高效液相色譜柱后同位素稀釋質(zhì)譜法定量分析人血清中轉鐵蛋白及白蛋白

張丹　馮流星　王軍　熊金平

摘要 建立了高效液相色譜（HPLC）與電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICPMS）聯(lián)用，同時結合柱后同位素稀釋法，通過直接測定硫及鐵元素，實現(xiàn)蛋白質(zhì)絕對定量的分析方法。選取分子量不同的4種標準蛋白：轉鐵蛋白、β乳球蛋白、肌紅蛋白和溶菌酶作為混合蛋白，34S或54Fe同位素稀釋劑與液相色譜洗脫液經(jīng)三通混合后，在線進入ICPMS檢測。根據(jù)同位素稀釋法公式及蛋白中硫、鐵的含量計算混合蛋白中每種蛋白的濃度，與天平稱量結果一致，對方法進行了驗證。將方法應用到人血清轉鐵蛋白、白蛋白的定量分析，針對兩種蛋白含量差別大導致的信號差異，通過改變同位素稀釋劑的流速，成功測定了人血清中轉鐵蛋白、白蛋白的含量。采用34S及54Fe同位素稀釋劑分別定量的血清中轉鐵蛋白濃度為（2.35±0.01）g/L和（2.22±0.13）g/L，結果基本吻合。方法精密度RSD均小于10%，可用于基體樣品中含硫蛋白及金屬蛋白的定量分析。

關鍵詞 同位素稀釋； 蛋白質(zhì)定量； 電感耦合等離子體質(zhì)譜； 轉鐵蛋白； 白蛋白

1引言

蛋白質(zhì)組學的快速發(fā)展，不但需要準確鑒定蛋白質(zhì)，還要求對處于動態(tài)變化的蛋白質(zhì)進行定量分析[1～4]。目前比較成熟的定量方法多是基于穩(wěn)定同位素標記的生物質(zhì)譜[5，6]，但是生物質(zhì)譜的信號響應與蛋白質(zhì)或肽段含量間的關系十分復雜，沒有蛋白質(zhì)標準作歸一化處理，很難對蛋白質(zhì)或肽段定量。與生物質(zhì)譜不同，電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICPMS）分析中元素的響應與原子所處的分子環(huán)境無關[7]，而且樣品處理簡單，易于色譜聯(lián)用，可進行同位素分析[8]。因此，利用ICPMS對蛋白質(zhì)中的元素定量分析，是近年來蛋白質(zhì)定量技術研究的熱點。硫是最適合作為蛋白質(zhì)定量分析的元素[9]。根據(jù)SwissProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的統(tǒng)計分析，分別有96.6%、98.8%的蛋白質(zhì)含有半胱氨酸、甲硫氨酸等含硫氨基酸[10]。如果蛋白質(zhì)的氨基酸序列已知，就能確定其中的硫原子數(shù)；那么通過ICPMS測定硫的含量來實現(xiàn)蛋白質(zhì)的定量是完全可行的[11]。但是，目前ICPMS直接測定硫來定量的蛋白，主要是標準蛋白，涉及基體樣品的很少，因為ICPMS測量硫存在一些困難：需使用碰撞池技術或高分辨ICPMS克服O+2對硫的譜線干擾[12]。常見的ICPMS對蛋白質(zhì)定量研究集中在金屬蛋白上[13，14]，定量原理與含硫蛋白相同。

為保證定量分析的準確度，需使用與待測蛋白匹配的標準物質(zhì)來保障質(zhì)控與量傳，但由于蛋白質(zhì)種類繁多、結構復雜，目前可獲得的蛋白標準十分匱乏。同位素稀釋法（ID）是國際公認的具有權威性化學計量方法，只需硫或金屬的濃縮同位素即可實現(xiàn)不同基體蛋白的定量分析[15]。

高效液相色譜（HPLC）的同位素稀釋法分為特異性、非特異性形態(tài)[16]。前者在前處理時就將稀釋劑加入到樣品中，具有傳統(tǒng)同位素稀釋法的優(yōu)點；但是必須開發(fā)針對目標蛋白的特異性稀釋劑制備方法，目前商品化或人工合成的稀釋劑非常有限，直到2005年才有文獻報道第一次應用到蛋白質(zhì)的定量分析[17]。而非特異性形態(tài)同位素稀釋（也稱柱后同位素稀釋）對蛋白質(zhì)的種類、結構沒有要求，同位素稀釋劑常為某元素的簡單離子，基本都有商品化的產(chǎn)品，適合于蛋白質(zhì)的定量分析。

