基于花菁的硫醇近紅外比率熒光探針

朱東建，江 華，2＊

（1．北京分子科學(xué)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院 化學(xué)研究所 光化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100190；2．北京師范大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，北京100875）

生物體內(nèi)的硫醇如半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）、谷胱甘肽（GSH）在生理和病理過程中起至關(guān)重要的作用［1－2］。細(xì)胞內(nèi)硫醇水平的改變與很多疾病密切相關(guān)。體內(nèi)缺乏半胱氨酸（Cys）會(huì)導(dǎo)致多種病癥，如兒童生長(zhǎng)緩慢，肝損傷和皮膚損傷等［3－5］。血液中同型半胱氨酸（Hcy）的濃度增加會(huì)導(dǎo)致維生素B12的缺失和老年癡呆癥［6－7］。谷 胱 甘 肽 （GSH）在 細(xì) 胞 內(nèi) 含 量 在 1 mmol／L到15mmol／L 之間［8］，是細(xì)胞內(nèi)最富裕的硫醇，在維持細(xì)胞的氧化還原動(dòng)態(tài)平衡中起著重要作用［9］。因此，檢測(cè)生物體系中硫醇含量具有非常重要的意義。

目前，用于檢測(cè)硫醇的方法有很多，如高效液相色譜法［10－11］、電化學(xué)法［12－13］、熒光法等。相比其他方法，熒光法由于具有選擇性好、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，因此，近年發(fā)展了許多檢測(cè)硫醇的熒光探針［14－20］。由于生物樣品基體的自身熒光波長(zhǎng)一般小于600nm［21］，而大多數(shù)探針的熒光發(fā)射波長(zhǎng)與生物樣品的背景熒光有重疊，因此極大地限制了這類熒光分析法靈敏度，而在近紅外熒光（λem＞600nm）光區(qū)，生物樣品基體光吸收或熒光強(qiáng)度很小，因而背景干擾大大降低。因此，發(fā)展近紅外硫醇探針是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的工作。目前有少量近紅外硫醇探針通過單個(gè)熒光信號(hào)強(qiáng)度的增加來達(dá)到檢測(cè)目的［22－23］，而熒光強(qiáng)度很容易受到其他因素（如樣品環(huán)境條件、探針濃度等）的影響，因此，此類探針并不能提供足夠的精度以進(jìn)行定量的檢測(cè)。具有自校正作用的、通過兩個(gè)波長(zhǎng)的變化指示識(shí)別過程的比率測(cè)量型熒光探針則能很好的實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)［24］。

本工作根據(jù)我們以前設(shè)計(jì)的近紅外比率熒光探針的原理［25］，設(shè)計(jì)合成了以七甲川花菁為熒光發(fā)色團(tuán)、二硫鍵為硫醇的特異性識(shí)別位點(diǎn)的硫醇近紅外比率熒光探針分子CySS。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器和主要試劑

UV－2500紫外－可見分光光度計(jì)（日本島津公司），F(xiàn)－4600熒光分光光度計(jì)（日本日立公司），Bruker AVANCE－400核磁共振儀（美國(guó) Bruker公司），APEXII型FT－ICR質(zhì)譜儀（美國(guó)Bruker公司），F(xiàn)V－1000共聚焦顯微鏡（日本 Olympus）。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中所用NIH 3T3細(xì)胞（鼠成纖維細(xì)胞），標(biāo)準(zhǔn)PBS緩沖液購(gòu)于協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞中心；培養(yǎng)基DMEM（Hyclone，American），標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清FBS（Hyclone，American），雙抗（青霉素，鏈霉素；Hyclone，American）購(gòu)于北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。培養(yǎng)基的配置：DMEM溶液，10%的FBS，1%的雙抗，搖勻，4℃保存。

所有合成原料與溶劑均為市售分析純。半胱氨酸，同型半胱氨酸，谷胱甘肽，二硫蘇糖醇（DTT），2－氨基乙硫醇（2－AET），2－巰基乙酸（2－MEA），葡 萄 糖 （Glu），丙 氨 酸 （Ala），纈 氨 酸（Val），絲氨酸（Ser），組氨酸（His），亮氨酸（Leu），賴氨酸（Lys），2－氨基乙酸（2－AEA），KCl，NaCl，CaCl2，MgSO4溶解在超純水中制得溶液。柱色譜硅膠為煙臺(tái)化學(xué)工業(yè)研究所產(chǎn)品（200～300目）。

