酶解鳙魚魚肉蛋白制備ACE抑制肽工藝參數(shù)優(yōu)化

袁曉晴，孫耀軍，劉紅梅

（河南牧業(yè)經(jīng)濟學院食品系，河南鄭州 450044）

酶解鳙魚魚肉蛋白制備ACE抑制肽工藝參數(shù)優(yōu)化

袁曉晴，孫耀軍，劉紅梅

（河南牧業(yè)經(jīng)濟學院食品系，河南鄭州 450044）

采用堿性蛋白酶Alcalase 2.4L對鳙魚魚肉蛋白進行水解，制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制肽。以酶解物ACE抑制率為指標，先進行單因素實驗，確定底物濃度（[S]）、溫度、pH、酶用量及水解時間5個因素的最適水平范圍，再通過響應面分析法（RSM）對加酶量、溫度和水解時間3個酶解工藝參數(shù)進行優(yōu)化。結(jié)果表明：Alcalase水解鳙魚魚肉蛋白制備ACE抑制肽的最佳酶解條件為：[S]6%、加酶量2.2%、溫度57℃，pH9.0及水解時間6.4h，此條件下酶解物ACE抑制率理論值為81.77%，驗證實驗結(jié)果ACE抑制率為81.52%，與理論值相符合。

鳙魚，酶解工藝，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶，ACE抑制肽，Alcalase 2.4L

在我國的淡水養(yǎng)殖品種結(jié)構(gòu)中，四大家魚一直占據(jù)著主要的位置，而鳙魚（Aristichthys nobilis）又是四大家魚中養(yǎng)殖規(guī)模最大的品種[1]。由于鳙魚生長在池塘或湖泊中，泥土味重，肌肉口感差，活魚鮮銷附加值較低，而且由于一直以來消費者有偏愛吃鳙魚頭的習慣，造成魚身部分價格大跌。鳙魚中蛋白質(zhì)含量較高，氨基酸模式接近人體需要，是優(yōu)質(zhì)的動物蛋白資源，這就為鳙魚的高值化利用提供了前提。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶在人體血壓調(diào)節(jié)過程中起重要的生理作用。一方面，它使無活性的血管緊張素I轉(zhuǎn)化為升壓物質(zhì)——血管緊張素II，另一方面它能使降壓物質(zhì)——舒緩激肽分解成失活片段[2]，從而導致血壓升高。因此，通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）的活性可以起到降血壓的作用。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽又稱ACE抑制肽，是一類具有降血壓作用多肽的總稱。自1965年Ferreira[3]首次從巴西蝮蛇毒中分離出具有ACE抑制活性的多肽以來，研究人員又從大豆[4]、燕麥[5]、文蛤[6]、螺螄[7]、中國毛蝦[8]、玉米[9]等多種原料的酶解物中發(fā)現(xiàn)了具有降血壓活性的多肽。鳙魚魚肉蛋白加工利用的原料是巨大而豐富的，以鳙魚魚肉蛋白為原料制備ACE抑制肽將為鳙魚的利用提供新途徑，目前這方面的報道少見。本研究通過單因素實驗和響應面分析法優(yōu)化了堿性蛋白酶Alcalase酶解鳙魚魚肉制備ACE抑制肽的工藝條件，以期用較少量酶獲得具有較高ACE抑制活性的降壓肽，為鳙魚的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新 鮮 鳙 魚 市 售 ；堿 性 蛋 白 酶（Alcalase 2.4L，2.4AU/g） 購于Novo Nordisk公司；馬尿酸-組氨酸-亮氨酸（HHL）、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 購于Sigma；其他試劑 均為分析純。

