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    納升級反相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分析蜈蚣提取蛋白質(zhì)

    2014-03-04 21:38:06陳霞文紅梅等
    分析化學(xué) 2014年2期
    關(guān)鍵詞:凝膠電泳蜈蚣甲酸

    陳霞 文紅梅等

    摘 要 結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳和納升級反相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(nanoRPLCMS/MS)法系統(tǒng)分析了蜈蚣提取蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解和直接酶解產(chǎn)物,并進行數(shù)據(jù)庫檢索鑒定蛋白質(zhì)。建立的nanoLC分析條件為:上樣8 μL, 經(jīng)Chrom XPC18毛細管柱(350 μm×0.5 mm,3 μm),2%乙腈(0.1%甲酸)98%乙腈(0.1%甲酸)梯度洗脫90 min;采用ESIQTOF MS,并在IDA采集模式下分析鑒定蜈蚣提取蛋白質(zhì)。膠內(nèi)酶解鑒定到 72 種蛋白質(zhì),直接酶解鑒定到 97 種蛋白質(zhì),二者含26種相同的蛋白質(zhì)。通過數(shù)據(jù)庫比對,分析了蜈蚣提取蛋白質(zhì)的生物進程、細胞組分以及功能活性。得到蜈蚣蛋白質(zhì)具有結(jié)合、酶催化、肌動等功能活性,其中結(jié)合活性的蛋白質(zhì)占的比例較大,且多為能量代謝進程中的相關(guān)酶類。

    關(guān)鍵詞 納升級反相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜; 蜈蚣; 蛋白質(zhì); 聚丙烯酰胺凝膠電泳

    1 引 言

    蜈蚣為節(jié)肢動物門唇足綱整形目蜈蚣科動物少棘巨蜈蚣(Scolopendrasubspinipes.mutilans L. Koch)的干燥體 [1 ],具有息風(fēng)鎮(zhèn)痙、通絡(luò)止痛、攻毒散結(jié)等功效,已廣泛用于臨床疾病的治療。蜈蚣主要含有蛋白質(zhì)、脂肪酸、氨基酸、總脂、微量元素等 [2~4 ],且蛋白質(zhì)為其主要成分,占總成分的50%~70%。藥理研究表明其具有抗腫瘤 [5,6 ]、抗凝血 [7,8 ]、抗驚厥 [9 ]、抗菌 [10 ]等活性。蜈蚣蛋白的研究較少,Zhao等 [11 ]從蜈蚣中分離純化得到一種具有抗腫瘤和免疫活性的多糖蛋白復(fù)合物,Kong等 [12 ]從蜈蚣中提取分離出一種多肽,藥理實驗顯示具有抗血栓活性。但目前尚缺少對蜈蚣蛋白質(zhì)的系統(tǒng)分析方法。本研究首次引入蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法,建立了高靈敏、高通量的納升級反相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法,結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳對蜈蚣提取蛋白質(zhì)的膠內(nèi)酶解和直接酶解產(chǎn)物進行分析,并對鑒別到的蛋白質(zhì)的生物進程、細胞組分及功能活性進行分析,較系統(tǒng)地研究了蜈蚣提取蛋白質(zhì),為蜈蚣蛋白質(zhì)的研究提供了新方法。

    2 實驗部分

    2.1 儀器、試劑與材料

    納升級液相色譜系統(tǒng):EksigentekspertTM nanoLC液相系統(tǒng),Eksigent software V.3.12液相工作站;高分辨質(zhì)譜系統(tǒng):TripleTOFTM5600,配有電噴霧離子源(ESI)、Analyst TF 1.6色譜工作站、Peak View 1.2質(zhì)譜分析軟件和ProteinPilot 4.5蛋白質(zhì)分析軟件(美國AB Sciex公司)。垂直凝膠電泳儀(美國Biorad公司);離心濃縮儀(美國Labconco公司);ZipTipC18 Pipette Tips(美國Millipore公司)。

    十二烷基磺酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DTT)、尿素(UREA)購于Biosharpp公司;碘乙酰胺(IAA,Aladdin公司);胰蛋白酶(Trypsin,Promega質(zhì)譜測序級)。乙腈、甲醇、甲酸等質(zhì)譜用試劑均為質(zhì)譜級(德國Merck公司)。