1．2 吸收光譜與熒光光譜測(cè)定方法

探針CySS溶于DMSO配制成濃度為2．0 mmol／L的溶液，并于4℃下保存；紫外可見及熒光光譜均在緩沖溶液（100mmol／L HEPES，100 mmol／L NaCl，pH ＝7．4，DMSO∶水＝5∶95（體積比））中測(cè)定；熒光量子產(chǎn)率的測(cè)定以Cardiogreen在 DMSO（Φ＝0．13）作為熒光標(biāo)準(zhǔn)物［26］。

1．3 細(xì)胞培養(yǎng)及成像方法

NIH 3T3細(xì)胞以配置好的DMEM 培養(yǎng)基（10%FBS，1% 雙抗），在25cm3的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每?jī)商鞊Q一次新鮮的培養(yǎng)基；將細(xì)胞培養(yǎng)在35mm適合倒置共聚焦熒光顯微鏡測(cè)試的表面皿中，孵化48h，細(xì)胞貼壁狀態(tài)良好后，在做成像實(shí)驗(yàn)前更換為無血清、無雙抗的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行染色。

在共聚焦顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞熒光成像實(shí)驗(yàn)前，吸出培養(yǎng)基并用PBS沖洗三次，再加入1mL PBS。激發(fā)波長(zhǎng)為635nm，熒光收集窗口700～770nm和780～800nm。

1．4 CySS的合成

CySS的合成路線如圖1所示。

圖1 CySS的合成路線和可能的反應(yīng)機(jī)理The synthetic route of CySS and the possible reaction mechanism for thiols

在三口瓶中加入1．59g（15mmol）無水碳酸鈉，高溫除水后冷卻到室溫，抽換氣三次后，在氬氣保護(hù)下加入5mL無水甲苯，冰浴至0℃左右，滴加888．72mg（3mmol）三光氣的甲苯溶液，滴加完攪拌15min，滴加294mg（1．5mmol）1［27］的甲苯溶液，滴加完緩慢升至室溫反應(yīng)3h后，用氬氣趕走剩余的光氣后，過濾抽干后，將其用10 mL無水二氯甲烷溶解，低溫緩慢滴加到170mg（0．25mmol）CyN［25］和0．75mL （4．5mmol）N，N′－二異丙基乙胺（DIEA）的二氯甲烷溶液中，加完緩慢升至室溫反應(yīng)過夜，TLC檢測(cè)有產(chǎn)物生成。反應(yīng)完畢后用1mol／L鹽酸洗兩次，飽和氯化鈉液洗一次，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾旋干后，用硅膠色譜柱提純得到綠色目標(biāo)化合物CySS 45mg。產(chǎn)率20%。1HNMR （400MHz，CD2Cl2）：7．42～7．37（m，6H），7．35～7．31（t，J＝7．2Hz，2H），7．29～7．27（d，J＝7．6Hz，2H），7．25～7．22（t，J＝7．2Hz，3H），7．19～7．17（d，J＝8．0 Hz，2H），6．10～6．06（d，J＝14．0Hz，2H），4．76（s，2H），4．27～4．24（t，J＝6．4Hz，2H），4．19～4．16（t，J＝6．4Hz，2H），3．60（s，6H），2．81～2．76（m，5H），2．59～2．53（m，3H），2．07～2．04（m，2H），1．96（s，3H），1．26（s，12H）。13CNMR（400MHz，CD2Cl2）：172．63，170．69，155．84，154．67，143．21，142．43，141．13，136．97，130．81，129．14，128．94，128．69，128．31，125．36，122．30，111．05，101．54，64．24，62．35，55．75，49．25，37．83，37．59，32．08，28．18，27．72，25．35，21．12，20．85。HRMS（ESI）for C46H54N3O4S2＋（［M－I］＋）：calcd：776．35503，found：776．35385。