SK7200LHC型超聲波清洗器 上海滬粵明科學儀器有限公司；90-2型定時恒溫磁力攪拌器 上海精科實業(yè)有限公司；UV-2102 PCS型紫外-可見分光光度計 美國Unico公司；HH-501超級恒溫水浴 蘇州江東精密儀器有限公司；TGL-16G型高速離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚肉脫脂 新鮮鳙魚，剖殺后，去頭尾、內(nèi)臟、鱗后，采肉，勻漿，置于燒杯中，加入98%的異丙醇（1∶2，w/v），置于75℃水浴下脫脂60min，期間間歇進行攪拌，使其盡可能充分脫脂。離心10min（4000r/min），棄去上清液，稱取沉淀重量；再加入與沉淀等重量的異丙醇，在75℃水浴下繼續(xù)脫脂60min，離心10min（4000r/min），棄去上清液，將沉淀真空抽氣至無味，將脫脂后魚肉作為酶解原料（BCMP）。

1.2.2 鳙魚魚肉蛋白的酶解 取一定量的脫脂鳙魚魚肉蛋白，加蒸餾水溶解，調(diào)pH至10，40℃下超聲波（80W）處理30min，并用高速分散機（11200r/min）分散三次，每次15s，之后按設(shè)定的條件進行酶解，酶解結(jié)束后95℃滅酶10min，冷卻后4200r/min離心15min，取上清液并凍干備用。

1.2.3 酶解單因素實驗 分別考察[S]、加酶量、溫度、pH和水解時間5個因素對鳙魚魚肉蛋白Alcalase酶解物ACE抑制率的影響。實驗中各考察因素的設(shè)定水平分別為：水解時間3、4、5、6、7h；[S]2%、4%、6%、8%、10%；溫度45、50、55、60、65、70℃；pH7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5；加酶量1%、1.5%、2%、2.5%、3%。除考察因素外，其他因素的條件為：[S]6%、加酶量2%、溫度60℃、pH9、水解時間6h。

1.2.4 響應面優(yōu)化酶解條件 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以加酶量、溫度和水解時間為因素，設(shè)計了三因素三水平的中心旋轉(zhuǎn)組合實驗，實驗因素的水平見表1。數(shù)據(jù)處理采用SAS統(tǒng)計軟件V8.1 RSREG（response surface regression）程序進行分析處理。

表1 RSA實驗因素水平表Table 1 Independent variables and levels of RSA

1.2.5 ACE抑制率測定 參照Cushman等[10]的方法，有所改進。取鳙魚魚肉蛋白酶解液100μL（0.3mg/mL），加入75μL的ACE（60mU/mL，用含有0.4mol/L NaCl的0.1mol/L、pH8.3硼酸緩沖液配制）。37℃恒溫水浴中保溫5min，然后加入150μL 0.005mol/L HHL溶液（用上述硼酸緩沖液配制），37℃恒溫保持30min，之后加入100μL 1.0mol/L HCl終止反應，得到反應液。同時用150μL上述硼酸緩沖液替代鳙魚魚肉蛋白酶解液來制備反應液，作為空白對照組。通過反相高效液相色譜洗脫圖譜定量馬尿酸的生成量。色譜條件：Diamonsil C18柱（5μm，250mm ×4.6mm），檢 測 波 長228nm，進樣量5μL，洗脫液：25%乙腈-75%超純水；流速0.6mL/min，柱溫30℃，ACE抑制活性按如下公式計算。

式中：A為空白對照組的馬尿酸峰面積；B為酶解液的馬尿酸峰面積。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果分析

2.1.1 水解時間的影響 由圖1可知，前6h酶解物ACE抑制率隨著時間的延長而增加，在第6h達到最大值72.39%。6h之后ACE抑制率呈下降的趨勢，這是由于在一定的時間內(nèi)，蛋白得到充分酶解，以小肽的形式存在并能較好地抑制ACE酶活性，當酶解時間進一步延長后，某些起抑制作用的小肽繼續(xù)被水解失去活性，因此酶解時間以6h為宜。

圖1 水解時間對酶解物ACE抑制率的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on ACE inhibitory rate of the hydrolysate

