不同品種犢牛血清對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖與分化的影響

何 陽，宋 沙，薛志杰，曹 暉，曹兵海

（1．中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動(dòng)物營養(yǎng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2．秦寶牧業(yè)）

不同品種犢牛血清對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖與分化的影響

何 陽1，宋 沙1，薛志杰1，曹 暉2，曹兵海1

（1．中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動(dòng)物營養(yǎng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2．秦寶牧業(yè)）

試驗(yàn)以3T3-L1為模型細(xì)胞，通過研究不同品種犢牛血清對(duì)其增殖與分化的影響，為早期確定牛是否具有育肥價(jià)值提供一種新思路。選取50頭秦和犢牛、50頭安和犢牛和8頭夏洛萊雜交犢牛，頸靜脈取血制備血清。試劑盒檢測細(xì)胞增殖相對(duì)數(shù)，油紅0檢測脂肪含量，用比色法測定三磷酸甘油脫氫酶（GPDH）和脂肪酸合成酶（FAS）活性。結(jié)果表明：①在細(xì)胞增殖方面，在增殖的第1天3個(gè)品種雜交牛無顯著差異（P＞0．05）；在增殖的第2、4、6、8天夏雜牛極顯著高于秦和牛（P＜0．01），顯著高于安和牛（P＞0．05），而安和牛在第2天和第6天又極顯著高于秦和牛（P＜0．05）；在增殖的第10天夏雜牛顯著高于秦和牛（P＜0．05），而夏雜牛與安和牛、安和牛與秦和牛之間均無顯著性差異（P＞0．05）。②在細(xì)胞分化方面，安和牛血清培養(yǎng)細(xì)胞分化的脂肪含量在第2、4、6、8、10、12天顯著高于夏雜牛和秦和牛（P＜0．05）；秦和牛血清培養(yǎng)細(xì)胞分化的脂肪含量在第2、4、6、8、10天又顯著高于夏雜牛（P＜0．05），第12天沒有顯著性差異（P＞0．05）。③分化第10天檢測細(xì)胞內(nèi)GPDH和FAS酶活性，安和牛血清培養(yǎng)的細(xì)胞組中的GPDH極顯著高于夏雜牛（P＜0．01）和秦和牛（P＜0．01）,FAS活性極顯著高于夏雜牛（P＜0．01），顯著高于秦和牛（P＜0．05）；夏雜牛血清培養(yǎng)的細(xì)胞組中的GPDH顯著高于秦和牛（P＜0．05），而FAS的活性兩者間沒有顯著性差異（P＞0．05）。結(jié)果顯示：牛血清品種是影響前脂肪細(xì)胞增殖與分化的因素，夏雜牛血清更有利于前脂肪細(xì)胞的增殖，而安和牛血清更有利于前脂肪細(xì)胞的分化，但作為確定牛是否具有育肥價(jià)值仍需進(jìn)一步研究。關(guān)鍵詞：犢牛血清；3T3-L1前脂肪細(xì)胞；增殖與分化

建立在肉牛生長發(fā)育早期就能快速、準(zhǔn)確地檢測與評(píng)估肉牛育肥效果及牛肉品質(zhì)的方法，是提高生產(chǎn)效率、準(zhǔn)確滿足消費(fèi)者的肉質(zhì)需求、提高產(chǎn)業(yè)效益的途徑之一。為達(dá)到這一目的，已用超聲波活體測定背膘厚和眼肌面積［1］，并在牛肉的大理石紋和嫩度的基因標(biāo)記［2］等技術(shù)領(lǐng)域進(jìn)行研發(fā)應(yīng)用。