    蜈蚣購于江蘇省萬生中藥飲片有限公司,產(chǎn)地湖北(批號111001),經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室陳建偉教授鑒定為少棘巨蜈蚣(Scolopendrasubspinipesmutilans L. Koch)的干燥體。

    2.2 蜈蚣總蛋白的提取

    蜈蚣藥材粉碎后,取粗粉20 mg,加入裂解緩沖溶液(2% SDS,20 mmol/L DTT, 50 mmol/L PBS pH 7.8) 2 mL,65 ℃水浴中孵育過夜。10000 r/min離心20 min,上清液加入乙醇, 使乙醇終濃度為70%,沉淀蛋白。離心后,取沉淀用70%乙醇洗滌2次,沉淀經(jīng)離心濃縮干燥,

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    2.3 蜈蚣蛋白質(zhì)酶解

    2.3.1 直接酶解

    取蜈蚣蛋白約200 μg,加2%SDS,20 mmol/L DTT,50 mmol/L PBS溶液125 μL, 37 ℃孵育60 min, 加入IAA至終濃度為40 mmol/L,室溫避光孵育60 min。加入乙醇至終濃度約為70%沉淀蛋白,10000 r/min離心20 min,棄去上清液, 用70%乙醇洗滌沉淀2次,將洗滌后的蛋白質(zhì)溶于含2mol/L尿素的50 mmol/L NH4HCO3溶液中,加入3 μg的胰蛋白酶(50 ∶ 1~100 ∶ 1),37 ℃酶解過夜,得蜈蚣蛋白質(zhì)直接酶解液。

    2.3.2 SDSPAGE及膠內(nèi)酶解

    蜈蚣總提取液經(jīng)考馬斯亮藍測定濃度后加入樣品溶解液,煮沸5 min后上樣到配好的凝膠(分離膠濃度12%,濃縮膠5%),10 mV電泳,溴酚藍距凝膠邊緣約5 mm時,停止電泳。硝酸銀染色后,依此經(jīng)過切膠、浸洗、蛋白質(zhì)降解、烷基化、胰酶酶解、多肽抽提,得蜈蚣蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解液。

    2.4 NanoLCMS/MS分析

    膠內(nèi)及直接酶解液12000 r/min離心后取上清液,ZipTip脫鹽,經(jīng)離心濃縮儀干燥后,0.1%甲酸溶液復(fù)溶,高速離心后取上清液注入nanoLCMS/MS儀器分析。

    液相為EksigentekspertTM NanoLC液相系統(tǒng),色譜條件為:Chrom XPC18毛細管柱(350 μm×0.5 mm, 3 μm);流動相A:2%乙腈(0.1%甲酸),B:98%乙腈(0.1%甲酸);流速300 nL/min,自動進樣,上樣8 μL。梯度洗脫條件為: 0~54 min,5%~25%B;54~75 min,25%~55%B;75~77 min,55%~80%B;77~83 min,80% B;83~90 min,80%~5%B,分析時間90 min。

    摘 要 結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳和納升級反相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(nanoRPLCMS/MS)法系統(tǒng)分析了蜈蚣提取蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解和直接酶解產(chǎn)物,并進行數(shù)據(jù)庫檢索鑒定蛋白質(zhì)。建立的nanoLC分析條件為:上樣8 μL, 經(jīng)Chrom XPC18毛細管柱(350 μm×0.5 mm,3 μm),2%乙腈(0.1%甲酸)98%乙腈(0.1%甲酸)梯度洗脫90 min;采用ESIQTOF MS,并在IDA采集模式下分析鑒定蜈蚣提取蛋白質(zhì)。膠內(nèi)酶解鑒定到 72 種蛋白質(zhì),直接酶解鑒定到 97 種蛋白質(zhì),二者含26種相同的蛋白質(zhì)。通過數(shù)據(jù)庫比對,分析了蜈蚣提取蛋白質(zhì)的生物進程、細胞組分以及功能活性。得到蜈蚣蛋白質(zhì)具有結(jié)合、酶催化、肌動等功能活性,其中結(jié)合活性的蛋白質(zhì)占的比例較大,且多為能量代謝進程中的相關(guān)酶類。

