試鹵靈類光學探針的研究進展

李 照，馬會民

（中國科學院 化學研究所 活體分析化學重點實驗室，北京100190）

光學探針是指與目標物質(zhì)發(fā)生反應（包括配位、包合、基團反應等）并引起光學（吸光、熒光或發(fā)光）性質(zhì)的變化，從而可對目標物質(zhì)進行分析與測定的一類特殊試劑［1］。其特點是通過向無或低光學響應的物質(zhì)提供光學基團，使原先無法或難于進行的光學分析變得可能。這種光學分析除了在傳統(tǒng)的光學、色譜衍生等領域獲得廣泛應用外，目前已成為生命科學中深入了解各種生理參數(shù)、生物分子的變化，進而揭示生理功能的重要傳感與分析工具［2－6］。由于性能優(yōu)良的光學探針是構(gòu)筑相應光學分析方法的物質(zhì)基礎和根本，因此，新型光學探針的研究一直受到人們的關(guān)注。試鹵靈為一性能優(yōu)良的熒光體。它具有發(fā)射波長長、光穩(wěn)定性好、熒光量子產(chǎn)率高等優(yōu)點，特別是其7－羥基的取代作用通常會封閉光信號。這一特性近年引起了人們的興趣，并被廣泛用于發(fā)展具有低背景光信號的新型探針。

本文將簡要綜述試鹵靈類光學探針的發(fā)展及其在蛋白酶、離子、活性氧物種分析方面的應用，包括探針分子的設計、檢測機理以及生物成像等方面的研究，以展望此類探針的發(fā)展趨勢與應用前景。

1 試鹵靈熒光體的性質(zhì)

試鹵靈屬氧雜蒽類熒光染料，其化學名稱為7－羥基吩惡嗪酮，英文俗名為resorufin。它的7－羥基可以發(fā)生解離，其pKa＝5．8，故試鹵靈的吸收光譜和熒光光譜對弱酸性pH較為敏感［7，8］，例如，當pH值從4升至7時，熒光逐漸增強。然而，當pH＞7時，試鹵靈主要以陰離子形式存在，其溶液呈粉紅色并顯示強的紅色熒光，最大吸收波長在574nm左右（伴有535nm肩峰），最大發(fā)射波長位于585nm，量子產(chǎn)率達0．75，且這些光譜性質(zhì)幾乎不再隨pH 而改變［7，8］。因此，試鹵靈在生理pH范圍內(nèi)其光信號是穩(wěn)定的。

除了分析波長長、受樣品背景干擾少、水溶性和生物兼容性好等優(yōu)點外，試鹵靈及其衍生物還具有良好的細胞膜通透性和分散性［8，9］。更重要的是，試鹵靈分子中7－位酚羥基的取代作用通常會導致熒光猝滅、且顏色變淺（一般呈淡黃色），但當這些取代基與相關(guān)物質(zhì)作用而移除后，則又會釋放出試鹵靈，從而伴隨其顏色和熒光的恢復［2，8］。人們利用這一特性以及試鹵靈的其它優(yōu)點，通過在7－羥基上設置不同的識別單元，發(fā)展了一系列新的光信號打開型探針（圖1），并用于生物、環(huán)境等樣品中相關(guān)物質(zhì)的檢測與成像分析，取得了良好的效果。

圖1 試鹵靈類光學探針的響應Response of resorufin－based spectroscopic probe

2 檢測蛋白酶活性的試鹵靈類光學探針

蛋白酶可選擇性與其底物反應?；谶@一性質(zhì)，并借助多米諾消除反應等，通過合理設計識別單元并將其引入到試鹵靈的7－羥基，人們已成功發(fā)展了檢測單胺氧化酶、硝基還原酶、β－半乳糖苷酶、α－葡萄糖苷酶、β－內(nèi)酰胺酶、酯酶以及乙酰膽堿酯酶的高靈敏度光學探針。以下將分別給予簡要介紹。

單胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）是一種重要的腦疾病治療靶點。MAO可催化單胺（R－NH2）發(fā)生氧化脫氨反應，即在有氧參與下，MAO可催化單胺氧化，繼而生成相應的醛、氨和過氧化氫。Chang等［10］利用這一反應，合成了兩種試鹵靈類光學探針（1和2；圖2），并用于類神經(jīng)元細胞中單胺氧化酶的活性檢測。