肌間脂肪組織是影響牛肉品質(zhì)的重要因素之一，前脂肪細(xì)胞的分化活性又是影響脂肪組織發(fā)育的決定因素，而前脂肪細(xì)胞的分化活性一般受脂肪酸合成酶（FAS）、三磷酸甘油脫氫酶(GPDH)、過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARS）等因素的影響［3-5］。在有關(guān)前脂肪細(xì)胞分化活性的研究中，一般將3T3-L1前脂肪細(xì)胞系作為標(biāo)準(zhǔn)模型細(xì)胞，如研究肥胖、糖尿病的模型細(xì)胞［6-7］，在培養(yǎng)基中添加各種物質(zhì)用以研究脂肪合成代謝的機(jī)理［8-11］，但幾乎所有研究所使用的培養(yǎng)基都含有血清，說明血清是影響前脂肪細(xì)胞分化的重要因素［12］。血清中含有細(xì)胞生長所必需的營養(yǎng)成分，這些成分在體外可以再造適于細(xì)胞生長、繁殖、黏附和分化的生理環(huán)境［13］，決定細(xì)胞的生長效果［14］。不同品種的胎牛血清對(duì)細(xì)胞增殖有影響［12］，說明牛的血清成分對(duì)前脂肪細(xì)胞分化活性的影響在品種間有差異，由此推測血清成分的活性很可能受品種遺傳性能支配，繼而影響前脂肪細(xì)胞的分化活性，從而影響牛肉中的脂肪沉積效果。如果這個(gè)推斷成立，則使用不同品種的犢牛血清培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)模型，就有可能鑒別各品種牛的前脂肪細(xì)胞的分化活性，從而對(duì)肉牛的牛肉品質(zhì)在生長早期做出鑒別提供另一種思路。

為此，本試驗(yàn)采用3T3-L1前脂肪細(xì)胞作為模型細(xì)胞，用不同品種牛血清作用于細(xì)胞，研究了不同品種犢牛血清對(duì)前脂肪細(xì)胞增殖與分化的影響。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

3T3 -L1前脂肪細(xì)胞購自國家細(xì)胞資源中心。犢牛血清采自陜西秦寶牛場的108頭牛，所有牛都在5～7月齡,其中秦川牛與和牛雜交牛（秦和牛）50頭，安格斯牛與和牛雜交牛（安和牛）50頭，夏洛萊雜交牛（夏雜牛）8頭。對(duì)試驗(yàn)牛頸靜脈采血，4℃下3 000 r/min離心10 min（上海安亭），取血清于-20℃冰箱（中科美菱）保存待測。試驗(yàn)所用試劑除特殊說明以外均購于Sigma。

1．2 試驗(yàn)方法

1.2.1 血清的處理 將-20℃保存的血清放在4℃下解凍，每管中取一部分直接用0.22 μm微孔過濾器（Pall）過濾待測。

1.2.2 前脂肪細(xì)胞的分化培養(yǎng) 將匯合成單層的3T3-L1細(xì)胞消化，以104細(xì)胞/mL密度將細(xì)胞懸液接種到96孔板中。匯合2 d后換用含胰島素10 mg/L，地塞米松1 μmol/L，1-甲基-3-異丁基黃嘌呤0.5mmol/L，10%不同牛血清的誘導(dǎo)培養(yǎng)基（分化第0天），分化第2天換用含胰島素10 mg/L、10%不同牛血清的分化培養(yǎng)基，第4天以后換用含10%不同牛血清的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（北京索萊寶生物科技有限公司），每2天換1次液。油紅0（北京經(jīng)日今典）染色法測定細(xì)胞內(nèi)脂肪含量［15］,用酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）在540 nm波長下的吸光度（OD值）表示脂肪含量。

1.2.3 前脂肪細(xì)胞的增殖 將匯合成單層的3T3-L1細(xì)胞消化，以103細(xì)胞/mL密度將細(xì)胞懸液接種到96孔板中。以后換用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（10%不同牛血清），每兩天換1次液。用CCK-8試劑盒在37℃孵育4 h后用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測得的吸光度作為細(xì)胞相對(duì)數(shù)量。

1.2.4 三磷酸甘油脫氫酶（GPDH）活性測定 棄去培養(yǎng)液，用PBS緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）沖洗兩遍，加入冰蔗糖（北京廣達(dá)恒益）緩沖液1 mL/孔，用超聲波細(xì)胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）破碎成勻漿30 s。將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中。勻漿液在4℃，3 000 r/min離心5 min，吸取上層清液即為分析用液；測定過程參照Wise等[16]方法進(jìn)行。蛋白濃度采用考馬氏亮藍(lán)蛋白定量試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定。1U酶活相當(dāng)于氧化1nmol的NADH/min，以此代表分化能力。

