植物精油對(duì)杏干優(yōu)勢(shì)微生物的抑制效果研究

李亞茹，周林燕，李淑榮，*，曹珍珍，張 樂，2，魏 明，2，聶 瑩，唐選明

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002）

植物精油對(duì)杏干優(yōu)勢(shì)微生物的抑制效果研究

李亞茹1，周林燕1，李淑榮1，*，曹珍珍1，張 樂1，2，魏 明1，2，聶 瑩1，唐選明1

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002）

以新疆小白杏為實(shí)驗(yàn)材料，研究新疆小白杏杏干在儲(chǔ)藏期間微生物含量變化，通過分離、純化從杏干上得到3株優(yōu)勢(shì)霉菌，形態(tài)觀察初步鑒定為根霉菌、鏈格孢菌和青霉菌。選取9種植物精油對(duì)杏干上的混合菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，根據(jù)抑菌率篩選出3種抑菌活性較強(qiáng)的精油，并通過測(cè)定抑菌圈直徑和最低抑菌濃度（MIC）進(jìn)一步研究這3種精油對(duì)杏干上優(yōu)勢(shì)霉菌的抑菌活性。結(jié)果表明，9種植物精油對(duì)杏干上微生物均有一定的抑制作用，其中肉桂精油、月桂精油和茴香精油具有較強(qiáng)的抑菌性，且異味較小，對(duì)3種優(yōu)勢(shì)霉菌也有顯著的抑制作用，抑菌活性顯著優(yōu)于卡那霉素，抑菌效果依次為：肉桂精油＞月桂精油＞茴香精油，肉桂精油可以作為天然保鮮劑用于杏干制品，達(dá)到抑菌和延長(zhǎng)貨架期的目的。關(guān)鍵詞：植物精油，杏干，霉菌分離鑒定，抑菌活性

由于杏果的產(chǎn)季集中，且不耐儲(chǔ)藏、易腐爛、保鮮困難、不適合遠(yuǎn)距離運(yùn)輸，收獲后一般在產(chǎn)地直接加工成杏脯、杏干、杏包仁等適合長(zhǎng)期儲(chǔ)存的干果制品，其中杏干是其重要產(chǎn)品之一。長(zhǎng)期以來，果農(nóng)主要采用傳統(tǒng)露天暴曬的方式制干，極易受微生物、蟲、鳥和灰塵的污染，在儲(chǔ)藏過程中很容易發(fā)生霉變、生蟲卵等，導(dǎo)致杏干發(fā)生褐變、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值下降，市場(chǎng)價(jià)值降低[1]。為了改變杏干制品的商品性能，人們多采用傳統(tǒng)熏硫或在杏干表面大量噴撒硫磺粉等方式來護(hù)色防蟲，然而，熏硫后的杏干產(chǎn)品中有亞硫酸鹽殘留，對(duì)人體健康有一定的危害[2]。在國(guó)際貿(mào)易中，大量的杏干也因亞硫酸鹽超標(biāo)等問題被召回，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。

隨著人們生活水平提高，生活模式與消費(fèi)觀念的改變，人們對(duì)食品的要求已不僅僅滿足于傳統(tǒng)上的色、香、味，而更加關(guān)注食品安全和食品對(duì)健康的影 響 等 方 面[4]。 精 油（Essential oils）也 稱 為 揮 發(fā) 油（Volatile oils），是存在于植物體中的一類可隨水蒸汽蒸餾，在常溫下能揮發(fā)，且具有一定香味的揮發(fā)性油狀液體的總稱[5]。大量的研究表明[6-10]，植物精油對(duì)引起圣女果、葡萄、柑橘等果蔬腐敗的真菌如黃曲霉、白曲霉、黑根霉、擴(kuò)展青霉、鏈格孢菌等都有強(qiáng)烈的抑制作用，安全可靠，可以以直接接觸和熏蒸的方式應(yīng)用于果蔬的保鮮，植物精油是繼Nisin和殼聚糖后備受關(guān)注的天然植物殺菌劑。目前雖然國(guó)內(nèi)外關(guān)于植物精油抑菌性的研究較多，但植物精油對(duì)杏干上微生物的抑菌活性研究鮮為報(bào)道，而且關(guān)于杏干上優(yōu)勢(shì)微生物鑒定也尚未見報(bào)道。本文以杏干為研究對(duì)象，研究杏干上優(yōu)勢(shì)微生物，并通過研究植物精油對(duì)杏干上混合菌和優(yōu)勢(shì)微生物的抑菌效果，篩選效果較佳的抑菌劑，以期為植物精油在杏干上的應(yīng)用，延長(zhǎng)杏干貨架期提供科學(xué)的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