2 結(jié)果與討論

2．1 探針CySS對(duì)半胱氨酸的識(shí)別

圖2 CySS加入半胱氨酸的紫外（a）和熒光（b）光譜（a）Absorption spectra of CySS（1μmol／L）0，15，30，45，60，90and 120min after addition of Cys（2mmol／L）．（b）Fluorescence spectra of CySS（2μmol／L）every 5min within 2hafter addition of Cys（3mmol／L），λex＝ 676nm

如圖 2（a）所示，1μmol／L CySS在 HEPES緩沖液中的最大吸收峰大約在785nm（ε＝1．81×105L·mol－1·cm－1），向該緩沖溶液中加入2 mmol／L的半胱氨酸后，我們可以觀察到，隨著時(shí)間的變化785nm處的吸收強(qiáng)度減弱，與之同時(shí)在645nm處一個(gè)新的吸收峰不斷增強(qiáng)，與CyN在HEPES緩沖液中的最大吸收峰一樣［25］，而且兩者之間的吸收波長(zhǎng)相差達(dá)到140nm。這些數(shù)據(jù)表明，當(dāng)半胱氨酸加入到該反應(yīng)體系后，探針分子CySS上面的二硫鍵與半胱氨酸反應(yīng)，并且經(jīng)過分子內(nèi)進(jìn)攻反應(yīng)使酰胺鍵斷裂釋放出產(chǎn)物分子CyN，與我們提出的反應(yīng)機(jī)理一致（如圖1所示）。同時(shí)，我們也研究了熒光發(fā)射光譜的變化情況，如圖2（b）所示，用676nm 激發(fā)，2mol／L CySS在HEPES緩沖液中的最大熒光發(fā)射峰大約在808 nm （Φ＝0．035），向該緩沖溶液中加入3mmol／L的半光氨酸后，我們可以觀察到，隨著時(shí)間的變化808nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度逐漸減弱，與之同時(shí)在747nm處一個(gè)新的熒光發(fā)射峰不斷增強(qiáng)，與CyN在HEPES緩沖液中的最大熒光發(fā)射峰相同［25］，而且兩者之間的吸收波長(zhǎng)相差達(dá)到61nm，并且在793nm處產(chǎn)生一個(gè)等發(fā)射點(diǎn)。熒光發(fā)射光譜的變化同樣證明了上述反應(yīng)機(jī)理。

2．2 探針CySS對(duì)硫醇的選擇性識(shí)別

CySS對(duì)硫醇有選擇性識(shí)別的效果。我們向2 μmol／L CySS的HEPES緩沖溶液中分別加入3 mmol／L各種巰基化合物，包括半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫蘇糖醇、2－氨基乙硫醇、2－巰基乙酸，2h后對(duì)其熒光光譜進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果表明，747nm和808nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度之間的比率（F747nm／F808nm）發(fā)生了明顯變化，反應(yīng)前后比率（F747nm／F808nm）從0．06變化到2．9～4．3，分別由圖3（a）灰黑條表示。而其它不含巰基的氨基酸（丙氨酸、纈氨酸、絲氨酸、組氨酸、亮氨酸、賴氨酸）、葡萄糖、2－氨基乙酸和常見的金屬離子（K＋、Na＋、Ca2＋、Mg2＋）3mmol／L，反應(yīng)2h都沒有引起明顯的熒光發(fā)射強(qiáng)度比率（F747nm／F808nm）上的改變，如圖3（b）灰條所示。然后再當(dāng)向其中加入3mmol／L半胱氨酸反應(yīng)2h，熒光發(fā)射強(qiáng)度比率（F747nm／F808nm）仍可以看到明顯變化，并且與直接加入3mmol／L半胱氨酸的比率值接近，如圖3（b）黑條所示，說明上述化合物對(duì)檢測(cè)硫醇沒有影響。上述結(jié)果說明，探針分子CySS在近紅外區(qū)域?qū)α虼季哂袠O好的化學(xué)選擇性。

圖3 CySS的化學(xué)選擇性（a）Fluorescence responses of CySS toward various thiols．The gray and black bars represent emission intensity ratios F747nm／F808nmof CySS（2μmol／L）before and 120min after addition of the thiols（3mmol／L），respectively．（b）Fluorescence responses of CySS toward other analytes．The gray and black bars represent emission intensity ratios F747nm／F808nm of CySS（2μmol／L）120min after addition of various analytes（3mmol／L）and further 120min after addition of Cys（3mmol／L），respectively．λex＝676nm

