DNA中甲基、羥甲基、醛基與羧基胞嘧啶的化學(xué)檢測方法進(jìn)展

肖 珩，田 沺，周 翔

（武漢大學(xué) 化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢430072）

在表觀遺傳學(xué)上，胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5－甲基胞嘧啶（5－methylcytosine，5mC）形式的 DNA 甲基化作為一種特殊的表觀遺傳修飾，在包括基因表達(dá)調(diào)控、組蛋白修飾、染色體重組、發(fā)育調(diào)節(jié)和疾病發(fā)病機(jī)制在內(nèi)的一系列生命活動(dòng)中扮演著十分關(guān)鍵的調(diào)控作用［1］。維持DNA甲基化和去甲基化過程中DNA甲基化程度的動(dòng)態(tài)平衡對哺乳動(dòng)物的生長發(fā)育至關(guān)重要［2］。目前，研究人員在包括癌癥在內(nèi)的許多疾病中均有發(fā)現(xiàn)不同程度的DNA甲基化失衡［3］。在細(xì)胞分裂過程中，DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶家族（DNA methyltransfereases，DNMTs）能夠催化未甲基化的胞嘧啶進(jìn)行甲基化，形成5－甲基胞嘧啶。因此，DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶能夠影響DNA甲基化的程度。然而，DNA甲基化的狀態(tài)在細(xì)胞中并不是恒定不變的，而是在不同的發(fā)展階段與去甲基化過程保持一個(gè)可逆變化。去甲基化現(xiàn)象并非僅僅局限在DNA復(fù)制時(shí)期［4，5］，去甲基化的方式在多年來也存在較多爭議。2009年，N．Heintz課題組報(bào)道了5－羥甲基胞嘧啶（5－h(huán)ydroxymethylcytosine，5hmC）存在于哺乳動(dòng)物的基因組DNA中［6］。與此同時(shí)，A．Rao課題組報(bào)道了 TET（ten－eleven－translocation，10－11易位）家族的氧化酶能夠催化5－甲基胞嘧啶形成5－羥甲基胞嘧啶［7］。羥甲基胞嘧啶作為去甲基化過程中的重要因素開始引起了越來越多的關(guān)注。

2011 年，5－醛 基 胞 嘧 啶 （5－Formylcytosine，5fC）和5－羧基胞嘧啶（5－Carboxylcytosine，5caC）作為TET蛋白酶氧化5－甲基胞嘧啶形成的更高級別的氧化產(chǎn)物開始被發(fā)現(xiàn)和逐漸了解［8－10］。研究人員發(fā)現(xiàn)，TET蛋白酶不僅能夠催化甲基胞嘧啶形成羥甲基胞嘧啶，還能將甲基胞嘧啶氧化為醛基胞嘧啶和羧基胞嘧啶的形式，而醛基胞嘧啶和羧基胞嘧啶可以被胸腺嘧啶DNA糖苷酶（thymine DNA glycosylase，TDG）特異性地識別并切割。研究人員不僅在小鼠胚胎干細(xì)胞和小鼠器官中發(fā)現(xiàn)了醛基胞嘧啶和羧基胞嘧啶，還通過TET蛋白表達(dá)調(diào)控和TDG酶敲除等實(shí)驗(yàn)證實(shí)了體內(nèi)主動(dòng)去甲基化進(jìn)程的存在。至此，整個(gè)DNA的主動(dòng)去甲基化機(jī)制開始建立并逐步完善（圖1）。

圖1 DNA甲基化與去甲基化的全過程Process of DNA methylation and demethylation

甲基胞嘧啶、羥甲基胞嘧啶、醛基胞嘧啶和羧基胞嘧啶作為整個(gè)DNA甲基化和去甲基化的過程中的重要中間體形式，在整個(gè)生命活動(dòng)中發(fā)揮著十分關(guān)鍵的作用。因此，無論是對于基礎(chǔ)表觀遺傳學(xué)研究，還是對于包括癌癥在內(nèi)的許多疾病的前期診斷，檢測實(shí)際樣品中這些特殊堿基的分布和含量都具有極為重要的意義，我們曾對甲基化DNA檢測的方法作過綜述［11］。本文將結(jié)合本課題組近些年來在DNA甲基胞嘧啶、羥甲基胞嘧啶、醛基胞嘧啶和羧基胞嘧啶檢測方面的工作，小結(jié)和綜述化學(xué)方法檢測這些特殊胞嘧啶的最新研究進(jìn)展。

1 5－甲基胞嘧啶（5mC）的化學(xué)檢測

在DNA甲基化的檢測工作中，亞硫酸氫鈉法發(fā)揮著舉足輕重的作用。研究人員發(fā)現(xiàn)［12，13］，在經(jīng)過亞硫酸氫鈉磺化、水解脫去氨基和堿化去除亞硫酸根離子等一系列過程之后，正常的胞嘧啶會(huì)很快轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（uridine，U），而5－甲基胞嘧啶雖然也能夠相應(yīng)地轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶（thymidine，T），但反應(yīng)速率卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于前者（圖2）。亞硫酸氫鈉法測序（bisulfite sequencing，BS－Seq）（圖3）正是利用兩者在反應(yīng)速率上的差異，通過對亞硫酸氫鈉法處理后的樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，達(dá)到準(zhǔn)確區(qū)分胞嘧啶和甲基胞嘧啶的目的。時(shí)至今日，亞硫酸氫鈉法測序已成為一種十分普及的檢測5－甲基胞嘧啶的方法，并已達(dá)到全基因組測序的水平［14，15］。

盡管亞硫酸氫鈉法測序已作為一種檢測甲基胞嘧啶的有效方法被廣泛使用，但其本身依然存在著操作復(fù)雜和成本高昂的缺點(diǎn)。因此，越來越多的研究人員開始尋求利用更方便快捷的化學(xué)方法來解決甲基胞嘧啶檢測的問題。為了解決DNA序列中5－甲基胞嘧啶的位點(diǎn)檢測以及定量檢測的問題，我們設(shè)計(jì)并合成了兩種N－鹵代－硝基苯磺酰胺鈉鹽的化合物（化合物1和2），用于DNA序列中甲基胞嘧啶的檢測［17］。