圖2 單胺氧化酶光學探針1和2Spectroscopic probes 1 and 2 for MAO activity

硝基還原酶（nitroreductase）可利用還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）等作為電子供體，在缺氧條件下催化多種外源硝基芳香族化合物發(fā)生單電子轉(zhuǎn)移，生成硝基陰離子自由基，隨后進一步被還原生成氨基或羥胺。這一反應不僅用在藥物的激活和解毒研究中，還可用于光學探針的設計和實體瘤細胞缺氧狀況的檢測。最近，Ma等［11，12］以試鹵靈為母體，5－硝基呋喃、5－硝基噻吩作為底物，設計合成了兩種檢測硝基還原酶的光學探針3和4（圖3），其中探針4具有更低的背景信號（這是由于5－硝基噻吩表現(xiàn)出更強的猝滅效應）。這些探針本身熒光均很弱且?guī)缀鯚o色，但在NADH存在下，硝基還原酶可將探針中的硝基還原為氨基或羥胺，并發(fā)生1，6－重排與消除反應，從而釋放出試鹵靈熒光體，導致溶液熒光顯著增強、顏色由無色變成紫紅色。而且，這些探針對細胞中的不同還原性物質(zhì)（如谷胱甘肽、半胱氨酸，維生素C等）均無響應。據(jù)此特性，構(gòu)建了高靈敏度、高選擇性的檢測硝基還原酶的熒光分析法，并成功用于HeLa和A549細胞缺氧成像分析以及大腸桿菌生長過程中硝基還原酶的檢測。

圖3 探針3和4與硝基還原酶的反應機理Reaction mechanism of probes 3 and 4 with nitroreductase

β－半乳糖苷酶（β－galactosidase）是一種能將β－半乳糖苷水解為半乳糖和糖苷的酶。它還能催化β－D－半乳糖殘基的水解。Sernetz等［13］利用這一特性，發(fā)展了一種檢測β－半乳糖苷酶的熒光探針5（圖4）。該探針與β－半乳糖苷酶反應可釋放出強熒光的試鹵靈，從而可用于該酶的靈敏檢測。

圖4 β－半乳糖苷酶催化探針5的水解Hydrolysis of probe 5 byβ－galactosidase

α－葡萄糖苷酶（α－glucosidase）也是一類重要的水解酶，并參與生物體的糖代謝。如果人類和哺乳動物組織中α－葡萄糖苷酶缺失，就會引起龐貝氏癥（又稱酸性麥芽糖酵素缺乏癥），所以發(fā)展檢測α－葡萄糖苷酶的分析方法對于該類疾病的早期診斷非常重要。Zheng等［14］利用α－葡萄糖苷酶可以專一性水解糖類底物分子中的α－1，4糖苷鍵，設計合成了檢測該酶活性的熒光探針6（圖5）。該探針與酶作用同樣釋放出試鹵靈，伴隨反應體系的熒光增強?；谠摤F(xiàn)象，構(gòu)建了檢測α－葡萄糖苷酶活性的熒光分析法，并可用于該酶抑制劑的高通量篩選。

圖5 α－葡萄糖苷酶催化探針6的水解Hydrolysis of probe 6 byα－glucosidase

β－內(nèi)酰胺酶（β－lactamase）可以催化水解β－內(nèi)酰胺類抗生素的β－內(nèi)酰胺環(huán)，使其喪失抗菌活性。因此，β－內(nèi)酰胺酶的分析檢測對藥物研究以及疾病治療十分重要。Rao等［15］利用β－內(nèi)酰胺酶可水解β－內(nèi)酰胺環(huán)的反應，制備了檢測該酶活性的熒光探針7（圖6）。該探針已用于β－內(nèi)酰胺酶基因表達的成像分析與研究。

酯酶是人們研究的較多的一種水解酶，它能催化酯鍵的水解。最近，Ma等［8］和Raines等［16］分別發(fā)展了檢測羧酸酯酶的熒光探針8和9（圖7）；其中，探針8的熒光強度與酶的濃度在0．04～0．30U／mL的范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系，檢測限達到8．6×10－5U／mL，比現(xiàn)有的羧酸酯酶類探針更為靈敏。探針8和9與羧酸酯酶作用后，均能釋放出具有強熒光的試鹵靈，使體系的熒光得以恢復。這些探針已用于活細胞的熒光成像分析。

圖6 β－內(nèi)酰胺酶催化探針7的水解Hydrolysis of probe 7 byβ－lactamase

圖7 探針8和9的結(jié)構(gòu)Structures of probes 8 and 9

乙酰膽堿酯酶（AChE）可選擇性水解乙酰膽堿，生成膽堿和乙酸。該酶在神經(jīng)信號傳遞過程中扮演著重要的角色。Zhang等［17］利用串聯(lián)化學反應，發(fā)展了一種含有2，4－二硝基苯磺酸酯鍵識別單元的光學探針10，可用于AChE的活性檢測。當AChE濃度為0．001U／mL時，探針仍能產(chǎn)生明顯的響應。檢測體系由探針10和碘化乙酰硫代膽堿（ATC）的磷酸鹽緩沖溶液（pH 8）組成，反應機理如圖8所示。當AChE加入到該體系后，AChE會催化ATC生成硫代膽堿和乙酸；由于硫代膽堿分子含有巰基，可進一步與探針10發(fā)生反應并導致試鹵靈的釋放和反應體系的熒光恢復。然而，探針10受其它巰基物質(zhì)（如半胱氨酸和谷胱甘肽）的干擾。