目前，文獻報道了高效液相色譜柱后同位素稀釋質(zhì)譜法（HPLCIDICPMS）， 通過測硫定量標準蛋白[11]和測鐵定量轉鐵蛋白[14]，但是未見對硫、鐵共同定量蛋白的比較及人血清中多種蛋白的定量。本研究采用液相色譜分離混合蛋白，ICPMS測硫、鐵分別定量的標準蛋白結果與天平稱量結果比較，驗證了HPLCIDICPMS方法，并對硫、鐵定量分析進行比較。在此基礎上，將方法應用到人血清中轉鐵蛋白、白蛋白的定量分析，測定了血清中兩種蛋白的含量。本方法體系可應用在食品安全、環(huán)境監(jiān)測、臨床檢驗的化學計量、相關實驗室認證等生命科學研究的重要領域，促進我國生命科學測量水平的不斷提高和測量溯源性研究的深入發(fā)展。

2實驗部分

2.1儀器、試劑與樣品

Element 2扇形磁場電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國ThermoFisher Scientific公司）；高效液相色譜系統(tǒng)（日本Shimadzu公司）：含LC30AD泵、LC20AD泵、SIL30AC自動進樣器、CTO20A柱溫箱、SPD20A紫外檢測器；Toledo型電子天平（瑞士Mettler公司）；MillQ超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；TSKGel G3000SWxl凝膠柱（300 mm×7.8 mm，日本Tosoh公司）；Shodex QA825 IEC色譜柱（75 mm×8.0 mm， 日本Shodex公司）

Tris、人血清轉鐵蛋白Transferrin（Tf，75.2 kDa，每分子含47個S原子）、白蛋白Albumin（Alb，66.4 kDa，含41個S原子）、牛β乳球蛋白Lactoglobulin（Lacb，18.36 kDa，含9個S原子）、雞溶菌酶Lysozyme（Lys，14.31 kDa，含12個S原子），均購自Sigma公司；甲酸銨、乙酸銨，購于Fisher Scientific公司；馬心肌紅蛋白Myoglobin（Myo，16.95 kDa，含3個S原子）、人血清樣品來自中國計量科學研究院；其它試劑均為國產(chǎn)分析純；實驗用水為超純水（18.2 MΩ·cm）。

4種標準蛋白Tf， Lacb， Myo和 Lys用天平準確稱量后混合，溶于超純水中備用；人血清樣品不經(jīng)任何處理，直接進入液相色譜進行分析。

34S濃縮同位素（美國橡樹嶺實驗室）：同位素32S/34S豐度比為0.01417；54Fe濃縮同位素（中國計量科學研究院）：同位素56Fe/54Fe豐度比為0.11313。

2.2電感耦合等離子體質(zhì)譜儀條件

儀器工作參數(shù)為：功率 1300 W，樣品氣流速1.05 L/min，輔助氣流速0.87 L/min，冷卻氣流速16.0 L/min， 分辨率（m/Δm） 4000；掃描次數(shù) 700×1。

2.3高效液相色譜分離條件

2.3.1尺寸排阻色譜（SEC）分離混合標準蛋白尺寸排阻液相色譜常用的流動相中高濃度鹽（如NaCl等）在質(zhì)譜錐上的堆積會影響ICPMS測量；文獻[18]研究發(fā)現(xiàn)，0.2 mol/L乙酸銨作為流動相時既能保證分離效果，又不會引入高濃度鹽；而且質(zhì)譜連續(xù)工作8 h，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的碳堆積。本實驗所用的流動相為0.1 mol/L 乙酸銨溶液，流速為0.4 mL/min， 紫外檢測器波長280 nm，分析時間40 min，等度洗脫。

2.3.2陰離子交換色譜（IEC）分離人血清由于轉鐵蛋白與白蛋白分子量接近，尺寸排阻色譜柱分離人血清時，兩者的保留時間重合，不能達到分離效果，因此采用陰離子交換柱Shodex QA825 IEC分離人血清。液相分離條件為 A相： 0.02 mol/L TrisHCl（pH 8.6）； B相： A+0.5 mol/L甲酸銨溶液，流速為0.7 mL/min， 時間程序： 0～30 min， 0～100% B； 梯度洗脫。 紫外檢測器波長為280 nm。

2.4HPLCIDICPMS分析

柱后同位素稀釋時，稀釋劑通過島津液相系統(tǒng)自帶的LC20AD泵加入，與液相色譜的洗脫液經(jīng)過三通混合后在線進入ICPMS檢測。液相色譜實現(xiàn)混合蛋白分離，ICPMS檢測對蛋白定量分析。