    關(guān)鍵詞 納升級反相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜; 蜈蚣; 蛋白質(zhì); 聚丙烯酰胺凝膠電泳

    1 引 言

    蜈蚣為節(jié)肢動物門唇足綱整形目蜈蚣科動物少棘巨蜈蚣(Scolopendrasubspinipes.mutilans L. Koch)的干燥體 [1 ],具有息風(fēng)鎮(zhèn)痙、通絡(luò)止痛、攻毒散結(jié)等功效,已廣泛用于臨床疾病的治療。蜈蚣主要含有蛋白質(zhì)、脂肪酸、氨基酸、總脂、微量元素等 [2~4 ],且蛋白質(zhì)為其主要成分,占總成分的50%~70%。藥理研究表明其具有抗腫瘤 [5,6 ]、抗凝血 [7,8 ]、抗驚厥 [9 ]、抗菌 [10 ]等活性。蜈蚣蛋白的研究較少,Zhao等 [11 ]從蜈蚣中分離純化得到一種具有抗腫瘤和免疫活性的多糖蛋白復(fù)合物,Kong等 [12 ]從蜈蚣中提取分離出一種多肽,藥理實驗顯示具有抗血栓活性。但目前尚缺少對蜈蚣蛋白質(zhì)的系統(tǒng)分析方法。本研究首次引入蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法,建立了高靈敏、高通量的納升級反相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法,結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳對蜈蚣提取蛋白質(zhì)的膠內(nèi)酶解和直接酶解產(chǎn)物進行分析,并對鑒別到的蛋白質(zhì)的生物進程、細胞組分及功能活性進行分析,較系統(tǒng)地研究了蜈蚣提取蛋白質(zhì),為蜈蚣蛋白質(zhì)的研究提供了新方法。

    2 實驗部分

    2.1 儀器、試劑與材料

    納升級液相色譜系統(tǒng):EksigentekspertTM nanoLC液相系統(tǒng),Eksigent software V.3.12液相工作站;高分辨質(zhì)譜系統(tǒng):TripleTOFTM5600,配有電噴霧離子源(ESI)、Analyst TF 1.6色譜工作站、Peak View 1.2質(zhì)譜分析軟件和ProteinPilot 4.5蛋白質(zhì)分析軟件(美國AB Sciex公司)。垂直凝膠電泳儀(美國Biorad公司);離心濃縮儀(美國Labconco公司);ZipTipC18 Pipette Tips(美國Millipore公司)。

    十二烷基磺酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DTT)、尿素(UREA)購于Biosharpp公司;碘乙酰胺(IAA,Aladdin公司);胰蛋白酶(Trypsin,Promega質(zhì)譜測序級)。乙腈、甲醇、甲酸等質(zhì)譜用試劑均為質(zhì)譜級(德國Merck公司)。

    蜈蚣購于江蘇省萬生中藥飲片有限公司,產(chǎn)地湖北(批號111001),經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室陳建偉教授鑒定為少棘巨蜈蚣(Scolopendrasubspinipesmutilans L. Koch)的干燥體。

    2.2 蜈蚣總蛋白的提取

    蜈蚣藥材粉碎后,取粗粉20 mg,加入裂解緩沖溶液(2% SDS,20 mmol/L DTT, 50 mmol/L PBS pH 7.8) 2 mL,65 ℃水浴中孵育過夜。10000 r/min離心20 min,上清液加入乙醇, 使乙醇終濃度為70%,沉淀蛋白。離心后,取沉淀用70%乙醇洗滌2次,沉淀經(jīng)離心濃縮干燥,

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    2.3 蜈蚣蛋白質(zhì)酶解

    2.3.1 直接酶解

    取蜈蚣蛋白約200 μg,加2%SDS,20 mmol/L DTT,50 mmol/L PBS溶液125 μL, 37 ℃孵育60 min, 加入IAA至終濃度為40 mmol/L,室溫避光孵育60 min。加入乙醇至終濃度約為70%沉淀蛋白,10000 r/min離心20 min,棄去上清液, 用70%乙醇洗滌沉淀2次,將洗滌后的蛋白質(zhì)溶于含2mol/L尿素的50 mmol/L NH4HCO3溶液中,加入3 μg的胰蛋白酶(50 ∶ 1~100 ∶ 1),37 ℃酶解過夜,得蜈蚣蛋白質(zhì)直接酶解液。

