基于萘酰亞胺的Turn-on型Fe3＋熒光探針

殷麗艷，陳甜甜，朱維平

（華東理工大學(xué) 藥學(xué)院，上海 200237）

過渡金屬及重金屬元素在自然界中含量豐富，其中一些金屬元素在生命過程中起著非常重要的作用［1］。在大腦中，鐵元素是含量最為豐富的過渡金屬元素，腦組織可充分利用它并將它轉(zhuǎn)化為某些酶的重要組成部分，共同參與氧氣的運(yùn)輸與代謝；而且鐵元素在許多金屬蛋白酶中也是不可或缺的組成部分；同時(shí)，在生命體的有氧代謝與電子轉(zhuǎn)移等過程中，鐵元素扮演著酶的催化劑等重要角色，因而鐵離子的轉(zhuǎn)運(yùn)與傳遞、儲(chǔ)存與利用，以及平衡與代謝等過程都與有機(jī)體的生理功能密切相關(guān)，鐵離子的缺乏或過量都會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的機(jī)體功能紊亂［2］。因此，準(zhǔn)確檢測(cè)人體內(nèi)鐵離子的含量以及跟蹤其代謝過程對(duì)于疾病診斷與病情控制具有重要的作用。

目前檢測(cè)鐵離子的方法有很多種，其中熒光分析法具有快速響應(yīng)與高靈敏度的特點(diǎn)，因此利用熒光探針來(lái)定性與定量檢測(cè)鐵離子已成為研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)，關(guān)于鐵離子熒光探針的研究已有一些報(bào)道［3-6］，但是由于 Fe（Ⅲ）的順磁性，通常會(huì)使熒光猝滅［7-10］，因此熒光增強(qiáng)型的 Fe3＋探針很少見報(bào)道。

隨著生命科學(xué)、有機(jī)化學(xué)、分析化學(xué)和材料化學(xué)等多學(xué)科多領(lǐng)域的研究不斷交叉深入，以及熒光檢測(cè)技術(shù)的不斷提高，化學(xué)傳感越來(lái)越依賴于新穎的傳感材料來(lái)實(shí)現(xiàn)其價(jià)值。在小分子熒光化合物出現(xiàn)后，通常利用固載技術(shù)將小分子熒光化合物引入到固相載體中，制造出熒光傳感材料［11］。其中應(yīng)用較廣泛和成熟的一類材料是硅膠納米顆粒材料，它是一類良好的熒光傳感材載體，尺寸處于料納米級(jí)，對(duì)細(xì)胞沒有明顯的毒性，其骨架對(duì)熱、pH以及機(jī)械應(yīng)力穩(wěn)定，同時(shí)其比表面積大、負(fù)載量高等優(yōu)點(diǎn)使其可利用范圍廣。通過將小分子熒光探針進(jìn)行硅烷化修飾后，將其共價(jià)鍵合到硅膠顆粒上，可以制得能夠檢測(cè)各種目標(biāo)分子的熒光傳感材料。

在小分子熒光團(tuán)中，萘酰亞胺類熒光團(tuán)因具有高熒光量子產(chǎn)率、光穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性以及較大的Stokes位移等特點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用［12-15］。本文選擇萘酰亞胺作為熒光團(tuán)，通過哌嗪與N-2-氯乙酰氨基喹啉反應(yīng)得到目標(biāo)探針NPAP，其作用機(jī)理是：當(dāng)體系中沒有Fe3＋離子存在時(shí)，哌嗪的氮原子上的孤對(duì)電子對(duì)萘酰亞胺熒光團(tuán)產(chǎn)生PET（photo induced electron transfer，光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移）過程，因而熒光比較弱；當(dāng)體系中有Fe3＋存在時(shí)，探針與Fe3＋結(jié)合后抑制其PET過程，熒光團(tuán)的熒光發(fā)射出來(lái)。同時(shí)，本文將Fe3＋離子小分子熒光探針NPAP通過硅烷化修飾后得到了化合物B4，然后共價(jià)鍵合到硅膠顆粒表面，得到了Fe3＋離子熒光傳感器FS。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

Avance 400MHz（Bruker）核磁共振儀（TMS為內(nèi)標(biāo)），MicroMass GCT CA055質(zhì)譜儀（ESI源），Varian Cary Bio 100紫外光譜儀，Varian Cary Eclipse Bio熒光光譜儀，SZ-98自動(dòng)雙重純水蒸餾器（上海本波儀器），Sartorius PB-10精密數(shù)顯酸度計(jì)。