3 檢測離子的試鹵靈類光學探針

圖8 探針10檢測乙酰膽堿酯酶的機理The detection mechanism of AChE activity by probe 10

以試鹵靈為熒光體，并借助選擇性水解切斷、保護－脫保護等化學反應，人們還發(fā)展了一些檢測金屬離子和陰離子的新型光學探針；其中，部分探針的分析性能與已有的探針相比得到了顯著改善。例如，設計Pb2＋的選擇性光學探針頗具挑戰(zhàn)性，因為過渡金屬離子經(jīng)常共存，且與通常的熒光試劑反應性能相近，彼此干擾嚴重。為克服此困難，Ma等［18］利用Pb2＋能選擇性催化水解磷酸二酯鍵的特性，以POCl3為橋聯(lián)劑，將試鹵靈熒光體與猝滅劑p－硝基苯酚聯(lián)接，制得了新的檢測Pb2＋的光學探針11（圖9）。該探針由于可發(fā)生分子內(nèi)光誘導電子轉(zhuǎn)移作用而導致熒光自猝滅，僅表現(xiàn)出較弱的熒光；然而，鉛離子的引入可選擇性催化探針中的磷酸酯鍵水解而斷裂，從而使試鹵靈得以釋放、熒光得到恢復。研究表明，在磷酸鹽緩沖溶液（pH 8）中，該探針對 Pb2＋的檢測限為22 nmol／L，且常見的各種堿土金屬與過渡金屬離子均無影響，對Pb2＋的選擇性很高。

Wei等［19］利用 Hg2＋可催化吡喃烯醇醚生成環(huán)己酮衍生物的重排反應（成碳環(huán)反應），設計合成了一種含有糖結(jié)構(gòu)單元的水溶性光學探針12（圖10）。在磷酸鹽緩沖溶液（pH 7．4）中，該探針與Hg2＋產(chǎn)生很高的選擇性光學響應（Ag＋及其它金屬離子均無此作用），反應在15min內(nèi)即可完成 ，對Hg2＋的 檢測限達0．1 5μmol／L。此 外，該探針還被用于A549細胞和斑馬魚中Hg2＋的熒光成像分析。

圖10 檢測Hg2＋的光學探針12Spectroscopic probe 12 for Hg2＋

最近，Kim 等［20］利用Pd2＋對炔丙基的識別作用，設計合成了探針13用于Pd2＋檢測（圖11）；反應是在含80%甲醇的磷酸鹽緩沖溶液（pH 7．4）中進行的。研究表明，在炔丙基醚的鄰位引入噻吩甲基胺單元后，能很好的提高探針與Pd2＋的反應速度。探針13對Pd2＋有很好的選擇性，對其它金屬離子無明顯響應，檢測限為0．05μmol／L。

Hong等［21］利用F－可選擇性切斷Si—O鍵的原理，設計合成了探針14（圖12）。該探針本身無熒光，但在含50%乙腈的水溶液中與F－反應后，生成了強熒光的試鹵靈，使體系的熒光得到恢復。探針對F－的選擇性良好，對 Cl－、Br－、I－、AcO－、H2PO4－、HSO4－、NO3－、N3－均無明顯響應。

圖11 探針13與PdCl2的反應機理Reaction mechanism of probe 13 with PdCl2

過硼酸鈉能直接引起有機體突變，并且過硼酸鈉或其它硼化合物對人體健康和環(huán)境的危害性已引起了人們的關(guān)注。因此，硼化合物的分析檢測十分重要。Ma等［22］利用過硼酸根離子（BO3－）的去硼化作用，發(fā)展了新型光學探針15（圖13）。該探針可對BO3－產(chǎn)生快速和靈敏的顯色及熒光響應。而且，該探針還可用于過氧化苯甲酰的檢測，即在含10%乙醇的KH2PO4－Na2HPO4緩沖溶液（20mmol／L，pH 7．4）中，探針15可與過氧化苯甲酰產(chǎn)生靈敏的光學響應，其中熒光分析的檢測限達23nmol／L。此外，該探針還用于發(fā)展過氧化苯甲酰快速檢測試劑盒，在面粉和抗菌劑等實際樣品中過氧化苯甲酰的檢測方面具有重要的應用前景。