    2.3.2 SDSPAGE及膠內(nèi)酶解

    蜈蚣總提取液經(jīng)考馬斯亮藍測定濃度后加入樣品溶解液,煮沸5 min后上樣到配好的凝膠(分離膠濃度12%,濃縮膠5%),10 mV電泳,溴酚藍距凝膠邊緣約5 mm時,停止電泳。硝酸銀染色后,依此經(jīng)過切膠、浸洗、蛋白質(zhì)降解、烷基化、胰酶酶解、多肽抽提,得蜈蚣蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解液。

    2.4 NanoLCMS/MS分析

    膠內(nèi)及直接酶解液12000 r/min離心后取上清液,ZipTip脫鹽,經(jīng)離心濃縮儀干燥后,0.1%甲酸溶液復(fù)溶,高速離心后取上清液注入nanoLCMS/MS儀器分析。

    液相為EksigentekspertTM NanoLC液相系統(tǒng),色譜條件為:Chrom XPC18毛細管柱(350 μm×0.5 mm, 3 μm);流動相A:2%乙腈(0.1%甲酸),B:98%乙腈(0.1%甲酸);流速300 nL/min,自動進樣,上樣8 μL。梯度洗脫條件為: 0~54 min,5%~25%B;54~75 min,25%~55%B;75~77 min,55%~80%B;77~83 min,80% B;83~90 min,80%~5%B,分析時間90 min。

    摘 要 結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳和納升級反相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(nanoRPLCMS/MS)法系統(tǒng)分析了蜈蚣提取蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解和直接酶解產(chǎn)物,并進行數(shù)據(jù)庫檢索鑒定蛋白質(zhì)。建立的nanoLC分析條件為:上樣8 μL, 經(jīng)Chrom XPC18毛細管柱(350 μm×0.5 mm,3 μm),2%乙腈(0.1%甲酸)98%乙腈(0.1%甲酸)梯度洗脫90 min;采用ESIQTOF MS,并在IDA采集模式下分析鑒定蜈蚣提取蛋白質(zhì)。膠內(nèi)酶解鑒定到 72 種蛋白質(zhì),直接酶解鑒定到 97 種蛋白質(zhì),二者含26種相同的蛋白質(zhì)。通過數(shù)據(jù)庫比對,分析了蜈蚣提取蛋白質(zhì)的生物進程、細胞組分以及功能活性。得到蜈蚣蛋白質(zhì)具有結(jié)合、酶催化、肌動等功能活性,其中結(jié)合活性的蛋白質(zhì)占的比例較大,且多為能量代謝進程中的相關(guān)酶類。

    關(guān)鍵詞 納升級反相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜; 蜈蚣; 蛋白質(zhì); 聚丙烯酰胺凝膠電泳

    1 引 言

    蜈蚣為節(jié)肢動物門唇足綱整形目蜈蚣科動物少棘巨蜈蚣(Scolopendrasubspinipes.mutilans L. Koch)的干燥體 [1 ],具有息風(fēng)鎮(zhèn)痙、通絡(luò)止痛、攻毒散結(jié)等功效,已廣泛用于臨床疾病的治療。蜈蚣主要含有蛋白質(zhì)、脂肪酸、氨基酸、總脂、微量元素等 [2~4 ],且蛋白質(zhì)為其主要成分,占總成分的50%~70%。藥理研究表明其具有抗腫瘤 [5,6 ]、抗凝血 [7,8 ]、抗驚厥 [9 ]、抗菌 [10 ]等活性。蜈蚣蛋白的研究較少,Zhao等 [11 ]從蜈蚣中分離純化得到一種具有抗腫瘤和免疫活性的多糖蛋白復(fù)合物,Kong等 [12 ]從蜈蚣中提取分離出一種多肽,藥理實驗顯示具有抗血栓活性。但目前尚缺少對蜈蚣蛋白質(zhì)的系統(tǒng)分析方法。本研究首次引入蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法,建立了高靈敏、高通量的納升級反相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法,結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳對蜈蚣提取蛋白質(zhì)的膠內(nèi)酶解和直接酶解產(chǎn)物進行分析,并對鑒別到的蛋白質(zhì)的生物進程、細胞組分及功能活性進行分析,較系統(tǒng)地研究了蜈蚣提取蛋白質(zhì),為蜈蚣蛋白質(zhì)的研究提供了新方法。