實(shí)驗(yàn)制備過程中所用試劑均為市售分析純?cè)噭?；二甘醇胺、無(wú)水哌嗪購(gòu)于阿拉丁試劑公司；N，N-二 異 丙 基 乙 基 胺 （N，N-Diisopropylethylamine，DIPEA）購(gòu)于邦成化工公司；柱色譜硅膠為青島海洋化工廠產(chǎn)品（300～400目）。

1.2 Fe3＋離子小分子熒光探針NPAP和熒光傳感器FS的合成

探針NPAP的合成路線如圖1所示，由原料8-氨基喹啉與2-氯乙酰氯反應(yīng)得到化合物B1，然后由原料4-溴-1，8萘酐B0與二甘醇胺反應(yīng)得到N-取代萘酰亞胺B2，再與無(wú)水哌嗪反應(yīng)得到化合物B3，最后與化合物B1反應(yīng)得到探針NPAP。

圖1 熒光探針NPAP的合成路線Synthesis of the fluorescent sensor NPAP

熒光傳感器FS的合成路線如圖2所示，將化合物NPAP進(jìn)行硅烷化修飾得到化合物B4，然后與事先預(yù)處理好的二氧化硅硅膠納米顆粒共價(jià)鍵合，得到熒光傳感器FS。

1.2.1 化合物B1的合成［16］

將576.0mg（4.0mmol）8-氨基喹啉和0.5 mL吡啶溶于20mL重蒸過的氯仿中，再將542.0 mg（4.8mmol）氯乙酰氯在冰浴下緩慢滴加到上述反應(yīng)液中，滴加完畢撤去冰浴，室溫反應(yīng)2h，TLC跟蹤反應(yīng)結(jié)束后，停止反應(yīng)，減壓蒸去溶劑，硅膠柱層析（石油醚/乙酸乙酯，5∶1，V/V）得白色針狀晶體B1，760.0mg，收率為86.6%。

圖2 熒光傳感器FS的合成路線Synthesis of the fluorescent sensor FS

1.2.2 化合物B2的合成

將500.0mg（1.8mmol）4-溴-1，8-萘酐（B0）、190.0mg 2-（2-氨基乙氧基）乙醇溶于10mL無(wú)水乙醇中，加熱回流1h，冷卻至室溫，放置過夜，析出晶體，抽濾取濾餅，紅外烘干得 N-（2-（2-羥乙氧基）乙基）-4-溴-1，8-萘酰亞胺黃色晶體（B2），515.0 mg，收率為78.6%，熔點(diǎn)：132.0～133.6℃。

1.2.3 化合物B3的合成

將500.0mg（1.3mmol）N-（2-（2-羥乙氧基）乙基）-4-溴-1，8-萘酰亞胺（B2）和454.5mg（5.3 mmol）無(wú)水哌嗪溶于15.0mL乙二醇單甲醚中，加熱回流，氬氣保護(hù)下反應(yīng)10h，停止反應(yīng)，旋干溶劑，硅膠柱色譜分離（二氯甲烷/甲醇，15∶1，V/V），得到化合物B3，450.0mg，收率為92.3%，熔 點(diǎn)：198.0～200.0℃。1HNMR （400MHz，CDCl3）：2.0（br，1H），3.20（d，J＝4.4Hz，4H），3.24 （d，J＝4.8Hz，4H，），3.66 （br，2H），3.67 （br，2H），3.84 （t，J＝5.6Hz，2H），4.43（t，J＝5.6Hz，2H），7.20（d，J＝8.0Hz，1H），7.69（t，J＝7.8Hz，1H），8.42（d，J＝8.4Hz，1H），8.53 （d，J＝6.8Hz，1H），8.58（d，J＝6.8Hz，1H）。