圖4 N－鹵代－硝基苯磺酰胺鈉鹽的化合物1和2的結(jié)構(gòu)式［17］Structures of the compound 1 and 2

由于5－甲基胞嘧啶和胞嘧啶的嘧啶環(huán)上雙鍵的親核性以及空間位阻上存在著差異，本課題組選取了兩種親核試劑：N－氯代－硝基苯磺酰胺鈉鹽和N－溴代－硝基苯磺酰胺鈉鹽（化合物1和2）。這兩種化合物均可以進(jìn)攻胞嘧啶嘧啶環(huán)上的雙鍵，形成鹵代胞嘧啶。但是只有N－溴代－硝基苯磺酰胺鈉鹽（化合物2）可以進(jìn)攻5－甲基胞嘧啶，形成溴代甲基胞嘧啶（圖5）。

利用這兩種化合物對5－甲基胞嘧啶和胞嘧啶親核進(jìn)攻的差異性，通過結(jié)合聚丙烯酰胺電泳實(shí)驗(yàn)，便可以準(zhǔn)確地檢測DNA序列中5－甲基胞嘧啶的數(shù)量和分布。相比于傳統(tǒng)的亞硫酸氫鈉法，該方法操作簡便快捷、成本低廉、毒性低。同時(shí)，該方法克服了許多化學(xué)檢測方法存在的不能同時(shí)檢測DNA序列中多個(gè)5－甲基胞嘧啶殘基分布的問題，為5－甲基胞嘧啶的檢測提供了一種簡單可靠的方法。此研究對于尋找更有效檢測5－甲基胞嘧啶的化學(xué)方法具有重要的參考價(jià)值。

圖5 5－甲基胞嘧啶檢測的路線圖Process of 5mC detection

除此之外，通過利用β－糖基轉(zhuǎn)移酶（β－glucosyl transferase，βGT）將糖環(huán)轉(zhuǎn)移到DNA序列中的5－羥甲基胞嘧啶的羥基上，進(jìn)而增加5－羥甲基胞嘧啶的空間位阻，可以成功地區(qū)分5－羥甲基胞嘧啶和5－甲基胞嘧啶。這也從另一方面驗(yàn)證了先前對實(shí)驗(yàn)中反應(yīng)機(jī)理的推斷，在糖基轉(zhuǎn)移酶對5－羥甲基胞嘧啶進(jìn)行作用之后，5位上的羥基由于被糖環(huán)所保護(hù)，空間位阻增大導(dǎo)致在隨后的反應(yīng)中無法形成溴鎓離子中間體。因此，該方法還解決了包括亞硫酸氫鈉法在內(nèi)的許多傳統(tǒng)方法對DNA鏈上5－羥甲基胞嘧啶和5－甲基胞嘧啶難以辨別的問題，有效地排除了5－甲基胞嘧啶檢測中5－羥甲基胞嘧啶的干擾。為人們深入了解胞嘧啶與5－甲基胞嘧啶在化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上的差異，進(jìn)而通過化學(xué)手段檢測5－甲基胞嘧啶提供了一種新的思路。

尿嘧 啶－DNA 糖 基 化 酶（Uracil－DNA glycosylase，UDG）能夠選擇性地去除DNA上的尿嘧啶，進(jìn)而阻止突變發(fā)生。整個(gè)過程包括N－糖苷鍵的切割和堿基修復(fù)的啟動(dòng)（base－excision repair，BER）［18］。本課題組的研究人員利用UDG酶的這一特點(diǎn)，再結(jié)合亞硫酸氫鈉法，設(shè)計(jì)出了一種能夠有效識別DNA鏈上5－甲基胞嘧啶位點(diǎn)的方法［19］。首先，通過亞硫酸氫鈉法將未甲基化的胞嘧啶C脫氨基化，轉(zhuǎn)化為尿嘧啶U，再通過UDG酶將DNA鏈上的尿嘧啶切除，形成嘧啶缺失的位點(diǎn)（apyrimidinic site，AP位點(diǎn)），然后在堿性條件下處理，DNA鏈上堿基缺失的位點(diǎn)會(huì)被切割（圖6）。與此同時(shí)，5－甲基胞嘧啶所在的位點(diǎn)依然維持不變，不能被UDG酶切割。因此，通過聚丙烯酰胺電泳實(shí)驗(yàn)對比即可檢測出5－甲基胞嘧啶的位點(diǎn)。

圖6 利用亞硫酸氫鈉法和UDG酶檢測5－甲基胞嘧啶的路線圖Combined bisulfite UDG assay for 5mC detection

該方法將UDG酶與亞硫酸氫鈉法結(jié)合起來，將UDG酶運(yùn)用到DNA鏈上5－甲基胞嘧啶分布位點(diǎn)的檢測中，取得了準(zhǔn)確可靠的結(jié)果。該研究為表觀遺傳學(xué)上5－甲基胞嘧啶的檢測提供了新的視角，并有望在將來運(yùn)用到基因組DNA中5－甲基胞嘧啶的分布位置及含量的檢測中。

5－甲基胞嘧啶作為哺乳動(dòng)物基因組中除腺嘌呤（adenine）、胸腺嘧啶（thymine）、胞嘧啶（cytosine）及鳥嘌呤（guanine）之外的第五種堿基，在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著非常重要的作用。由于5－甲基胞嘧啶與胞嘧啶在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上高度相似，對于基因組中5－甲基胞嘧啶的檢測工作存在著許多困難?；瘜W(xué)方法由于可控性和選擇性強(qiáng)的特點(diǎn)，能夠通過合適的化學(xué)反應(yīng)有效地區(qū)分5－甲基胞嘧啶和胞嘧啶。相信在未來的研究中，會(huì)有越來越多的化學(xué)方法被運(yùn)用到5－甲基胞嘧啶的檢測工作中。