肉桂精油（Cinnanoumum zeylanicum，葉、樹皮，蒸餾提?。?、茴香精油（Foeniculum vulgare，果實(shí)，蒸餾提?。?、羅勒精油（Ocimum basilicum，葉、花，蒸餾提 ?。?、月 桂 精 油（Laurus nobilis，葉 、樹 皮 ，蒸 餾 提?。?、丁香精油（Eugenia caryophyllus，葉、花，蒸餾提取）、百 里 香 精 油（Thymus vulgaris，葉 、花 ，蒸 餾 提?。?、辣椒精油（Capsicum frutescens L，種籽，超臨界提?。⒋笏饩停ˋllium sativum，蒜頭，冷壓提?。┖兔?迭 香 精 油（Rosmarinus officinalis，葉 、花 ，蒸 餾 提?。?上海香匯有限公司，密封4℃冷藏保存；新疆小白杏杏干 由新疆農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所提供；營(yíng)養(yǎng)瓊脂（PCA）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）北京陸橋技術(shù)有限公司；乳酸苯酚棉蘭固定液（苯酚10g，乳酸10g，甘油20g，棉蘭0.05g，蒸餾水10mL，將苯酚置于水浴中加熱至結(jié)晶溶解，然后加入乳酸、甘油和棉蘭） 以上試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；卡那霉素Amresco公司；牛津杯 （內(nèi)徑 （6.0±0.1）mm，外徑（7.8±0.1）mm，高 （10.0±0.1）mm），培 養(yǎng) 皿 （內(nèi) 徑90mm，高16～17mm）；涂布棒，常用玻璃儀器。

JHL-SD-1500超凈工作臺(tái) 北京萊博特瑞科技有限公司；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；YXQ-LS-50A立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博田實(shí)業(yè)有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇榮華儀器制造有限公司；GZX-9076MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SK-1快速混勻器 金壇市白塔儀器廠；LW300LT生物顯微鏡 上海測(cè)維光電技術(shù)有限公司；1000μL移液槍 美國(guó)Rainin公司；20、200μL移液槍 大龍醫(yī)療設(shè)備（上海）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微生物的測(cè)定 儲(chǔ)藏期間杏干菌落總數(shù)和霉菌總數(shù)測(cè)定參照GB 4789.2-2010、GB 4789.15-2010執(zhí)行菌落總數(shù)。

1.2.2 杏干優(yōu)勢(shì)霉菌的分離、純化和初步鑒定[11-14]采用平板劃線法分離純化霉菌，將純化得到的霉菌進(jìn)行三點(diǎn)培養(yǎng)，并使用插片法，通過菌落形態(tài)的觀察和顯微特性的觀察，進(jìn)行初步鑒定。

1.2.3 植物精油對(duì)杏干混合菌的抑制效果的研究[15]

用培養(yǎng)基將精油稀釋成系列濃度，其濃度梯度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μg/mL，杏干菌落總數(shù)和霉菌總數(shù)培養(yǎng)及測(cè)定方法同1.2.1，以抑菌率評(píng)價(jià)精油的抑菌活性。

1.2.4 肉桂精油、月桂精油和茴香精油對(duì)杏干單一霉菌的抑制效果的研究[16]采用牛津杯法。按無菌操作的方式，培養(yǎng)皿中倒入15～20mL培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基冷卻凝固后，取200μg孢子懸液（孢子濃度為106cfu/mL）于培養(yǎng)基表面，用無菌涂布棒涂布均勻。然后在每個(gè)營(yíng)養(yǎng)平板中均勻放入3個(gè)滅菌后的牛津杯，在其中2個(gè)牛津杯上分別加入10μL精油，剩余1個(gè)加10μg無菌水作空白對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照加入10μL的卡那霉素（10mg/mL），將培養(yǎng)皿置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，十字交叉法測(cè)抑菌圈直徑，結(jié)果取平均值，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.5 最 小 抑 菌 濃 度 （ Minimal Inhibition Concentration，MIC）的測(cè)定[17]用PDA培養(yǎng)基將精油和卡那霉素稀釋成系列濃度，肉桂精油的濃度梯度為0.02～0.5μg/mL，月桂精油的濃度梯度為0.2～0.8μg/mL，茴香精油的濃度梯度為0.4～1.5μg/mL，卡那霉素的濃度梯度為12.5～1200μg/mL。向平板中加入1mL霉菌的孢子懸液（孢子濃度均為106cfu/mL），然后倒入15mL的加藥培養(yǎng)基，同時(shí)做空白對(duì)照，混勻，28℃培養(yǎng)48h，觀察菌種的生長(zhǎng)情況，以完全沒有菌生長(zhǎng)的最低濃度作為該精油的最小抑菌濃度。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Origin 7.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，經(jīng)SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 杏干儲(chǔ)藏期間微生物變化