1.2.4 化合物NPAP的合成

將200.0mg（0.9mmol）N-2-氯乙酰氨基喹啉（B1），365.6mg（1.0mmol）化合物B3，60.0mg碘化鉀，2mL N，N-二異丙基乙基胺（DIPEA）溶于60.0mL乙腈中，在氬氣保護(hù)下加熱回流反應(yīng)10h，停止反應(yīng)后，旋干溶劑，硅膠柱色譜分離（二氯甲烷/甲醇，70∶1，V/V），得黃色晶體 NPAP，260.0mg，收率為54.2%。1HNMR （400MHz，CDCl3）：3.03（br，4H），3.45（br，6H），3.67（d，J＝12.4Hz，4H），3.84 （br，2H），4.41（br，2H），7.25（d，J＝8.0Hz，1H），7.43（t，J＝3.6Hz，1H），7.51 （d，J＝7.2Hz，2H），7.66（t，J＝7.2Hz，1H），8.38（d，J＝8.0Hz，1H），8.52（t，J＝7.2Hz，2H），8.76（d，J＝6.0Hz，1H），8.83 （s，1H），11.44 （s，1H）。13CNMR （100MHz，CDCl3）：39.3，53.3，53.4，61.8，62.4，68.5，72.3，115.0，116.6，121.6，121.9，123.0，125.8，126.1，127.3，128.0，129.9，130.4，131.3，132.7，134.1，136.2，138.9，148.6，155.9，164.2，164.6，168.6。HRMS（ESI）calcd.For C31H31N5O5［M＋H＋］554.2325，found 554.2404。

1.2.5 化合物B4的合成

將50.0mg（90.0μmol）NPAP和178.0mg（72.0μmol）化合物B溶于10.0mL重蒸過的甲苯中，然后滴加4滴二異丙基乙基胺，在氬氣保護(hù)下加熱、回流反應(yīng)72h。停止反應(yīng)后，旋干溶劑，TLC大板分離（二氯甲烷/甲醇，40∶1，V/V），得黃色固體50.0mg，收率為69.4%。1HNMR （400 MHz，CDCl3）：0.63（t，J＝9.2Hz，2H），1.27（s，9H），1.62（t，J＝8.4Hz，2H），3.07（br，4H），3.15 （t，J＝6.4Hz，2H），3.49 （br，4H），3.52 （br，4H），3.76 （br，4H），3.80～3.87（m，8H），4.20（br，2H），4.46（t，J＝6.0 Hz，2H），7.33（d，J＝8.0Hz，1H），7.48（q，J＝8.0Hz，1H），7.56（d，J＝8.0Hz，1H），7.60（d，J＝8.0Hz，1H），7.74（t，J＝8.0Hz，1H），8.19（d，J＝7.6Hz，1H），8.47 （d，J＝8.4 Hz，1H），8.59（d，J＝8.4Hz，1H），8.61（d，J＝7.6Hz，1H），8.81（dd，J1＝6.8Hz，J2＝1.6Hz，1H），8.88（d，J＝2.8Hz，1H），11.50（s，1H）。HRMS（ESI）calcd.For C41H52N6O9［M＋Na＋］823.3463，found 823.3465。

1.2.6 熒光傳感器FS的合成

將10.0mg化合物B4和1.5g經(jīng)過活化的硅膠于15.0mL無(wú)水甲苯中混合，氬氣保護(hù)下加熱回流反應(yīng)72h，停止反應(yīng)后，過濾，取濾餅，濾餅用無(wú)水乙醇洗滌至沒有顏色，所得到的固體在甲醇中回流24h，然后過濾，所得固體在120℃烘箱干燥24h，得到熒光傳感器FS。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針NPAP對(duì)Fe3＋離子的滴定曲線

我們?cè)?.01mol/L Tris-HCl（乙腈/水，80∶20，V/V），pH＝6.46，探針 NPAP （0.5μmol/L）的測(cè)試條件下，檢測(cè)其探針隨著Fe3＋的加入的熒光發(fā)射光譜。如圖3所示，隨著Fe3＋不斷加入，探針NPAP的熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，最后當(dāng)Fe3＋離子加到320當(dāng)量時(shí)，熒光強(qiáng)度不再增強(qiáng)，其熒光增強(qiáng)10倍，且伴隨著波長(zhǎng)20nm的藍(lán)移（從540nm到520nm）。

圖3 探針NPAP（0.5μmol/L）在不同F(xiàn)e3＋的熒光光譜圖插圖是探針NPAP在520nm處的熒光強(qiáng)度與Fe3＋濃度的關(guān)系Fluorescence spectra of NPAP（0.5μmol/L）in the presence of increasing concentrations of Fe3＋ ，inset：integrate fluorescence intensity as a function of Fe3＋ion concentrations