2 5－羥甲基胞嘧啶（5hmC）的化學(xué)檢測

在整個(gè)TET系列蛋白酶調(diào)控的5－甲基胞嘧啶的氧化過程中，5－羥甲基胞嘧啶（5hmC）扮演著重要的角色。近年，已經(jīng)陸續(xù)有報(bào)道在神經(jīng)元細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了5－羥甲基胞嘧啶［8－10］。越來越多的資料顯示，5－羥甲基胞嘧啶在表觀遺傳學(xué)上具有十分重要的作用，5－羥甲基胞嘧啶的分布和含量已經(jīng)開始被作為許多癌癥疾病診斷的重要標(biāo)志之一［20，21］。因此，5－羥甲基胞嘧啶的檢測逐漸成為表觀遺傳學(xué)上的一大熱點(diǎn)。

然而，伴隨著5－羥甲基胞嘧啶被發(fā)現(xiàn)和認(rèn)知，一個(gè)新的問題開始顯現(xiàn)出來：傳統(tǒng)的亞硫酸氫鈉法測序無法區(qū)分5－甲基胞嘧啶和5－羥甲基胞嘧啶［22，23］。Hayatsu課題組曾 經(jīng)報(bào)道［24］，在 經(jīng)過亞硫酸氫鈉處理之后，5－羥甲基胞嘧啶（5hmC）會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)?－亞甲基磺酸鹽形式的胞嘧啶（cytosine 5－methylenesulfonate，CMS）（圖7），這種磺酸鹽形式的胞嘧啶的脫氨基速率比甲基胞嘧啶更慢。在經(jīng)過PCR信號擴(kuò)增之后，5－羥甲基胞嘧啶位置的測序結(jié)果也會(huì)顯示為胞嘧啶。因此，傳統(tǒng)的亞硫酸氫鈉法測序并不能完整地反映基因組中各種堿基的真實(shí)分布情況，人們迫切需要尋找新的方法來解決5－羥甲基胞嘧啶檢測的問題。

圖7 亞硫酸氫鈉法處理5－羥甲基胞嘧啶［24］Bisulfite treatment of 5hmC

He Chuan課題 組 發(fā) 現(xiàn)［25］，和5－甲 基 胞嘧 啶一樣，5－羧基胞嘧啶（5－Carboxylcytosine，5caC）在亞硫酸氫鈉法測序中會(huì)顯示為胸腺嘧啶T。因此，研究人員通過利用β－糖基轉(zhuǎn)移酶（β－glucosyl transferase，βGT）將糖環(huán)轉(zhuǎn)移到5－羥甲基胞嘧啶的5位羥甲基上，將5－羥甲基胞嘧啶保護(hù)起來，然后利用過量的TET氧化酶將5－甲基胞嘧啶氧化為5－羧基胞嘧啶。在經(jīng)過β－糖基轉(zhuǎn)移酶和TET氧化酶處理之后，在最終的亞硫酸氫鈉法測序結(jié)果中，5－甲基胞嘧啶處被顯示為胸腺嘧啶T，而5－羥甲基胞嘧啶被顯示為胞嘧啶C。這樣，通過與原先的亞硫酸氫鈉法測序做對比，即可識別出5－甲基胞嘧啶和5－羥甲基胞嘧啶殘基的分布位點(diǎn)。這種TET協(xié)同的亞硫酸氫鈉法測序（Tet－assisted bisulfite sequencing，TAB－Seq）有效解決了傳統(tǒng)方法無法區(qū)分5－甲基胞嘧啶和5－羥甲基胞嘧啶的問題，并達(dá)到了基因組中5－羥甲基胞嘧啶測序的水平，為實(shí)際樣本中5－羥甲基胞嘧啶的檢測提供了一種非?？煽康姆椒?。

雖然酶具有高選擇性和高反應(yīng)活性等眾多優(yōu)點(diǎn)，但其本身存在的難以表達(dá)及成本過高的問題限制了其使用范圍，許多研究人員開始尋求合適的化學(xué)方法來檢測5－羥甲基胞嘧 啶 。2 0 1 2 年 ，Balasubramanian課 題 組 發(fā) 現(xiàn)KRuO4可以選擇性地將5－羥甲基胞嘧啶氧化為5－醛 基 胞 嘧 啶（5fC），且 具 有 很 高 的 產(chǎn)率［26］。經(jīng) 過 KRuO4氧 化 處 理 后，5－羥 甲 基 胞嘧啶會(huì)轉(zhuǎn)化為5－醛基胞嘧啶，在最后的測序結(jié)果中顯示為胸腺嘧啶T，而5－甲基胞嘧啶則顯示為胞嘧啶C。這種氧化亞硫酸氫鈉測序 （oxidative bisulfite sequencing，oxBS－Seq）不僅成功地解決了5－羥甲基胞嘧啶檢測的問題，還為化學(xué)手段檢測DNA甲基化分布提供了新的思路。KRuO4選擇性氧化5－羥甲基胞嘧啶成為5－醛基胞嘧啶這一特性被廣泛運(yùn)用到許多檢測方法中。

近些年來，研究人員發(fā)明了許多檢測5－羥甲基胞嘧啶的方法，包括糖基轉(zhuǎn)移酶實(shí)驗(yàn)［27－29］、過氧鎢酸鹽氧化［30］、基于TET蛋白的亞硫酸氫鈉測序［25］和基于高釕酸鉀氧化的亞硫酸氫鈉測序［26］等。然而，這些方法均需要酶催化或者重金屬離子作用，難以避免會(huì)引起成本過高、操作復(fù)雜以及重金屬帶來的高毒性的問題，人們開始尋求一些低成本和低毒性的檢測方法。