1.2.5 脂肪酸合成酶（FAS）活性測定 在周長海等［17］測定的基礎(chǔ)上，做了如下修改。加入11.05 mmol/Lβ-NADPH溶液0.04 mL，7.25 mmol/L乙酰輔酶 A溶液0.04 mL，40℃的Cook-tail Solution緩沖溶液1.4 mL，上清液0.08 mL，混合均勻后，再加入3.51 mmol/L丙二酸單酰輔酶A溶液0.08 mL，迅速震動(dòng)混合后，用紫外分光光度計(jì)（日本島津制作所）在340 nm條件下測1 min吸光度變化。蛋白濃度采用考馬氏亮藍(lán)蛋白定量試劑盒測定。1U酶活相當(dāng)于氧化1 nmol的NADPH/min，用來代表分化能力。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本試驗(yàn)中的所有數(shù)據(jù)都以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。用EXCEL2007軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步統(tǒng)計(jì)；用SAS V9.0 for windows軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行GLM單因素方差分析，用Duncan氏法多重比較平均值之間差異的顯著性。差異性顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同品種犢牛血清對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的影響

由表1可見，隨著細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)的增加，細(xì)胞數(shù)量呈“S”形增長。在增殖的第1天，3個(gè)品種雜交牛細(xì)胞數(shù)量無顯著差異（P＞0.05）；在增殖的第2、4、6、8天夏雜牛極顯著高于秦和牛（P<0.01），顯著高于安和牛（P<0.05），而安和牛在第2天和第6天又極顯著高于秦和牛（P<0.01）；在增殖的第10天夏雜牛顯著高于秦和牛（P<0.05），而夏雜牛與安和牛、安和牛與秦和牛之間均無顯著差異（P＞0.05）。

表1 不同品種犢牛血清對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的影晌

2．2 不同品種犢牛血清對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響

由表2可見，隨著細(xì)胞分化培養(yǎng)天數(shù)的增加，細(xì)胞內(nèi)合成脂肪的量逐漸增加。在分化前期（2 d），細(xì)胞的脂肪合成量以安和牛>秦和牛>夏雜牛的順序表現(xiàn)顯著差異（P<0.05）。在分化后期（10～12 d）夏雜牛的脂肪合成量大于秦和牛但小于安和牛。安和牛血清培養(yǎng)細(xì)胞分化的脂肪含量在第2、4、6、8、10、12天顯著高于夏雜牛和秦

和牛（P<0.05）；秦和牛血清培養(yǎng)細(xì)胞分化的脂肪含量在第2、4、6、8、10天又顯著高于夏雜牛（P<0.05），第12天沒有顯著性差異（P>0.05）。

表2 不同品種犢牛血清對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影晌

2．3 不同品種犢牛血清對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞中GPDH和FAS活性的影響

由表3可見，由于脂肪細(xì)胞合成脂肪最快時(shí)期是第8天以后，所以在分化的第10天檢測細(xì)胞液中GPDH和FAS的活性。安和牛血清培養(yǎng)的細(xì)胞組中的GPDH活性極顯著高于夏雜牛（P<0.01）和秦和牛（P<0.01），F(xiàn)AS的活性極顯著高于夏雜牛（P<0.01），顯著高于秦和牛（P<0.05）；夏雜牛血清培養(yǎng)的細(xì)胞組中的GPDH顯著高于秦和牛（P<0.05），而FAS的活性兩者間沒有顯著性差異（P>0.05）。

表3 不同品種犢牛血清對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞中GPDH和FAS活性的影響U

3 討論

3．1 不同品種犢牛血清對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的影響

血清影響細(xì)胞的形態(tài)、生長情況、細(xì)胞傳代及凍存各方面，研究認(rèn)為不同胎牛血清對(duì)細(xì)胞增殖有影響［12］。秦安牛血清與秦川牛血清相比，秦安牛血清可能有利于細(xì)胞的增殖[18]。本試驗(yàn)中，夏雜牛血清比安和牛和秦和牛血清更有利于細(xì)胞的增殖，而安和牛血清又比秦和牛血清更有利于細(xì)胞的增殖，說明所測3個(gè)牛種犢牛血清中的某些成分具有獨(dú)自的促脂肪細(xì)胞增殖能力，其中在三磷酸甘油脫氫酶活性上，5～7月齡的夏雜牛高于其他兩種牛，而安和牛又高于秦和牛。