進(jìn)一步研究了pH值對(duì)體系的影響。pH滴定實(shí)驗(yàn)是在0.01mol/L Tris-HCl（乙腈/水，80∶20，V/V）中測(cè)定。圖4表明，探針NPAP在波長(zhǎng)為520nm處的熒光強(qiáng)度隨著pH值的增加而降低，且伴隨著20nm的紅移（從520nm到540 nm）。這是因?yàn)樵谒嵝詶l件下，哌嗪上氮原子被質(zhì)子化，抑制其PET過程，導(dǎo)致熒光增強(qiáng)；另外，哌嗪上氮原子弱的ICT（Intramolecular Charge transfer）過程導(dǎo)致其波長(zhǎng)稍微紅移。然而，在pH 6.0～12.0的范圍內(nèi)，探針NPAP熒光強(qiáng)度幾乎保持不變，如圖5所示，即此探針能在寬pH范圍內(nèi)穩(wěn)定，不受pH影響。

圖4 探針NPAP（0.5μmol/L）在不同pH下發(fā)射光譜的變化Fluorescence spectra of NPAP（0.5μmol/L）at different pH values

圖5 探針NPAP（0.5μmol/L）的熒光強(qiáng)度對(duì)pH的變化曲線Fluorescence response of NPAP（0.5μmol/L）at different pH values

2.2 探針NPAP的選擇性和競(jìng)爭(zhēng)性的研究

前面我們已經(jīng)探討了探針NPAP在不同pH下光譜性能和對(duì)Fe3＋的識(shí)別性能，但是考察探針的另一個(gè)指標(biāo)是選擇性。如圖6和圖7所示，探針對(duì) Fe3＋有較高的選擇性，其中 Fe2＋、Zn2＋、Hg2＋、Pb2＋、Co2＋、Cd2＋等離子都沒有響應(yīng)，其中Cu2＋離子是熒光猝滅的，Cr3＋離子是熒光增強(qiáng)的，且熒光增強(qiáng)1倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明探針NPAP對(duì)Fe3＋離子是一個(gè)熒光增強(qiáng)型（turn-on）探針。

圖6 探針NPAP對(duì)不同離子的熒光光譜圖Fluorescence spectra of NPAP（0.5μmol/L）to different metal ions（1.6μmol/L）

圖7 探針NPAP對(duì)不同離子的熒光響應(yīng)曲線Fluorescence response of NPAP（0.5μmol/L）to different metal ions（1.6μmol/L）

探針NPAP的競(jìng)爭(zhēng)性如圖8所示，可以看出，除Cr3＋離子有一定的干擾外，探針NPAP不受其他離子的干擾。選擇性和競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NPAP是一個(gè)選擇性識(shí)別Fe3＋的turn-on探針。

2.3 熒光傳感器FS對(duì)Fe3＋的滴定曲線

FS對(duì) Fe3＋的滴定在0.01mol/L Tris-HCl（乙腈/水，80∶20，V/V），pH＝6.46中測(cè)試，如圖9所示，隨著Fe3＋離子濃度的增加，F(xiàn)S的熒光逐漸增強(qiáng)，且伴隨著波長(zhǎng)稍微的藍(lán)移（約5nm），且在20～140μmol/L Fe3＋離子含量范圍內(nèi)，F(xiàn)S的熒光強(qiáng)度與Fe3＋離子濃度呈良好的線性關(guān)系（R2＝0.9023）。

圖8 探針NPAP（0.5μmol/L）的競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)：在存在其他離子3.2當(dāng)量的溶液中，加入3.2當(dāng)量的Fe3＋后的熒光響應(yīng)The florescence intensity of NPAP（0.5μmol/L）with 3.2equiv of Fe3＋ and other metal ions

圖9 FS對(duì)不同濃度的Fe3＋滴定曲線Fluorescence spectra of FSin the presence of increasing concentrations of Fe3＋

圖10 FS熒光強(qiáng)度與Fe3＋濃度的曲線The integrate fluorescence intensity of FS as a function of Fe3＋ion concentration

3 結(jié)論

以萘酰亞胺作為熒光團(tuán)，通過哌嗪與N-2-氯乙酰氨基喹啉（受體）反應(yīng)得到基于PET原理的熒光增強(qiáng)型 （turn-on）Fe3＋探針，此 探針能在pH6.0～12.0范圍內(nèi)保持熒光強(qiáng)度不變，而且能選擇性識(shí)別溶液中的Fe3＋，具有良好的選擇性和靈敏性。同時(shí)將NPAP硅烷化修飾后，共價(jià)鍵聯(lián)到硅膠顆粒上得到熒光增強(qiáng)型Fe3＋傳感材料FS，且在20～140μmol/L Fe3＋離子含量范圍內(nèi)，F(xiàn)S的熒光強(qiáng)度與Fe3＋離子濃度呈良好的線性關(guān)系（R2＝ 0.9023）。

［1］ Que E L，Domaille D W，Chang C J.Metals in neurobiology：probing their chemistry and biology with molecular imaging［J］.Chemical Reviews，2008，108（5）：1517-1549.