我們設(shè)計(jì)并合成了一類帶有苯甲醛結(jié)構(gòu)的探針，用于檢測5－羥甲基胞嘧啶［31］?？紤]到5－羥甲基胞嘧啶在嘧啶環(huán)上同時(shí)擁有羥甲基（C5－CH2OH）和氨基（C4－NH2），研究人員發(fā)現(xiàn)擁有苯甲醛的化合物能夠與5－羥甲基胞嘧啶反應(yīng)生成帶有1，3－O，N－雜環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物。因此，通過設(shè)計(jì)同時(shí)帶有苯甲醛結(jié)構(gòu)和熒光基團(tuán)的探針（化合物3和4），可以選擇性地與5－羥甲基胞嘧啶反應(yīng)（圖8），并伴隨有熒光信號的相應(yīng)，從而達(dá)到特異性檢測5－羥甲基胞嘧啶的目的。該方法為化學(xué)手段解決5－羥甲基胞嘧啶檢測的問題提供了一種嶄新的思路，且具有廉價(jià)易得、操作方便、毒性低和選擇性高等優(yōu)點(diǎn)，在未來5－羥甲基胞嘧啶的檢測工作中具有潛在的應(yīng)用。但是，令人遺憾的是，研究人員并沒有將上述方法進(jìn)一步運(yùn)用到對DNA鏈上的5－羥甲基胞嘧啶以及實(shí)際樣品中的5－羥甲基胞嘧啶的檢測中。

圖8 帶有苯甲醛結(jié)構(gòu)的探針與5－羥甲基胞嘧啶反應(yīng)的路線圖Reaction of 5hmC with benzaldehyde derivatives probes

由于5－羥甲基胞嘧啶在表觀遺傳學(xué)上的關(guān)鍵作用，基因組DNA中的5－羥甲基胞嘧啶分布的定量檢測工作顯得尤為重要。Balasubramanian課題組曾發(fā)現(xiàn)KRuO4能選擇性地氧化5－羥甲基胞嘧啶為5－醛基胞嘧啶［26］。相對于5－羥甲基胞嘧啶，5－醛基胞嘧啶具有更強(qiáng)的反應(yīng)活性。因此，本課題組研究人員利用KRuO4將5－羥甲基胞嘧啶定量地氧化為5－醛基胞嘧啶，再通過加入羥胺類熒光探針對氧化形成的5－醛基胞嘧啶進(jìn)行熒光標(biāo)記。最后，在整個(gè)反應(yīng)體系中加入陽離子共軛聚合物（CCP），使羥胺熒光基團(tuán)與陽離子共軛聚合物（CCP）之間形成FRET效應(yīng)（熒光能量共振轉(zhuǎn)移效應(yīng)）。由于陽離子共軛聚合物（CCP）具有光捕獲效應(yīng)（light harvesting）強(qiáng)、Stokes位移大和視覺信號增強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，羥胺熒光基團(tuán)與陽離子共軛聚合物（CCP）之間形成的FRET效應(yīng)能夠使熒光基團(tuán)產(chǎn)生的熒光信號大大增強(qiáng)。因此，本課題組通過結(jié)合KRuO4氧化、熒光探針標(biāo)記、陽離子共軛聚合物的FRET效應(yīng)，成功設(shè)計(jì)出一種能夠在基因組DNA中定量地檢測5－羥甲基胞嘧啶含量的方法（圖9）。該方法能夠成功檢測出實(shí)際樣品中基因組DNA中的5－羥甲基胞嘧啶的含量，為基因組DNA中的5－羥甲基胞嘧啶分布的定量檢測工作提供了一種簡單有效的新方法，為實(shí)際樣品中5－羥甲基胞嘧啶的檢測提供了更多的選擇。同時(shí)，該方法還為許多相關(guān)工作的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供了重要的參考依據(jù)。

在DNA甲基化的研究中，5－甲基胞嘧啶和5－羥甲基胞嘧啶的檢測引起了廣泛的關(guān)注。與此同時(shí)，5－羥甲基尿嘧啶（5－h(huán)mdU）作為 DNA 氧化損傷的形式之一，同樣引起了研究人員極大的興趣［33，34］。Zora課題組曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)，血液中5－羥甲基尿嘧啶的含量與乳腺癌密切相關(guān)，可以作為乳腺癌檢測的標(biāo)志物［35］。然而，目前對5－羥甲基尿嘧啶檢測的研究工作還十分有限［36］。

我們報(bào)道了一種檢測5－羥甲基尿嘧啶的簡單有效的方法［37］。研究人員發(fā)現(xiàn)，在三氟乙酸的作用下，5－羥甲基尿嘧啶C－5位上的羥基能夠選擇性地與疊氮化鈉作用，生成5－疊氮甲基尿嘧啶（5－aedU）。利用這一特性，通過加入帶炔基的熒光探針，可以與5－疊氮甲基尿嘧啶上的疊氮發(fā)生click反應(yīng)，產(chǎn)生熒光相應(yīng)，進(jìn)而達(dá)到特異性地檢測5－羥甲基尿嘧啶的目的。值得注意的是，其他堿基在三氟乙酸存在的條件下均不與疊氮化鈉作用，包括5－羥甲基胞嘧啶。

圖9 基因組中5－羥甲基胞嘧啶定量檢測的路線圖Process of genomic 5fC quantitative detection

因此，我們設(shè)計(jì)了一種僅通過一步取代反應(yīng)即可以將5－羥甲基尿嘧啶上的羥基替換為疊氮，然后利用帶炔基的熒光探針與疊氮發(fā)生click反應(yīng)來對5－羥甲基尿嘧啶進(jìn)行熒光檢測（圖10）。該方法相比于傳統(tǒng)的檢測方法，具有方便快捷、成本低廉和選擇性高的優(yōu)點(diǎn)，對化學(xué)手段檢測5－羥甲基尿嘧啶的工作具有重要的參考價(jià)值，并有望在將來運(yùn)用到實(shí)際樣品中5－羥甲基尿嘧啶的檢測工作中。

圖10 通過click反應(yīng)對5－羥甲基尿嘧啶（5－h(huán)mdU）進(jìn)行熒光檢測的反應(yīng)路線圖Schematic illustration of fluorescence turn－on detection of 5－h(huán)mdU based on click reaction

3 5－醛基胞嘧啶（5fC）和5－羧基胞嘧啶（5caC）的化學(xué)檢測

作為TET酶蛋白調(diào)控的5－甲基胞嘧啶氧化過程中的產(chǎn)物，5－醛基胞嘧啶（5fc）和5－羧基胞嘧啶（5caC）在整個(gè)DNA的去甲基化過程中扮演著非常關(guān)鍵的角色。研究人員已經(jīng)在胚胎干細(xì)胞中檢測到了5－醛基胞嘧啶和5－羧基胞嘧啶的存在，并發(fā)現(xiàn)5－醛基胞嘧啶對干細(xì)胞分化過程具有潛在的作用［8－10］。因此，5－醛基胞嘧啶和5－羧基胞嘧啶的檢測在遺傳生物學(xué)上具有十分重要的意義。