杏干在儲(chǔ)藏期間菌落總數(shù)和霉菌總數(shù)變化如圖1所示。從圖1中可以看出，在儲(chǔ)藏過程中杏干上菌落總數(shù)沒有明顯變化，霉菌總數(shù)明顯增加，究其原因在于，引起新鮮杏果實(shí)病害主要是霉菌如：引起小白杏軟腐病的病原菌是白曲霉（Aspergillus niger）[18]，杏果實(shí)黑斑病病原菌是鏈格孢菌（Alternaria armeniacae）[19]等，而隨著杏干的曬制過程，霉菌被帶入到杏干產(chǎn)品中。杏干產(chǎn)品的水分含量≤25%，含糖量高、水分活度（Aw）較低[20]，多數(shù)細(xì)菌不適合在這種條件下的生長(zhǎng)，但霉菌卻可以生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致杏干霉變，食用品質(zhì)下降。

圖1 儲(chǔ)藏期間杏干的菌落總數(shù)和霉菌總數(shù)變化Fig.1 The change of bacterial and fungus in dried apricots during storage

2.2 杏干優(yōu)勢(shì)霉菌的分離、純化和初步鑒定

從杏干中分離出3種優(yōu)勢(shì)霉菌，對(duì)分離純化出的3種 霉 菌 采 用 棉蘭 染 色 法[21]進(jìn) 行 初步 鑒 定 ，結(jié) 果 如圖2所示。

圖2 杏干霉菌菌落形態(tài)和顯微形態(tài)（1000×）Fig.2 The colony form and microscopic morphology of fungus in dried apricots（1000×）

菌株A在PDA平板上，菌落較大，生長(zhǎng)迅速，初為白色，后變成黑色厚絨狀，菌絲絮狀叢生，無分隔，菌落正面呈現(xiàn)黑色，有黑色顆粒狀孢子囊，背面無色或中央略帶黃褐色，孢囊梗直立不分枝，無分隔，孢囊梗頂端著生膨大的孢子囊，孢子囊球形或橢圓形，黑褐色，分生孢子近球形，褐色。該菌初步鑒定為根霉屬霉菌。

菌株B菌落中等大小，成絨氈狀，菌落邊緣不整齊，菌絲較長(zhǎng)，初期為灰白色，逐漸長(zhǎng)滿平皿，最終轉(zhuǎn)為灰褐色至黑色，菌絲具隔膜，分生孢子梗多為單枝，長(zhǎng)短不一，頂生不分枝或偶爾分枝的孢子鏈，淡褐色，直或略彎曲，有分隔，磚隔狀分生孢子，大都呈倒棒狀或卵形，黃褐色至深褐色，具3～6個(gè)橫隔膜，0～3個(gè)縱、斜隔膜。該菌初步鑒定為鏈格孢屬霉菌。

菌株C菌落較小，邊緣清晰，近圓形，正面為深綠色粉粒狀孢子，反面為橘黃色。菌落邊緣有一圈白色絨毛，表面光滑整齊，產(chǎn)黃色色素，不蔓延，菌絲不分枝，細(xì)長(zhǎng)有分隔，有特征的掃帚狀分生孢子頭，分生孢子梗有分枝，分生孢子為橢圓形，成串狀排列。該菌初步鑒定為青霉屬霉菌。

綜上所述，杏干上優(yōu)勢(shì)霉菌主要是根霉屬霉菌、鏈格孢屬霉菌和青霉屬霉菌。張瑾等[11]從病害鮮杏上分離出來6種霉菌，其中黑根霉、鏈格孢菌和粉紅聚端孢霉分離頻率最高，是杏采后病害的主要致病菌。劉開啟等[19]則認(rèn)為鏈格孢菌是導(dǎo)致杏采后黑斑病的病原菌。本實(shí)驗(yàn)從杏干上分離的霉菌和導(dǎo)致杏采后病害的病原菌一致，結(jié)果表明這些霉菌在杏干儲(chǔ)藏過程中生長(zhǎng)繁殖，最終導(dǎo)致杏干腐爛變質(zhì)。