Chang等［23］基于BO3－可選擇性切斷乙酸酯鍵的原理，利用商品化的探針16（圖14），實現(xiàn)了對BO3－的檢測。該探針本身無熒光，但在含10%乙腈的乙酸－乙酸鈉緩沖溶液（pH 4．8）中與BO3－反應后，生成了強熒光的試鹵靈，使體系的熒光恢復。該探針對BO3－有很好的選擇性，其它常見的陰離子均無明顯響應。

圖14 檢測BO3－的探針16Probe 16 for BO3－

探針17是借助乙酰丙酸基的保護－脫保護作用 而 設 計（圖1 5）。該 探 針 可 用 于SO32－的 檢測［24］。探針本身無熒光，但在含2%乙腈的4－羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液（pH 7）中與SO32－反應后，產(chǎn)生熒光反應，且其它常見陰離子均無明顯響應，對SO32－具有良好的選擇性。

圖15 探針17與SO32－的反應機理Reaction mechanism of probe 17 with SO32－

4 檢測活性氧物種的試鹵靈類光學探針

活性氧物種（ROS）是指具有高反應活性的含氧物種，包括過氧化氫、次氯酸、超氧陰離子、羥基自由基、單線態(tài)氧、一氧化氮、臭氧等［2，25］?；钚匝跷锓N在維持生物體的生理功能方面發(fā)揮著重要的作用。高于正常水平的活性氧物種會損傷蛋白質(zhì)、DNA等生物分子，進而導致疾病。因此，發(fā)展活性氧物種的高選擇性、高靈敏度光學探針與檢測方法，對疾病的預防、診斷和治療均具有重要意義。

Chang等［26］利用硼酸酯為識別單元，以試鹵靈為信號單元，設計合成了檢測過氧化氫的光學探針18（圖16）。該探針在4－羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液（pH 7）中只對過氧化氫有很好的熒光響應，而其它的活性氧物種幾乎不響應。熒光成像研究發(fā)現(xiàn)，該探針能用于活細胞內(nèi)過氧化氫的檢測。

圖16 檢測H2O2的探針18Probe 18 for H2O2

Milligan等［27］發(fā)展了一種檢測羥基自由基的探針19（圖17）。該探針可與羥基自由基反應生成強熒光的試鹵靈，因而可用于羥基自由基的檢測。

圖17 探針19與 ·OH的反應Reaction of probe 19 with·OH

臭氧（O3）是氧的同素異形體，也是活性氧物種之一。在大氣中，臭氧層可吸收太陽釋放出來的絕大部分紫外線，使動、植物免遭這種射線的危害，對地球生物具有重要的保護作用。另一方面，當環(huán)境中臭氧濃度偏高時，則成為環(huán)境污染氣體，也是PM2．5的組分之一，在殺滅細菌的同時也對人體細胞構(gòu)成損傷；在紫外燈、打印機旁，都應注意通風，避免臭氧濃度過高引起的毒性效應。換句話說，臭氧的檢測是一個重要的課題。然而，目前檢測臭氧的光學探針相對較少。Ma等［28］以試鹵靈作為光信號響應單元，以可與臭氧發(fā)生特異性加成反應的丁烯基作識別單元，設計合成了對臭氧具有高選擇性、高靈敏度的光信號打開型探針20（圖18）。該探針對臭氧的檢測限為0．056mg／m3，低于國際環(huán)境空氣質(zhì)量的標準（0．1mg／m3），目前已用于細胞中臭氧的熒光成像和空氣樣品中臭氧的分析測定。

圖18 探針20與O3的反應機理Reaction mechanism of probe 20 with O3

5 結(jié)論

綜上所述，由于試鹵靈的性能優(yōu)良，特別是其分子結(jié)構(gòu)中的7－位酚羥基的修飾通?？赦鐭晒?，目前該熒光體越來越受到人們的重視，并成為發(fā)展具有低背景光信號探針、進而實現(xiàn)相關(guān)分析物質(zhì)高靈敏檢測的有效途徑之一。預計今后該方面的研究熱點可能集中在以下兩方面：（1）對試鹵靈的結(jié)構(gòu)進行改造，合成出具有更多修飾位點的母體化合物，以用于該類光學探針的進一步發(fā)展。例如，可將分子結(jié)構(gòu)中的碳氮雙鍵進行還原，然后對形成的氨基進行化學修飾，來構(gòu)建相應的新型光學探針；（2）目前檢測活性氧物種的試鹵靈類光學探針報道較少，因此，設計合成此類物種的檢測探針有待于深入開展?？傊?，隨著更多的反應機理被發(fā)現(xiàn)，人們一方面將會不斷設計出新的試鹵靈類光學探針，另一方面通過改變現(xiàn)有的光學探針的反應和分析條件以擴大其應用范圍。

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