傳統(tǒng)的檢測DNA損傷的方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、基因測序和基因芯片，但以上方法均存在成本高昂和操作復(fù)雜的問題。因此，由于化學(xué)反應(yīng)具有高選擇性、高靈敏度、操作方便和對DNA低損害等優(yōu)點(diǎn)，許多課題組開始考慮通過化學(xué)的方法設(shè)計(jì)合成小分子探針來實(shí)現(xiàn)對損傷DNA的快速靈敏檢測。然而，目前已知的許多檢測方法都存在高毒性以及需要特殊目標(biāo)DNA序列、對檢測目標(biāo)不具有普適性的缺陷［30，38－40］。

Carell課題組經(jīng)過系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)5－醛基胞嘧啶上醛基的氧原子能夠與嘧啶環(huán)上的氨基形成分子內(nèi)氫鍵，致使5－醛基胞嘧啶上的醛基難以反應(yīng)［41］。該課題組設(shè)計(jì)了一種帶羥胺基團(tuán)的生物素探針，通過羥胺基團(tuán)與5－醛基胞嘧啶選擇性反應(yīng)達(dá)到檢測5－醛基胞嘧啶的目的［10］。Balasubramian課題組利用這一方法，對基因組中DNA的醛基胞嘧啶進(jìn)行了測序［42］。

眾所周知，氨基能夠與醛基反應(yīng)生成西氟堿，因此帶有氨基的熒光探針可以用于對5－醛基胞嘧啶進(jìn)行特異性標(biāo)記。然而，由于分子內(nèi)氫鍵的形成，5－醛基胞嘧啶上的醛基的反應(yīng)活性較普通醛基要低，許多氨基基團(tuán)不能與5－醛基胞嘧啶上的醛基反應(yīng)［41］。

我們通過一系列的研究發(fā)現(xiàn)［43］，與芳環(huán)直接相連的氨基很難與5－醛基胞嘧啶的醛基反應(yīng)。與此同時(shí)，烷基鏈上的氨基對5－醛基胞嘧啶上的醛基具有很高的反應(yīng)活性，可以與5－醛基胞嘧啶上的醛基特異性地反應(yīng)。基于此，研究人員設(shè)計(jì)并合成了一類高反應(yīng)活性的氨基熒光化合物5和6，用于5－醛基胞嘧啶上的醛基的檢測（圖11，圖12）。該反應(yīng)在室溫下即可順利進(jìn)行，擁有很高的產(chǎn)率，并且不需要任何催化劑。

圖11 氨基熒光化合物5和6的結(jié)構(gòu)式Structures of the compound 5 and 6

圖12 氨基熒光探針與5－醛基胞嘧啶反應(yīng)的路線圖Reaction of 5fC with amine probes

我們通過設(shè)計(jì)并合成氨基熒光化合物5和6，成功實(shí)現(xiàn)了與5－醛基胞嘧啶上醛基的反應(yīng)，解決了5－醛基胞嘧啶上的醛基具有惰性、難以反應(yīng)的問題。除此之外，研究人員還通過高效液相色譜、聚丙烯酰胺電泳和熒光檢測實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該氨基熒光探針可以對DNA鏈上的5－醛基胞嘧啶進(jìn)行了熒光標(biāo)記，從而達(dá)到特異性地檢測5－醛基胞嘧啶的目的。此外，該研究對于相關(guān)檢測探針的設(shè)計(jì)也具有重要的參考價(jià)值。令人遺憾的是，該工作并未選取實(shí)際樣品進(jìn)行檢測，缺乏能夠檢測基因組中5－醛基胞嘧啶的足夠證據(jù)。

為了更充分地證明小分子熒光探針能夠用于基因組中5－醛基胞嘧啶的檢測，我們設(shè)計(jì)并合成了一類羥胺熒光化合物7～9（圖13）［44］，通過對5－醛基胞嘧啶進(jìn)行熒光標(biāo)記（圖14），進(jìn)而達(dá)到檢測5－醛基胞嘧啶的目的。研究人員通過高效液相色譜（HPLC）、聚丙烯酰胺電泳（PAGE）以及 DNA質(zhì)譜等方法證實(shí)了設(shè)計(jì)合成的羥胺熒光探針特異性地與DNA鏈上的5－醛基胞嘧啶發(fā)生了反應(yīng)，并且擁有很高的反應(yīng)產(chǎn)率。除此之外，研究人員還特意選取了小鼠胚胎干細(xì)胞作為實(shí)際樣品，利用所合成的羥胺熒光探針對小鼠胚胎干細(xì)胞中的5－醛基胞嘧啶進(jìn)行了檢測，并通過液相色譜－質(zhì)譜（LC－MS）對這一結(jié)果進(jìn)行了證實(shí)。因此，可以推斷該羥胺熒光探針可以用于基因組中5－醛基胞嘧啶分布位點(diǎn)和含量的檢測。

圖13 熒光羥胺類化合物7～9的結(jié)構(gòu)式Structures of fluorescent hydroxylamine probes 7－9

圖14 羥胺類熒光探針與5－醛基胞嘧啶反應(yīng)的路線圖Reaction of 5fC with hydroxylamine probes

以上兩種方法利用了胺基和羥胺基團(tuán)與5－醛基胞嘧啶中醛基反應(yīng)的高活性和高選擇性，并且通過標(biāo)記熒光基團(tuán)的方法，具有熒光檢測的靈敏高效性和簡潔性。因此，該方法克服了檢測5－醛基胞嘧啶的傳統(tǒng)方法操作復(fù)雜、花費(fèi)昂貴的問題，具有化學(xué)方法操作簡便、成本低廉、高靈敏度和選擇性等優(yōu)點(diǎn)，并且達(dá)到了在基因組中檢測5－醛基胞嘧啶的水平，為檢測DNA序列中5－醛基胞嘧啶的分布位點(diǎn)和含量提供了一種靈敏快捷的新方法，為相關(guān)疾病的前期診斷提供了一種可靠的方法。除此之外，對5－醛基胞嘧啶反應(yīng)活性的系統(tǒng)研究也為將來通過進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)來進(jìn)行選擇性識別5－醛基胞嘧啶的工作提供了許多新的思路，以化學(xué)小分子作為探針的研究手段有望在將來直接用于體內(nèi)5－醛基胞嘧啶含量的檢測。