2.1.2 底物濃度[S]的影響 由圖2可知，隨著[S]的增加，酶解物ACE抑制率增強，并在濃度為6%時達到最大，之后當濃度繼續(xù)增加時，酶解物ACE抑制率反而有所下降。這可能是隨著底物濃度的增大，酶解液黏度增大，酶與底物濃度的結(jié)合機率降低，使酶促反應速度減慢[11-12]。因此底物濃度選定為6%較為合適。2.1.3 溫度的影響 由圖3可知，在60℃以前，隨著溫度的增加，酶解物ACE抑制率增強。60℃以后，ACE抑制率逐漸下降，這是因為溫度過高會導致堿性蛋白酶Alcalase自身分子結(jié)構(gòu)部分解體或蛋白酶變性，從而使酶活力降低。故反應溫度控制在60℃左右為宜。

2.1.4 pH的影響 由圖4可知，當反應液的pH由7.0增至9.0的過程中，酶解物抑制率隨著pH的增加不斷增強，但是當pH繼續(xù)增加至9.5時，酶解物的ACE抑制率反而下降。雖然較高的pH可提高魚肉蛋白的溶解度，但pH過高可能會影響魚肉蛋白的結(jié)構(gòu)。綜合先 前 的 研 究[13]和 單 因 素 實 驗 結(jié) 果 ，選 擇 pH9.0為 最適pH。

圖2 底物濃度對酶解物ACE抑制率的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on ACE inhibitory rate of the hydrolysate

圖3 溫度對酶解物ACE抑制率的影響Fig.3 Effect of temperature on ACE inhibitory rate of the hydrolysate

圖4 pH對酶解物ACE抑制率的影響Fig.4 Effect of pH on ACE inhibitory rate of the hydrolysate

2.1.5 加酶量的影響 由圖5可知，隨著Alcalase添加量從1%增加到2.5%，酶解物ACE抑制率不斷增強。當Alcalase添加量再遞增到3%時，酶解物ACE抑制率增加平緩。從節(jié)約成本的角度考慮，采用2%的添加量即可。

2.2 響應面優(yōu)化酶解工藝條件

2.2.1 響應面實驗設(shè)計與結(jié)果 在底物濃度和pH確定后，選 用加酶量（X1）、溫度（X2）、水解時 間（X3）為變量，開展三因素三水平的響應面實驗。本次酶解工藝優(yōu)化實驗即采取了中心旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計，實驗設(shè)計和結(jié)果見表2。整個實驗設(shè)計包括15個實驗點，實驗1～12是析因點，自變量取值在各因素所構(gòu)成的三維頂點，實驗13～15是零點，為區(qū)域的中心點，中心實驗重復3次，用以估計實驗誤差。

圖5 加酶量對酶解物ACE抑制率的影響Fig.5 Effect of enzyme dosage on ACE inhibitory rate of the hydrolysate

表2 RSA實驗結(jié)果Table 2 Experimental results of RSA

2.2.2 回歸模型的建立及方差分析 以ACE抑制率為響應值，經(jīng)回歸擬合，各實驗因子對響應值的影響可用以下回歸方程表示：

對該回歸方程進行方差分析及顯著性評價，結(jié)果見表3。由表3可知，此模型的p＜0.0001，表明響應面回歸模型達到極顯著水平，失擬項p值大于0.05，不顯著，表明該方程擬合三個參數(shù)與ACE抑制率之間的關(guān)系是可行的；而且較高的R2（0.9987），進一步證明實驗方程式與實際數(shù)據(jù)之間具有非常好的擬合性。