2.3 植物精油對(duì)杏干混合菌的抑制效果

植物精油對(duì)杏干細(xì)菌的抑菌效果如圖3所示，對(duì)霉菌的抑菌效果如圖4所示。不同植物精油對(duì)微生物的抑菌活性不同，精油濃度越大，抑菌率越高。除辣椒精油外，其他8種植物精油在高濃度時(shí)對(duì)細(xì)菌和霉菌的抑制效果都非常好，當(dāng)濃度達(dá)0.5μg/mL時(shí)，其抑菌率均在90%以上。對(duì)細(xì)菌而言，大蒜精油抑制效果最好，其次是月桂精油，茴香精油和肉桂精油的抑菌活性相似；對(duì)霉菌而言，大蒜精油和肉桂精油抑制效果最好，其次是茴香精油和迷迭香精油，再次是月桂精油。李鵬霞等[22]和Liu等[23]用植物精油處理杏果實(shí)，同樣發(fā)現(xiàn)植物精油可以抑制杏果的腐爛，提高好果率。由于大蒜精油和迷迭香精油具有強(qiáng)烈的刺激性氣味，應(yīng)用于食品保鮮，會(huì)造成強(qiáng)烈的不愉悅氣味，因此選擇肉桂精油、月桂精油和茴香精油進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖3 植物精油對(duì)杏干細(xì)菌的抑制效果Fig.3 The inhibitory effects of essential oils against bacterial

圖4 植物精油對(duì)杏干霉菌的抑制效果Fig.4 The inhibitory effects of essential oils against fungus

2.4 肉桂精油、月桂精油和茴香精油對(duì)3種霉菌的抑菌性能研究

抑菌圈直徑反映精油對(duì)霉菌的抑菌性能，三種精油分別對(duì)三種菌的抑菌性能見表1。抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)是：抑菌圈直徑大于20mm，極敏感；15～20mm，高敏感；10～15mm，中敏感；7～9mm，低敏感；小于7mm，不敏感。由表1可以看出，不同種精油對(duì)同一種菌的抑制作用不同，肉桂精油對(duì)3種霉菌均有強(qiáng)烈的抑制效果，抑菌圈直徑均在29mm以上，屬于極敏感，其中對(duì)青霉的抑制效果最好，抑菌圈直徑為39mm；月桂精油對(duì)各種霉菌的抑菌圈直徑也均大于20mm，屬于極敏感范圍；茴香精油對(duì)3種霉菌的抑菌圈直徑均在10mm以下，抑菌效果明顯小于以上兩種精油；卡那霉素對(duì)3種霉菌的抑菌圈均在7mm以下，抑菌活性顯著低于3種精油（p＜0.05）。同一種精油對(duì)不同霉菌的抑菌效果顯著不同，以上3種精油對(duì)青霉的抑制活性最強(qiáng)，其次是鏈格孢菌，對(duì)根霉的抑菌活性較差。綜合來看三種精油對(duì)杏干中優(yōu)勢(shì)霉菌的抑菌活性均強(qiáng)于卡那霉素，抑菌效果依次為：肉桂精油＞月桂精油＞茴香精油。吳慧清等[16]研究了42種植物精油的抑菌效果，結(jié)果肉桂精油的綜合抑菌活性最強(qiáng)。Matan等[24]研究了肉桂精油、丁香精油、茴香精油和薄荷精油對(duì)毛霉、青霉、黑曲霉和根霉的抑菌活性，結(jié)果表明，4種精油對(duì)供試菌均有抑菌活性，其中肉桂精油的抑菌效果最好，和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。李國(guó)林等[25]研究 了8種 植 物 精 油 對(duì)4種 霉 菌 和 4種 腐 敗 細(xì)菌的抑菌效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了肉桂精油的抑菌活性最強(qiáng)。

表1 3種精油抑制霉菌生長(zhǎng)形成的抑菌圈直徑（mm）Table 1 The diameter of inhibition cycle（mm）of 3 essential oil on various tested fungus