在DNA去甲基化過程中，5－醛基胞嘧啶和5－羧基胞嘧啶作為胞嘧啶被TET酶氧化后更高級別的氧化形式，能夠被胸腺嘧啶DNA糖苷酶（thymine DNA glycosylase，TDG）特異性地識別并切割［9］。然而，5－醛基胞嘧啶和5－羧基胞嘧啶在去甲基化過程中的確切功能和機(jī)理還存在著廣泛的爭議［10，42］。

我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過熱哌啶處理，DNA鏈上的5－醛基胞嘧啶位點(diǎn)會(huì)特異性地?cái)嗔眩覔碛泻芨叩那懈钚?，而?jīng)過相同條件處理的5－甲基胞嘧啶和5－羥甲基胞嘧啶處并不會(huì)被切割（圖15）［45］。研究人員利用這一特點(diǎn)，設(shè)計(jì)出了基于熱哌啶處理選擇性地識別DNA鏈上5－醛基胞嘧啶分布位點(diǎn)的方法，并通過聚丙烯酰胺電泳和高效液相色譜（HPLC）實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了證實(shí)。除此之外，基于KRuO4能夠選擇性地氧化5－羥甲基胞嘧啶為5－醛基胞嘧啶這一特性，研究人員還通過結(jié)合KRuO4氧化和熱哌啶處理方法來達(dá)到檢測DNA鏈上的5－羥甲基胞嘧啶分布的目的（圖16）。

圖15 通過熱哌啶處理識別DNA序列中的5－醛基胞嘧啶Treatment of the DNA sequences containing 5fC with hot piperidine

該方法能夠在沒有TDG酶作用的情況下有效地識別DNA鏈上的5－醛基胞嘧啶和5－羥甲基胞嘧啶，利用化學(xué)方法成功檢測出DNA序列中5－醛基胞嘧啶和5－羥甲基胞嘧啶分布位點(diǎn)，并且為研究人員深入了解5－醛基胞嘧啶的特有結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，進(jìn)而找到更多合適的化學(xué)方法檢測5－醛基胞嘧啶提供了新的思路。

圖16 通過KRuO4氧化和熱哌啶處理識別DNA序列中的5－羥甲基胞嘧啶Treatment of the DNA sequences containing 5fC with KRuO4and then hot piperidine

隨后，本課題組研究人員通過對熱堿性條件處理后DNA序列中的5－甲基胞嘧啶、5－羥甲基胞嘧啶、5－醛基胞嘧啶和5－羧基胞嘧啶位點(diǎn)變化的系統(tǒng)研究［46］，發(fā)現(xiàn)在95℃，250mmol／L NaOH 條件下處理15min，DNA鏈上5－醛基胞嘧啶位點(diǎn)即可被完全切割（圖17）。同時(shí)，研究人員還發(fā)現(xiàn)5－羧基胞嘧啶位點(diǎn)也會(huì)被切割，但切割效率弱于5－醛基胞嘧啶。

圖17 熱堿性條件對不同胞嘧啶的選擇性切割I(lǐng)llustration of the excision behaviors of DNAs with modified cytosines by hot alkali treatment

通過聚丙烯酰胺電泳實(shí)驗(yàn)，針對熱堿性條件處理對DNA序列中的5－甲基胞嘧啶、5－羥甲基胞嘧啶、5－醛基胞嘧啶和5－羧基胞嘧啶位點(diǎn)的影響進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)熱堿性條件能選擇性切割DNA鏈上的5－醛基胞嘧啶和5－羧基胞嘧啶位點(diǎn)，且對5－醛基胞嘧啶的切割效率高于5－羧基胞嘧啶。對此特殊現(xiàn)象，研究人員將其歸因于5－醛基胞嘧啶和5－羧基胞嘧啶上5位的醛基和羧基的拉電子效應(yīng)。由于熱堿容易配置且處理方便，該方法可以作為Maxam－Gilbert DANN測序法的有效補(bǔ)充，同時(shí)能給未來的表觀遺傳分析工作提供一種非常有效的策略，對DNA去甲基化過程中各種胞嘧啶的性質(zhì)和機(jī)理研究具有重要的參考價(jià)值。

除此之外，Bifeng Yuan和我們課題組共同通過將穿梭載體技術(shù)與下一代測序技術(shù)相結(jié)合，系統(tǒng)地研究了胞嘧啶甲基化的衍生物（5hmC、5fC和5caC）對DNA復(fù)制過程的影響［47］（圖18）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在大腸桿菌中，盡管對DNA復(fù)制效率沒有影響，所有的胞嘧啶衍生物都能誘導(dǎo)一定程度上（0．17%～1．12%）的胞嘧啶C到胸腺嘧啶T的轉(zhuǎn)錄突變，這可能是基因組引導(dǎo)細(xì)胞分化的潛在原因之一。這為DNA去甲基化過程中各種甲基胞嘧啶氧化產(chǎn)物的潛在突變特性提供了新的有力證據(jù)，為人們深入了解這些特殊堿基的生物學(xué)功能提供了新的視角。

圖18 對甲基胞嘧啶氧化產(chǎn)物突變和復(fù)制性質(zhì)的系統(tǒng)研究［47］Systematic investigation of mutagenic and cytotoxic properties of oxidation products of 5－methylcytosine

甲基胞嘧啶、羥甲基胞嘧啶、醛基胞嘧啶和羧基胞嘧啶作為DNA甲基化和去甲基化過程中的重要組分，這些特殊堿基在基因組中的分布和含量對整個(gè)生命過程具有重要的影響。由于各種堿基的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)方面存在著相似性與差異性，尋找合適的化學(xué)方法可以有效地區(qū)分這些特殊的堿基，有利于DNA甲基化和去甲基化過程的本質(zhì)機(jī)制研究，并能為甲基化檢測的研究帶來許多幫助。

