區(qū)的各個(gè)區(qū)域，包括錯(cuò)義突變、缺失突變、插入突變和同義突變等（見(jiàn)表1和表2）。從表中不難看出NKX2-5基因突變與 CHD 的發(fā)生缺乏“突變—表型”對(duì)應(yīng)關(guān)系，即同一突變位點(diǎn)可有多種 CHD表型，而同一 CHD 表型又可對(duì)應(yīng)多種突變位點(diǎn)。此外，由于地理環(huán)境不同，人種不同，NKX2-5基因突變位點(diǎn)的檢出還存在明顯地域和人種差異[21]。

錯(cuò)義突變是指編碼某種氨基酸的密碼子經(jīng)堿基替換以后，變成編碼另一種氨基酸的密碼子，從而可使多肽鏈的氨基酸種類(lèi)和序列發(fā)生改變，甚至對(duì)蛋白質(zhì)的功能造成一定影響。新發(fā)現(xiàn)的錯(cuò)義突變多在罕見(jiàn)的家族性 CHD 中被檢出，只有少部分來(lái)自于臨床常見(jiàn)的散發(fā)性 CHD 患者。2010年，Gioli-Pereira等[17]在1例散發(fā)性三尖瓣下移畸形的患者中發(fā)現(xiàn)了 C.124 G＞C 的變異，同時(shí)卻意外地在其無(wú) CHD 表型的父母的血樣本中同樣檢測(cè)到了該突變。這提示用單基因突變解釋散發(fā)性 CHD 的發(fā)病機(jī)理可能存在缺陷。2012年，Granados-Riveron 等[20]在另1例散發(fā)性 ASD 患者中檢測(cè)到了NKX2-5基因與 MYH6 基因的聯(lián)合突變，其中前一個(gè)突變來(lái)源于無(wú) CHD表型的父親，而后者則來(lái)源于無(wú) CHD表型的母親。根據(jù)以上現(xiàn)象可以推測(cè)多基因聯(lián)合突變更應(yīng)該用于闡明散發(fā)性單純型 CHD 的發(fā)病機(jī)制，而單基因錯(cuò)義突變可能只增加 CHD 患病的易感性。

插入和缺失突變可導(dǎo)致核苷酸的總數(shù)發(fā)生變化，常在突變位點(diǎn)后產(chǎn)生新的讀碼框，編碼與之前完全不同的多肽鏈。新發(fā)現(xiàn)的2個(gè)缺失突變和1個(gè)插入突變，均來(lái)自于家族性單純型 ASD 患者，它們的出現(xiàn)使 NK2-SD 結(jié)構(gòu)域氨基酸序列發(fā)生較大改變[16]，甚至導(dǎo)致 HD 結(jié)構(gòu)域和 NK2-SD 結(jié)構(gòu)域部分或完全缺失[12，18]。這暗示著插入和缺失突變對(duì)NKX2-5結(jié)構(gòu)和功能的影響可能大于錯(cuò)義突變，且與家族性 CHD 的發(fā)生關(guān)系可能更為密切。

不同于錯(cuò)義突變，發(fā)生堿基替換而不引起編碼氨基酸的改變則稱(chēng)為同義突變。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為同義突變因其未導(dǎo)致氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)改變，從而不引起蛋白質(zhì)功能的變化，因此不會(huì)成為致病因素。然而隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)同義突變可能通過(guò)影響 mRNA 的轉(zhuǎn)錄進(jìn)程或蛋白質(zhì)的構(gòu)象來(lái)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能[25]。就高頻率出現(xiàn)于編碼區(qū)的 c.63 A＞G 變異而言[10-13，21]，有學(xué)者在獨(dú)立擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)堿基替換雖未引起21位的谷氨酸發(fā)生改變，但卻導(dǎo)致 mRNA 轉(zhuǎn)錄活性下降20%[12]，并且最新的 Meta 分析也證實(shí)了 c.63 A＞G 可能成為CHD 患病的危險(xiǎn)因素[26]。另外，在 NKX2-5基因調(diào)控區(qū)、啟動(dòng)區(qū)等非編碼區(qū)突變的研究中，學(xué)者們先后證實(shí)了部分增強(qiáng)子及啟動(dòng)子區(qū)域位點(diǎn)的突變也將對(duì)轉(zhuǎn)錄活性產(chǎn)生減低或增強(qiáng)的影響，從而導(dǎo)致 NKX2-5異常表達(dá)[23，24]，進(jìn)一步引發(fā)下游基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的失衡，為CHD的發(fā)生機(jī)制提供另外一種可能的依據(jù)。

表1 NKX2-5基因編碼區(qū)突變位點(diǎn)、氨基酸改變及先天性心臟病表型等對(duì)比

表2 NKX2-5基因非編碼區(qū)位點(diǎn)突變及轉(zhuǎn)錄活性影響分析

5 結(jié)語(yǔ)與展望

總而言之，轉(zhuǎn)錄因子NKX2-5在胚胎心臟的發(fā)育過(guò)程中起到了舉足輕重的作用，它的異常表達(dá)將對(duì)心臟結(jié)構(gòu)和傳導(dǎo)系統(tǒng)的發(fā)育造成重要影響。近年來(lái)，新檢出的突變?cè)谝欢ǔ潭壬蠑U(kuò)增了 NKX2-5基因突變?cè)?CHD 相關(guān)研究中的種類(lèi)，為闡明 NKX2-5基因突變與單純性CHD的發(fā)病關(guān)系提供了更多的新思路。然而，遺憾的是新發(fā)現(xiàn)的突變大多未進(jìn)一步行蛋白質(zhì)表達(dá)和功能學(xué)分析，所以由這些突變所引發(fā)的氨基酸序列改變是否都能成為 CHD 患病的危險(xiǎn)因素還缺乏有力證據(jù)。期待今后有更多的學(xué)者能參與到CHD患者 NKX2-5基因及其相關(guān)基因突變篩查的研究中，并同時(shí)能對(duì)新發(fā)現(xiàn)的或以往報(bào)道的突變行轉(zhuǎn)錄活性、蛋白質(zhì)功能、轉(zhuǎn)染等相關(guān)分析，以明確突變引發(fā)的后果。為今后闡明 CHD的發(fā)病機(jī)理、基因產(chǎn)前診斷和基因靶向治療等提供新向?qū)А?/p>

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2014-03-03）

（編輯：曹洪紅）

330006，江西省南昌市，南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 心胸外科

李金 碩士研究生 主要從事心臟各類(lèi)疾病與基因突變相關(guān)性研究 Email:m15870005858@163.com 通訊作者：唐燕華

Email:tyh6565@163.com

R541

A

1000-3614（2014）12-1061-03

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.12.026