［2］ Singh N，Kaur N，Callan J.Incorporation of siderophore binding sites in a dipodal fluorescent sensor for Fe（Ⅲ）［J］.Journal of Fluorescence，2009，19（4）：649-654.

［3］ Fakih S，Podinovskaia M，Kong X，Schaible U E，Collins H L，Hider R C.Monitoring intracellular labile iron pools：a novel fluorescent iron（Ⅲ）sensor as a potential non-invasive diagnosis tool［J］.Journal of Pharmaceutical Sciences，2009，98（6）：2212-2226.

［4］ Liu S D，Zhang L W，Liu X.A highly sensitive and selective fluorescent probe for Fe3＋based on 2-（2-hydroxyphenyl）benzothiazole［J］.New Journal of Chemistry，2013，37（3）：821-826.

［5］ Ghosh K，Rathi S，Kushwaha R.Sensing of Fe（Ⅲ）ion via turn-on fluorescence by fluorescence probes derived from 1-naphthylamine［J］.Tetrahedron Letters，2013，54（48）：6460-6463.

［6］ Chung P，Liu S R，Wang H F，Wu S P.A pyrene-based highly selective turn-on fluorescent chemosensor for iron（Ⅲ）ions and its application in living cell imaging［J］.Journal of Fluorescence，2013，23（6）：1139-1145.

［7］ Wolf C，Mei X，Rokadia H K.Selective detection of Fe（Ⅲ）ions in aqueous solution with a 1，8-diac ridylnaphthalenederived fluorosensor［J］.Tetrahedron Letters，2004，45（42）：7867-7871.

［8］ Xiang Y，Tong A.A New Rhodamine-based chemosensor exhibiting selective Fe（Ⅲ）-amplified fluorescence［J］.Organic Letters，2006，8（8）：1549-1552.

［9］ Mao J，Wang L，Dou W，Tang X，Yan Y，Liu W.Tuning the selectivity of two chemosensors to Fe（Ⅲ）and Cr（Ⅲ）［J］.Organic Letters，2007，9（22）：4567-4570.

［10］ 時(shí)麗麗 孫歡鶴，尚卓鑌，王 煜.1，8-二（2-羥乙基）亞氨基蒽醌熒光探針用于Fe（Ⅲ）的高選擇性測(cè)定［J］.影像科學(xué)與光化學(xué)，2013，31（2）：132-139.

Shi L L，Sun H H，Shang Z B，Wang Y.Highly selective fluorescent sensing of Fe3＋by a new anthraquinone derivative 1，8-bis（2-hydroxyethylimino）anthraquinone ［J］.Imaging Science and Photochemistry，2013，31（2）：132-139.

［11］ He C，Zhu W，Xu Y，Chen T，Qian X.Trace mercury（Ⅱ）detection and separation in serum and water samples using a reusable bifunctional fluorescent sensor［J］.Analytica Chimica Acta，2009，651（2）：227-233.

［12］ Jia L，Zhang Y，Guo X，Qian X.A novel chromatism switcher with double receptors selectively for Ag＋in neutral aqueous solution：4，5-diaminoalkeneamino-N-alkyl-l，8-naphthalimides［J］.Tetrahedron Letters，2004，45（20）：3969-3973.

［13］ Guo X，Qian X，Jia L.A highly selective and sensitive fluorescent chemosensor for Hg2＋in neutral buffer aqueous solution［J］.Journal of the American Chemical Society，2004，126（8）：2272-2273.

［14］ Greenfield S R，Svec W A，Gosztola D，Wasielewski M R.Multistep photochemical charge separation in rod-like molecules based on aromatic imides and diimides［J］.Journal of the A-merican Chemical Society，1996，118（28）：6767-6777.

［15］ de Silva A P，Gunaratne H Q N，Habib-Jiwan J-L，McCoy C P，Rice T E，Soumillion J-P.New fluorescent model compounds for the study of photoinduced electron transfer：the influence of a molecular electric field in the excited state［J］.Angewandte Chemie International Edition，1995，34（16）：1728-1731.

［16］ Zhang Y，Guo X，Si W，Jia L，Qian X.Ratiometric and water-soluble fluorescent zinc sensor of carboxamidoquinoline with an alkoxyethylamino chain as receptor［J］.Organic Letters，2008，10（3）：473-476.