4 展望

DNA甲基化作為重要的表觀遺傳學(xué)修飾，在哺乳動(dòng)物的生長發(fā)育過程中起著極為關(guān)鍵的作用。DNA甲基化和去甲基化的動(dòng)態(tài)平衡影響著許多生命活動(dòng)的正常進(jìn)行，而這種動(dòng)態(tài)平衡與甲基胞嘧啶、羥甲基胞嘧啶、醛基胞嘧啶和羧基胞嘧啶這些DNA甲基化和去甲基化過程中重要的中間體形式的分布含量密切相關(guān)。檢測基因組中這些天然修飾的胞嘧啶的分布位置及相對含量對從表觀遺傳學(xué)研究到臨床疾病診斷的各種生物醫(yī)學(xué)研究工作都有著非常重要的意義。在對于這些特殊胞嘧啶的檢測工作中，研究人員已經(jīng)取得了許多激動(dòng)人心的進(jìn)展。化學(xué)方法因其具有方便快捷、成本低廉、可修飾性和可控性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在整個(gè)DNA甲基化的檢測過程中發(fā)揮著重要的作用。同時(shí)，由于這些特殊的胞嘧啶之間存在著密切的聯(lián)系，化學(xué)方法有利于更加深入地認(rèn)識和了解這些堿基的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能，為表觀遺傳檢測提供了許多幫助和啟發(fā)。同時(shí)，由于生物體的復(fù)雜性，還有許多對DNA甲基化檢測和與DNA甲基化有關(guān)的生命活動(dòng)機(jī)制有待于進(jìn)一步深入的研究。對于研究DNA甲基化的相關(guān)工作，還有賴于包括化學(xué)、生物、醫(yī)學(xué)和物理學(xué)在內(nèi)的多學(xué)科的共同協(xié)作，今后的研究將更加側(cè)重于了解這些特殊堿基確切的角色及其潛在的機(jī)理。毫無疑問，化學(xué)方法將會(huì)在未來的DNA甲基化研究工作中發(fā)揮十分重要的作用。致謝：該項(xiàng)目得到國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973）（2012CB720600，2012CB720603），教育部“長江學(xué)者創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)”（IRT1030）和“111”引智計(jì)劃的資助。

［1］ Klose R J，Bird A P．Genomic DNA methylation：the mark and its mediators［J］．Trends in Biochemical Sciences，2006，31（2）：89－97．

［2］ Smith Z D，Meissner A．DNA methylation：roles in mammalian development［J］．Nature Reviews Genetics，2013，14：204－220．

［3］ Baylin S B，Jones P A．A decade of exploring the cancer epigenome－biological and translational implications［J］．Nature Reviews Cancer，2011，11（10）：726－734．

［4］ Wu S C，Zhang Y．Active DNA demethylation：many roads lead to rome［J］．Nature Reviews Molecular Cell Biology，2010，11（9）：607－620．

［5］ Bhutani N，Burns D M，Blau H M．DNA demethylation dynamics［J］．Cell，2011，146（6）：866－872．

［6］ Kriaucionis S，Heintz N．The nuclear DNA base 5－h(huán)ydroxymethylcytosine is present in purkinje neurons and the brain［J］．Science，2009，324（5929）：929－930．

［7］ Tahiliani M，Koh K P，Shen Y，et al．Conversion of 5－methylcytosine to 5－h(huán)ydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1［J］．Science，2009，324（5929）：930－935．

［8］ Ito S，Shen L，Dai Q，et al．Tet proteins can convert 5－methylcytosine to 5－formylcytosine and 5－carboxylcytosine［J］．Science，2011，333（6047）：1300－1303．

［9］ He Y F，Li B Z，Li Z，et al．Tet－mediated formation of 5－carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA［J］．Science，2011，333（6047）：1303－1307．

［10］ Pfaffeneder T，Hackner B，Tru? M，et al．The discovery of 5－formylcytosine in embryonic stem cell DNA［J］．Angewandte Chemie International Edition，2011，50：7008－7012．

［11］ Tian T，Wang S R，Wu J G，et al．Review：advances in methodology of DNA methylation assay［J］．Science China Chemistry，2011，54（8）：1233－1243．

［12］ R Shapiro，R E Servis，M Welcher，Reactions of uracil and cytosine derivatives with sodium bisulfite［J］．Journal of the American Chemical Society，1970，92：422－424．

［13］ H Hayatsu，Y Wataya，K．Kai，Addition of sodium bisulfite to uracil and to cytosine［J］．Journal of the American Chemical Society，1970，92：724－726．

［14］ Lister R，Pelizzola M，Dowen R H，et al．Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences［J］．Nature，2009，462（7271）：315－322．

［15］ Balasubramanian S．Decoding genomes at high speed：implications for science and medicine［J］．Angewandte Chemie International Edition，2011，50（52）：12406－12410．

［16］ Schüler P，Miller A K．Sequencing the sixth base （5－h(huán)ydroxymethylcytosine）：selective DNA oxidation enables base－pair resolution［J］．Angewandte Chemie International Edition，2012，51（43）：10704－10707．

［17］ Wang T，Hong T，Tang T，et al．Application of N－h(huán)alogeno－N－sodiobenzenesulfonamide reagents to the selective detection of 5－methylcytosine in DNA sequences［J］．Journal of the American Chemical Society，2013，135（4）：1240－1243．

［18］ Longo M C，Berninger M S，Hartley J L．Use of uracil DNA glycosylase to control carry－over contamination in polymerase chain reactions［J］．Gene，1990，93（1）：125－128．

［19］ Huang R，Wang J，Mao W，et al．A novel combined bisulfite UDG assay for selective 5－methylcytosine detection［J］．Talanta，2013，117：445－448．

［20］ Jin S G，Jiang Y，Qiu R，et al．5－Hydroxymethylcytosine is strongly depleted in human cancers but its levelsdonot correlate with IDH1mutations［J］．Cancer Research，2011，71（24）：7360－7365．