質(zhì)譜得到的同位素比值譜圖，根據(jù)同位素稀釋公式（1），轉化為元素的質(zhì)量流（Mass flow）譜圖。積分質(zhì)量流譜圖中的峰面積可得到相應蛋白中該元素的絕對含量，依據(jù)液相進樣體積及蛋白所含元素個數(shù)，就可計算出蛋白的絕對濃度。

MFs=cspdspfspMsMspAbspAbs（Rm-Rsp）（Rs-Rm）（1）

式中， csp， dsp和fsp分別代表同位素稀釋劑的濃度（ng/g）、密度（g/mL）和流速（mL/min）； Ms和Msp分別表示樣品和稀釋劑中元素的原子量； Abs和Absp分別表示樣品和稀釋劑中核素b的豐度； Rm， Rsp和Rs分別表示混合樣品、稀釋劑和樣品中核素a與核素b的豐度比。

血清中目標蛋白的正常含量范圍不同：轉鐵蛋白2.35～3.00 g/L，白蛋白35～50 g/L；導致兩種蛋白中硫含量差別很大，為保證Rm比值合適，采用改變稀釋劑流速的方法，在液相時間程序的前15 min（轉鐵蛋白出峰部分），34S同位素稀釋劑的流速為0.03 mL/min；之后白蛋白出峰時間段，流速提高到0.2 mL/min。[TS（][HT5”SS]圖14種混合標準蛋白的液相色譜圖

Fig.1Liquid chromatogram of mixed standard proteins[HT5][TS）]

3結果與討論

3.1含硫標準蛋白的絕對定量

尺寸排阻液相色譜分離4種混合標準蛋白（Tf， Lacb， Myo和Lys）的譜圖如圖1所示， 4種蛋白按照分子量大小依次被洗脫出來，Tf， Lacb， Myo和Lys在紫外檢測器檢測的保留時間分別為21.9， 23.9， 26.3和29.9 min。

2.3高效液相色譜分離條件

2.3.1尺寸排阻色譜（SEC）分離混合標準蛋白尺寸排阻液相色譜常用的流動相中高濃度鹽（如NaCl等）在質(zhì)譜錐上的堆積會影響ICPMS測量；文獻[18]研究發(fā)現(xiàn)，0.2 mol/L乙酸銨作為流動相時既能保證分離效果，又不會引入高濃度鹽；而且質(zhì)譜連續(xù)工作8 h，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的碳堆積。本實驗所用的流動相為0.1 mol/L 乙酸銨溶液，流速為0.4 mL/min， 紫外檢測器波長280 nm，分析時間40 min，等度洗脫。

2.3.2陰離子交換色譜（IEC）分離人血清由于轉鐵蛋白與白蛋白分子量接近，尺寸排阻色譜柱分離人血清時，兩者的保留時間重合，不能達到分離效果，因此采用陰離子交換柱Shodex QA825 IEC分離人血清。液相分離條件為 A相： 0.02 mol/L TrisHCl（pH 8.6）； B相： A+0.5 mol/L甲酸銨溶液，流速為0.7 mL/min， 時間程序： 0～30 min， 0～100% B； 梯度洗脫。 紫外檢測器波長為280 nm。

2.4HPLCIDICPMS分析

柱后同位素稀釋時，稀釋劑通過島津液相系統(tǒng)自帶的LC20AD泵加入，與液相色譜的洗脫液經(jīng)過三通混合后在線進入ICPMS檢測。液相色譜實現(xiàn)混合蛋白分離，ICPMS檢測對蛋白定量分析。

質(zhì)譜得到的同位素比值譜圖，根據(jù)同位素稀釋公式（1），轉化為元素的質(zhì)量流（Mass flow）譜圖。積分質(zhì)量流譜圖中的峰面積可得到相應蛋白中該元素的絕對含量，依據(jù)液相進樣體積及蛋白所含元素個數(shù)，就可計算出蛋白的絕對濃度。

MFs=cspdspfspMsMspAbspAbs（Rm-Rsp）（Rs-Rm）（1）

式中， csp， dsp和fsp分別代表同位素稀釋劑的濃度（ng/g）、密度（g/mL）和流速（mL/min）； Ms和Msp分別表示樣品和稀釋劑中元素的原子量； Abs和Absp分別表示樣品和稀釋劑中核素b的豐度； Rm， Rsp和Rs分別表示混合樣品、稀釋劑和樣品中核素a與核素b的豐度比。