    2 實驗部分

    2.1 儀器、試劑與材料

    納升級液相色譜系統(tǒng):EksigentekspertTM nanoLC液相系統(tǒng),Eksigent software V.3.12液相工作站;高分辨質(zhì)譜系統(tǒng):TripleTOFTM5600,配有電噴霧離子源(ESI)、Analyst TF 1.6色譜工作站、Peak View 1.2質(zhì)譜分析軟件和ProteinPilot 4.5蛋白質(zhì)分析軟件(美國AB Sciex公司)。垂直凝膠電泳儀(美國Biorad公司);離心濃縮儀(美國Labconco公司);ZipTipC18 Pipette Tips(美國Millipore公司)。

    十二烷基磺酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DTT)、尿素(UREA)購于Biosharpp公司;碘乙酰胺(IAA,Aladdin公司);胰蛋白酶(Trypsin,Promega質(zhì)譜測序級)。乙腈、甲醇、甲酸等質(zhì)譜用試劑均為質(zhì)譜級(德國Merck公司)。

    蜈蚣購于江蘇省萬生中藥飲片有限公司,產(chǎn)地湖北(批號111001),經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室陳建偉教授鑒定為少棘巨蜈蚣(Scolopendrasubspinipesmutilans L. Koch)的干燥體。

    2.2 蜈蚣總蛋白的提取

    蜈蚣藥材粉碎后,取粗粉20 mg,加入裂解緩沖溶液(2% SDS,20 mmol/L DTT, 50 mmol/L PBS pH 7.8) 2 mL,65 ℃水浴中孵育過夜。10000 r/min離心20 min,上清液加入乙醇, 使乙醇終濃度為70%,沉淀蛋白。離心后,取沉淀用70%乙醇洗滌2次,沉淀經(jīng)離心濃縮干燥,

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    2.3 蜈蚣蛋白質(zhì)酶解

    2.3.1 直接酶解

    取蜈蚣蛋白約200 μg,加2%SDS,20 mmol/L DTT,50 mmol/L PBS溶液125 μL, 37 ℃孵育60 min, 加入IAA至終濃度為40 mmol/L,室溫避光孵育60 min。加入乙醇至終濃度約為70%沉淀蛋白,10000 r/min離心20 min,棄去上清液, 用70%乙醇洗滌沉淀2次,將洗滌后的蛋白質(zhì)溶于含2mol/L尿素的50 mmol/L NH4HCO3溶液中,加入3 μg的胰蛋白酶(50 ∶ 1~100 ∶ 1),37 ℃酶解過夜,得蜈蚣蛋白質(zhì)直接酶解液。

    2.3.2 SDSPAGE及膠內(nèi)酶解

    蜈蚣總提取液經(jīng)考馬斯亮藍測定濃度后加入樣品溶解液,煮沸5 min后上樣到配好的凝膠(分離膠濃度12%,濃縮膠5%),10 mV電泳,溴酚藍距凝膠邊緣約5 mm時,停止電泳。硝酸銀染色后,依此經(jīng)過切膠、浸洗、蛋白質(zhì)降解、烷基化、胰酶酶解、多肽抽提,得蜈蚣蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解液。

    2.4 NanoLCMS/MS分析

    膠內(nèi)及直接酶解液12000 r/min離心后取上清液,ZipTip脫鹽,經(jīng)離心濃縮儀干燥后,0.1%甲酸溶液復(fù)溶,高速離心后取上清液注入nanoLCMS/MS儀器分析。

    液相為EksigentekspertTM NanoLC液相系統(tǒng),色譜條件為:Chrom XPC18毛細管柱(350 μm×0.5 mm, 3 μm);流動相A:2%乙腈(0.1%甲酸),B:98%乙腈(0.1%甲酸);流速300 nL/min,自動進樣,上樣8 μL。梯度洗脫條件為: 0~54 min,5%~25%B;54~75 min,25%~55%B;75~77 min,55%~80%B;77~83 min,80% B;83~90 min,80%~5%B,分析時間90 min。

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