2.5 肉桂精油、月桂精油和茴香精油對(duì)3種霉菌的MIC分析

MIC值是測(cè)定抑菌物質(zhì)抑菌活性大小的指標(biāo)。肉桂精油、月桂精油、茴香精油和卡那霉素對(duì)3種霉菌的MIC值分別見表2～表5。由表2～表5可見，肉桂精油對(duì)青霉的抑菌性最強(qiáng)，MIC僅為0.06μg/mL，其次是鏈格孢菌，MIC為0.08μg/mL，對(duì)根霉的抑菌性最弱，MIC為0.1μg/mL。月桂精油對(duì)青霉的抑菌性最強(qiáng)，MIC為0.45μg/mL，其次是鏈格孢菌，MIC為0.55μg/mL，對(duì)根霉的抑菌性最弱，MIC為0.65μg/mL。茴香精油對(duì)青霉的MIC為1.1μg/mL，對(duì)根霉和鏈格孢菌的MIC為1.2μg/mL。卡那霉素對(duì)根霉、鏈格孢菌和青霉的MIC分別為1200、800、1000μg/mL，抑菌效力顯著低于植物精油，和2.4結(jié)果一致。

3種植物精油對(duì)3種供試真菌的抑制效果存在差異，肉桂精油對(duì)3種霉菌的MIC值均較小，在低濃度下即能有效抑制杏干腐敗菌的生長(zhǎng)，具有較強(qiáng)的抑菌活性。MIC 值的結(jié)果也證實(shí)了肉桂精油對(duì)杏干上優(yōu)勢(shì)霉菌有強(qiáng)烈的抑制效果，其中青霉對(duì)肉桂精油的敏感度最高。結(jié)果和2.4中的結(jié)果相一致。精油抑菌結(jié)果存在差異的原因，可能與不同真菌對(duì)精油的主要抑菌成分的敏感程度不同以及作用機(jī)理有關(guān)，因此植物精油的抑菌機(jī)理需要進(jìn)一步研究。

表2 肉桂精油對(duì)3種霉菌的最低抑菌濃度Table 2 MIC value of Cinnamon essential oil on three fungus

表3 月桂精油對(duì)3種霉菌的最低抑菌濃度Table 3 MIC value of Bay essential oil on three fungus

表4 茴香精油對(duì)3種霉菌的最低抑菌濃度Table 4 MIC value of Fennel essential oil on three fungus

表5 卡納霉素對(duì)3種霉菌的最低抑菌濃度Table 5 MIC value of Kanamycin on three fungus

3 結(jié)論

新疆小白杏杏干在儲(chǔ)藏過程中霉菌明顯增長(zhǎng)，其中主要污染菌為根霉菌、鏈格孢菌和青霉菌。本實(shí)驗(yàn)從杏干上分離的霉菌和導(dǎo)致杏采后病害的病原菌一致，這些霉菌是杏干儲(chǔ)藏過程中最終導(dǎo)致杏干腐爛變質(zhì)的主要原因。

肉桂精油、月桂精油和茴香精油對(duì)根霉、鏈格孢菌和青霉均有抑制作用，抑菌活性顯著高于卡那霉素，其中肉桂精油的作用最強(qiáng)。肉桂是食品中常用的調(diào)味品，安全無毒，對(duì)杏干上微生物抑制活性高，因此，可以作為生物殺菌劑用于杏干的保鮮，有很好的開發(fā)潛能。

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Study on antimicrobial activity of essential oils of dried apricots

LI Ya-ru1，ZHOU Lin-yan1，LI Shu-rong1，*，CAO Zhen-zhen1，ZHANG Le1，2，WEI Ming1，2，NIE Ying1，TANG Xuan-ming1
（1.Key Laboratory of Agro-product Processing and Quality Control，Institute of Agro-Products Processing Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China；2.College of Food Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，China）

Changesofthe microbiologicalcontenton ‘Xiao Bai’ dried apricotduring storage were investigated.Three fungal species were separated from dried apricot，and they were identified as Rhizopus，Alternaria and Penicillium.The results of the antibacterial activity of nine essential oils showed that cinnamon，bay and fennel essential oils had significant antiseptic effect on microbe of dried apricot.Furthermore，three essential oils were used to inhibit the main fungus from dried apricots，the diameter of inhibition cycle and minimal inhibition concentration （MIC ） were determined.The overall results indicated that cinnamon ，bay and fennel essential oils had significant inhibitory effect on fungi from dried apricot compared with Kanamycin.The order of inhibitory effect was studied as follows：cinnamon ＞bay ＞fennel.Cinnamon oil could be used in dried apricots as antifungal agents to prolong the shelf life.

essential oil；dried apricot；identification of fungus；antimicrobial activity

TS213.2

A

1002-0306（2014）20-0137-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.021

2014－01－20

李亞茹（1990-），女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)。

* 通訊作者：李淑榮（1964-），女，研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃——新疆主要特色干堅(jiān)果貯藏期品質(zhì)與蟲害調(diào)控技術(shù)集成研究與示范。