3．2 不同品種犢牛血清對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響

前脂肪細(xì)胞分化過程中的一個(gè)顯著性標(biāo)志是細(xì)胞中逐漸沉積大量的脂肪。有研究認(rèn)為，貓血清比胎牛血清更能促進(jìn)大鼠前脂肪細(xì)胞及3T3-F442A細(xì)胞的分化［19］；血清能促進(jìn)豬脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪的沉積［20］。馮麗萍等［18］報(bào)道，秦川牛血清比秦安牛血清可能更有利于細(xì)胞的分化。在本試驗(yàn)研究中，安和牛血清比秦和牛血清和夏雜牛血清更能促進(jìn)3T3-L1細(xì)胞的分化，而秦和牛血清又比夏雜牛血清更能促進(jìn)3T3-L1細(xì)胞的分化。從3T3-L1細(xì)胞模型推測，安和牛脂肪沉積要比秦和牛和夏雜?？欤睾团Ｖ境练e又比夏雜?？?。張國梁等[21]的育肥結(jié)果也證實(shí)了本研究的研究結(jié)果。

3．3 不同品種犢牛血清對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞中GPDH和FAS活性的影響

細(xì)胞分化過程會(huì)編碼大量與脂肪合成有關(guān)的酶類，其中GPDH、FAS是分化晚期的標(biāo)志物[22]，晚期標(biāo)志物活性的強(qiáng)弱表示前脂肪細(xì)胞分化活性的強(qiáng)弱，它的出現(xiàn)標(biāo)志著脂肪細(xì)胞的生長和生成。研究認(rèn)為在細(xì)胞分化過程中與脂肪合成有關(guān)的酶不僅在數(shù)量上增加，而且促進(jìn)細(xì)胞合成新的、熱穩(wěn)定的GPDH,并且GPDH的活性會(huì)上升600多倍[16]。研究認(rèn)為貓血清比胎牛血清培養(yǎng)的大鼠前脂肪細(xì)胞及3T3-F442A細(xì)胞的中GPDH和FAS活性高。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，安和牛血清培養(yǎng)細(xì)胞中的GPDH最高，這與細(xì)胞合成脂肪的量相符合。雖然秦和牛血清組培養(yǎng)細(xì)胞合成脂肪量比夏雜牛大，但在分化后期夏雜牛血清組合成脂肪速度比秦和牛血清組快。說明夏雜牛血清組中GPDH活性比秦和牛血清組高。在脂肪合成過程中，首先是乙酰輔酶-A經(jīng)過7次酶促反應(yīng)合成棕櫚酸，F(xiàn)AS是這7個(gè)酶促反應(yīng)的脂肪酸合成酶系［23］。在3T3-L1前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化過程中細(xì)胞中的FAS活性升高可達(dá)19.5倍，并穩(wěn)定在12.5倍［24］。在本試驗(yàn)中，F(xiàn)AS的活性與脂肪合成量存在正相關(guān)關(guān)系，安和牛血清組的細(xì)胞中FAS及GPDH的活性最高，使得細(xì)胞中合成的脂肪量最高。

4 結(jié)論

夏雜牛血清比安和牛血清和秦和牛血清更能促進(jìn)細(xì)胞的增殖，而安和牛血清比夏雜牛血清和秦和牛血清更能促進(jìn)細(xì)胞的分化，秦和牛血清的促增殖和分化能力介于夏雜牛血清和安和牛血清之間。但這種通過細(xì)胞培養(yǎng)的方法作為確定牛是否具有育肥價(jià)值仍需進(jìn)一步研究。

致謝：感謝在陜西秦寶采樣時(shí)，牛場所有工作人員對(duì)采樣的支持和幫助！

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A

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2014-04-23

國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-38)；南方地區(qū)草食家畜育肥與高品質(zhì)肉生產(chǎn)技術(shù)研究(201303144)

何陽（1987-），碩士生。

曹兵海，博士生導(dǎo)師，主要從事肉牛營養(yǎng)與肉品質(zhì)研究。