回歸方程系數(shù)的顯著性分析結(jié)果表明，加酶量、溫度和水解時間這三個變量均對ACE抑制率具有極顯著影響（p＜0.01），且影響效果大小排序為：溫度＞水解時間＞加酶量。這三個因素的二次項X12、X22、X33也對ACE抑制率有顯著性影響（p＜0.01）。在交互項中，X1X2項的回歸系數(shù)顯著（p＜0.05），說明加酶量與溫度的交互作用對ACE抑制率的影響顯著；X1X3項的回歸系數(shù)極顯著（p＜0.01），說明加酶量與水解時間的交互作用對ACE抑制率影響極顯著；X2X3項的回歸系數(shù)不顯著（p＞0.05），說明溫度與水解時間的交互作用對ACE抑制率影響不顯著。

表3 回歸模型方差分析及顯著性檢驗Table 3 Variance analysis and significance test of regression model

圖6為水解條件對ACE抑制率影響的響應面圖。由圖6可知，其作用都為上凸曲面，說明本實驗所選擇的區(qū)域范圍合理，并且隨著加酶量、水解時間和溫度的增加，酶解產(chǎn)物的ACE抑制率均呈現(xiàn)先升高后下降的變化，加酶量、水解時間和溫度對ACE抑制率的影響效果明顯。通過分析計算得到最佳酶解條件為：加酶量2.2%、溫度57℃，水解時間6.4h，此條件下ACE抑制率理論值為81.77%。

為檢驗響應面分析法的可靠性，采用上述優(yōu)化參數(shù)進行酶解實驗，實際測得酶解物ACE抑制率為81.52%，與理論預測值的相對誤差為0.3%，表明采用響應面分析法優(yōu)化得到的酶解工藝參數(shù)準確可靠，具有實用價值。

3 結(jié)論

主要研究了Alcalase酶解鳙魚魚肉蛋白制備具有ACE抑制活性酶解物的工藝條件。首先以酶解物ACE抑制率為指標，通過單因素實驗確定了[S]、溫度、pH、加酶量和水解時間5個因素的最適水平范圍。在底物濃度和pH確定后，又通過響應面分析法優(yōu)化了加酶量、溫度和水解時間3個因素。結(jié)果表明最佳酶解條件為：[S]6%、加酶量2.2%、溫度57℃，pH9.0、水解時間6.4h，此條件下ACE抑制率理論值為81.77%，驗證實驗結(jié)果ACE抑制率為81.52%，與理論值相符合。

圖6 水解條件對ACE抑制率影響的響應面立體圖Fig.6 Response plots showing the effect of hydrolysis conditions on the ACE inhibitory rate

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Optimization of hydrolysis process parameters for enzymatic preparation of angiotensin-converting enzyme（ACE） inhibition peptides from bighead carp muscle protein

YUAN Xiao-qing，SUN Yao-jun，LIU Hong-mei
（Department of Food，Henan University of Animal Husbandry and Economy，Zhengzhou 450044，China）

In order to prepare ACE inhibition peptides with high activity，Alcalase 2.4L was selected to hydrolyze bighead carp （ Aristichthys nobilis ） muscle protein （ BCMP ）.The single factor experiment was first used to determine the optimal levels of such five parameters as substrate concentration （[S]），temperature，pH，enzyme dosage and hydrolysis time based on the ACE inhibitory rate of hydrolyzed BCMP.Then response surface methodology （ RSM ） was applied to optimize such three parameters as enzyme dosage ， temperature and hydrolysis time.The optimal hydrolysis conditions were determined as follows： [S]6% ，enzyme dosage 2.2% ，temperature 57℃ ，pH9.0，hydrolysis time 6.4h.Under the hydrolysis conditions，the theoretical value of ACE inhibitory rate of BCMP hydrolysate was 81.77%.The inhibitory rate in the verification experiment was 81.52% ，which conformed to the theoretical value.

bighead carp；enzymatic hydrolysis process；angiotensin-converting enzyme；ACE inhibition peptides；Alcalase 2.4L

TS254.4

A

1002-0306（2014）20-0213-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.038

2014－01－06

袁曉晴（1977-），女，博士，副教授，研究方向：水產(chǎn)加工及功能性食品。