血清中目標蛋白的正常含量范圍不同：轉鐵蛋白2.35～3.00 g/L，白蛋白35～50 g/L；導致兩種蛋白中硫含量差別很大，為保證Rm比值合適，采用改變稀釋劑流速的方法，在液相時間程序的前15 min（轉鐵蛋白出峰部分），34S同位素稀釋劑的流速為0.03 mL/min；之后白蛋白出峰時間段，流速提高到0.2 mL/min。[TS（][HT5”SS]圖14種混合標準蛋白的液相色譜圖

Fig.1Liquid chromatogram of mixed standard proteins[HT5][TS）]

3結果與討論

3.1含硫標準蛋白的絕對定量

尺寸排阻液相色譜分離4種混合標準蛋白（Tf， Lacb， Myo和Lys）的譜圖如圖1所示， 4種蛋白按照分子量大小依次被洗脫出來，Tf， Lacb， Myo和Lys在紫外檢測器檢測的保留時間分別為21.9， 23.9， 26.3和29.9 min。

2.3高效液相色譜分離條件

2.3.1尺寸排阻色譜（SEC）分離混合標準蛋白尺寸排阻液相色譜常用的流動相中高濃度鹽（如NaCl等）在質(zhì)譜錐上的堆積會影響ICPMS測量；文獻[18]研究發(fā)現(xiàn)，0.2 mol/L乙酸銨作為流動相時既能保證分離效果，又不會引入高濃度鹽；而且質(zhì)譜連續(xù)工作8 h，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的碳堆積。本實驗所用的流動相為0.1 mol/L 乙酸銨溶液，流速為0.4 mL/min， 紫外檢測器波長280 nm，分析時間40 min，等度洗脫。

2.3.2陰離子交換色譜（IEC）分離人血清由于轉鐵蛋白與白蛋白分子量接近，尺寸排阻色譜柱分離人血清時，兩者的保留時間重合，不能達到分離效果，因此采用陰離子交換柱Shodex QA825 IEC分離人血清。液相分離條件為 A相： 0.02 mol/L TrisHCl（pH 8.6）； B相： A+0.5 mol/L甲酸銨溶液，流速為0.7 mL/min， 時間程序： 0～30 min， 0～100% B； 梯度洗脫。 紫外檢測器波長為280 nm。

2.4HPLCIDICPMS分析

柱后同位素稀釋時，稀釋劑通過島津液相系統(tǒng)自帶的LC20AD泵加入，與液相色譜的洗脫液經(jīng)過三通混合后在線進入ICPMS檢測。液相色譜實現(xiàn)混合蛋白分離，ICPMS檢測對蛋白定量分析。

質(zhì)譜得到的同位素比值譜圖，根據(jù)同位素稀釋公式（1），轉化為元素的質(zhì)量流（Mass flow）譜圖。積分質(zhì)量流譜圖中的峰面積可得到相應蛋白中該元素的絕對含量，依據(jù)液相進樣體積及蛋白所含元素個數(shù)，就可計算出蛋白的絕對濃度。

MFs=cspdspfspMsMspAbspAbs（Rm-Rsp）（Rs-Rm）（1）

式中， csp， dsp和fsp分別代表同位素稀釋劑的濃度（ng/g）、密度（g/mL）和流速（mL/min）； Ms和Msp分別表示樣品和稀釋劑中元素的原子量； Abs和Absp分別表示樣品和稀釋劑中核素b的豐度； Rm， Rsp和Rs分別表示混合樣品、稀釋劑和樣品中核素a與核素b的豐度比。

血清中目標蛋白的正常含量范圍不同：轉鐵蛋白2.35～3.00 g/L，白蛋白35～50 g/L；導致兩種蛋白中硫含量差別很大，為保證Rm比值合適，采用改變稀釋劑流速的方法，在液相時間程序的前15 min（轉鐵蛋白出峰部分），34S同位素稀釋劑的流速為0.03 mL/min；之后白蛋白出峰時間段，流速提高到0.2 mL/min。[TS（][HT5”SS]圖14種混合標準蛋白的液相色譜圖

Fig.1Liquid chromatogram of mixed standard proteins[HT5][TS）]

3結果與討論

3.1含硫標準蛋白的絕對定量

尺寸排阻液相色譜分離4種混合標準蛋白（Tf， Lacb， Myo和Lys）的譜圖如圖1所示， 4種蛋白按照分子量大小依次被洗脫出來，Tf， Lacb， Myo和Lys在紫外檢測器檢測的保留時間分別為21.9， 23.9， 26.3和29.9 min。