［21］ Lian C G，Xu Y，Ceol C，et al．Loss of 5－h(huán)ydroxymethylcytosine is an epigenetic hallmark of melanoma［J］．Cell，2012，150（6）：1135－1146．

［22］ Huang Y，Pastor W A，Shen Y，et al．The behaviour of 5－h(huán)ydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing［J］．PLoS One，2010，5（1）：e8888．

［23］ Jin S G，Kadam S，Pfeifer G P．Examination of the specificity of DNA methylation profiling techniques towards 5－methylcytosine and 5－h(huán)ydroxymethylcytosine［J］．Nucleic Acids Research，2010，38（11）：e125－e125．

［24］ Hayatsu H，Shiragami M．Reaction of bisulfite with the 5－h(huán)ydroxymethyl group in pyrimidines and in phage DNAs［J］．Biochemistry，1979，18（4）：632－637．

［25］ Yu M，Hon G C，Szulwach K E，et al．Base－resolution analysis of 5－h(huán)ydroxymethylcytosine in the mammalian genome［J］．Cell，2012，149（6）：1368－1380．

［26］ Booth M J，Branco M R，F(xiàn)icz G，et al．Quantitative sequencing of 5－methylcytosine and 5－h(huán)ydroxymethylcytosine at single－base resolution［J］．Science，2012，336（6083）：934－937．

［27］ Song C X，Szulwach K E，F(xiàn)u Y，et al．Selective chemical labeling reveals the genome－wide distribution of 5－h(huán)ydroxymethylcytosine［J］．Nature Biotechnology，2010，29（1）：68－72．

［28］ Song C X，Clark T A，Lu X Y，et al．Sensitive and specific single－molecule sequencing of 5－h(huán)ydroxymethylcytosine［J］．Nature methods，2011，9（1）：75－77．

［29］ Pastor W A，Pape U J，Huang Y，et al．Genome－wide mapping of 5－h(huán)ydroxymethylcytosine in embryonic stem cells［J］．Nature，2011，473（7347）：394－397．

［30］ Okamoto A，Sugizaki K，Nakamura A，et al．5－Hydroxymethylcytosine－selective oxidation with peroxotungstate［J］．Chemical Communications，2011，47（40）：11231－11233．

［31］ Zhou X，Yan S，Xu X，et al．A turn－on fluorescence strategy by selective one－step reaction with 5－h(huán)ydroxymethyl－2′－deoxycytidine for the formation of 1，3－O，N－h(huán)eterocycles［J］．RSC Advances，2013，3：12066－12068．

［32］ Hong T T，Wang T，Guo P，et al．Fluorescent strategy based on CCP－FRET for the quantification of 5－h(huán)ydroxymethylcytosine in genomic DNA［J］．Analytical Chemistry，2013，85：10797－10802．

［33］ Cadet J，Berger M．Radiation－induced decomposition of the purine bases within DNA and related model compounds［J］．International Journal of Radiation Oncology，1985，47（2）：127－143．

［34］ Djuric Z，Heilbrun L K，Simon M S，et al．Levels of 5－h(huán)ydroxymethyl－2′－deoxyuridine in DNA from blood as a marker of breast cancer［J］．Cancer，1996，77（4）：691－696．

［35］ Bhutani N，Burns D M，Blau H M．DNA demethylation dynamics［J］．Cell，2011，146（6）：866－872．

［36］ Hong I S，Ding H，Greenberg M M．Oxygen independent DNA interstrand cross－link formation by a nucleotide radical［J］．Journal of the American Chemical Society，2006，128（2）：485－491．

［37］ Xu X，Yan S，Hu J，et al．One－step to get 5－azidomethyl－2′－deoxyuridine from 5－h(huán)ydroxymethyl－2′－deoxyuridine and detection of it through click reaction［J］．Tetrahedron，2013，69（46）：9870－9874．

［38］ Okamoto A，Tainaka K，Saito I．A dielectric－sensitive fluorescent DNA probe for monitoring polarities on the interior of a DNA－binding protein［J］．Bioconjugate Chemistry，2005，16（5）：1105－1111．

［39］ Cohen B E，McAnaney T B，Park E S，et al．Probing protein electrostatics with a synthetic fluorescent amino acid［J］．Science，2002，296（5573）：1700－1703．

［40］ Okamoto A．Chemical approach toward efficient DNA methylation analysis［J］．Organic ＆ Biomolecular Chemistry，2009，7（1）：21－26．

［41］ Münzel M，Lischke U，Stathis D，et al．Improved synthesis and mutagenicity of oligonucleotides containing 5－h(huán)ydroxymethylcytosine，5－formylcytosine and 5－carboxylcytosine［J］．Chemistry－A European Journal，2011，17（49）：13782－13788．

［42］ Raiber E A，Beraldi D，F(xiàn)icz G，et al．Genome－wide distribution of 5－formylcytosine in embryonic stem cells is associ－ated with transcription and depends on thymine DNA glycosylase［J］．Genome Biology，2012，13（8）：R69．

［43］ Hu J，Xing X，Xu X，et al．Selective chemical labelling of 5－formylcytosine in DNA by fluorescent dyes［J］．Chemistry－A European Journal，2013，19（19）：5836－5840．

［44］ Guo P，Yan S，Hu J，et al．Selective detection of 5－formyl－2′－deoxycytidine in DNA using a fluorogenic hydroxylamine reagent［J］．Organic Letters，2013，15（13），3266－3269．

［45］ Mao W，Hu J，Hong T，et al．A convenient method for selective detection of 5－h(huán)ydroxymethylcytosine and 5－formylcytosine sites in DNA sequences［J］．Organic ＆ Biomolecular Chemistry，2013，11：3568－3572．

［46］ Tian T，Zhang X，F(xiàn)u B，et al．Systematic investigation of DNAs with modified cytosines under hot alkali treatment［J］．Chemical Communications，2013，49（85）：9968－9970．

［47］ Xing X W，Liu Y L，Vargas M，et al．Mutagenic and cytotoxic properties of oxidation products of 5－methylcytosine revealed by next－generation sequencing［J］．PloS One，2013，8（9）：e72993．