2．3 pH對(duì)CySS和CyN的影響

在生理pH范圍6～8內(nèi)，CySS在808nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度和CyN在747nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度幾乎不受pH的影響，如圖4（a）所示；它們的比率（F747nm／F808nm）也同樣都不受pH的影響，如圖4（b）所示。也就是說，在生理范圍內(nèi)，CySS對(duì)硫醇的比率測(cè)量型檢測(cè)并不受到酸堿環(huán)境改變的影響。

2．4 CySS在細(xì)胞成像中的應(yīng)用

對(duì)CySS在水溶液中的應(yīng)用做了上述研究之后，我們接下來將它應(yīng)用到活細(xì)胞成像中。如圖5所示，將 NIH 3T3細(xì)胞用10μmol／L CySS在37℃下培養(yǎng)30min后，我們發(fā)現(xiàn)，CySS具有良好的細(xì)胞膜穿透性，已經(jīng)滲透到細(xì)胞內(nèi)部，并且700～770nm熒光發(fā)射窗口和長(zhǎng)波窗口780～800nm處都有熒光（圖5上部）；當(dāng)NIH 3T3細(xì)胞用500 μmol／L硫 辛 酸 培 養(yǎng) 一 天 后，再 用 10μmol／L CySS在37℃下培養(yǎng)30min后，進(jìn)行成像實(shí)驗(yàn)，在窗口700～770nm處觀察到熒光有明顯的增強(qiáng)（圖5中部）；這與以前文獻(xiàn)報(bào)道的硫辛酸會(huì)使細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽濃度增加結(jié)果一致［28］；當(dāng)NIH 3T3細(xì)胞用100μmol／L N－乙基馬來酰亞胺（NEM）培養(yǎng)30min后，再用10μmol／L CySS在37℃下培養(yǎng)30min進(jìn)行成像實(shí)驗(yàn)，在窗口700～770nm處觀察到熒光明顯減弱（圖5底部），這是因?yàn)镹EM作為硫醇的清除劑［29］，使細(xì)胞內(nèi)硫醇濃度降低所致。這說明CySS熒光發(fā)射的變化確實(shí)為細(xì)胞內(nèi)的硫醇濃度變化所引起，而且通過對(duì)兩個(gè)監(jiān)測(cè)窗口做比率圖像，我們可以更加直觀、靈敏地檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)硫醇濃度的變化。因此，CySS可以成功應(yīng)用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的硫醇濃度的變化，具有很好的應(yīng)用前景。

圖4 pH對(duì)CySS和CyN兩個(gè)波長(zhǎng)熒光強(qiáng)度（a）和比率（b）的影響（a）Effect of pH on fluorescence intensity at 747nm for CyN and 808nm for CySS．（b）Effect of pH on fluorescence intensity ratio of F747nm／F808nmfor CyN and CySS．λex＝ 676nm

圖5 將CySS用于NIH 3T3細(xì)胞中硫醇成像實(shí)驗(yàn)（a）明場(chǎng)圖像；（b）700～770nm熒光發(fā)射窗口的熒光信號(hào)；（c）780～800nm熒光發(fā)射窗口的熒光信號(hào)；（d）圖（b）與（c）的比率圖像Confocal fluorescence images of intracellular thiols in NIH 3T3cells with CySS（a）Bright－field transmission images．（b）Fluorescence images with emission collected at 700－770nm．（c）Fluorescence images with emission collected at 780－800nm．（d）Ratiometric images generated from （b）and（c）

3 結(jié)論

本文基于硫醇與二硫鍵的選擇性反應(yīng)，設(shè)計(jì)合成了以七甲川花菁為熒光發(fā)色團(tuán)的硫醇近紅外比率熒光探針CySS，并對(duì)其性質(zhì)和應(yīng)用做了詳細(xì)深入的研究。探針分子CySS具有靈敏度高，選擇性好，且不受pH影響等優(yōu)點(diǎn)，被成功應(yīng)用到細(xì)胞內(nèi)硫醇的檢測(cè)。

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