殼聚糖雙胍鹽酸鹽抑菌活性及其涂膜保鮮圣女果的研究

陳佳陽，羅永祥，陸旺金，傅夏兵，樂學(xué)義，*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系，廣東廣州510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東廣州510642）

殼聚糖雙胍鹽酸鹽抑菌活性及其涂膜保鮮圣女果的研究

陳佳陽1，羅永祥1，陸旺金2，傅夏兵1，樂學(xué)義1，*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系，廣東廣州510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東廣州510642）

測定了殼聚糖雙胍鹽酸鹽（CGH）對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和番茄絲核菌的抑菌能力；并通過涂膜的方法處理圣女果，測定貯藏過程中果實(shí)失重率、硬度、可溶性固形物含量（TSS）、維生素C（VC）含量、細(xì)胞膜透性和總酸含量的變化。結(jié)果表明，相對于殼聚糖（CTS），CGH對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌具有較強(qiáng)的抑菌能力，其最小抑菌濃度（MIC）分別為0.31mg/mL和0.62mg/mL；當(dāng)CGH濃度達(dá)到2.00mg/mL時(shí)對番茄絲核菌菌絲生長抑制率可達(dá)到100%。以質(zhì)量濃度為3%的CGH涂膜處理的圣女果在（28±2）℃存放12d后，失重率僅為7.5%，硬度仍有21.121N/cm2，TSS為7.2%，VC含量為21.70mg/100g FW（鮮重），膜滲透率為27.4%，可滴定酸含量為0.35%。與對照（CK）相比，顯著保持了果實(shí)的品質(zhì)。

殼聚糖雙胍鹽酸鹽，圣女果，抑菌，保鮮

利用涂膜的技術(shù)對果蔬進(jìn)行保鮮，成本低，易于操作，已受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[1-4]。殼聚糖（CTS）屬于天然高分子化合物，無毒、可生物降解，理化性能相對穩(wěn)定，具有成纖成膜性[5]和抗菌性[6]，目前已經(jīng)有大量文獻(xiàn)報(bào)道其對果蔬具有顯著的抗菌保鮮作用[7-10]。但是，由于殼聚糖整個(gè)大分子鏈上有較高密度的分子內(nèi)和分子間氫鍵使之不溶于水也不溶于堿溶液，只溶于小部分有機(jī)酸溶液，導(dǎo)致它在應(yīng)用上受到極大限制[11]。將具有抑菌作用的小分子基團(tuán)接枝到殼聚糖上，既能改善殼聚糖的水溶性又能增強(qiáng)其抗菌性和防止小分子抑菌劑對人體的毒害作用[12]。本文將具有廣譜抗菌作用的雙胍基[13]接枝到殼聚糖結(jié)構(gòu)單元上后制得具有一定保鮮抗菌能力的高分子化合物殼聚糖雙胍鹽酸鹽（CGH）。該殼聚糖衍生物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及常見的致使水果腐爛的真菌均具有較好的抑制作用。將CTS應(yīng)用于圣女果的研究已有報(bào)道[14-15]，但將CGH應(yīng)用于圣女果的保鮮工作目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

圣女果 市售，選擇果實(shí)新鮮，表面光滑，大小、成熟度基本一致，無機(jī)械損傷和病蟲害的圣女果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；金黃色葡萄球菌（S.Aureus）、大腸桿菌（E. Coli）和番茄絲核菌（Rhizoctonia solani Kuhn） 均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院提供；殼聚糖（脫乙酰度≥85%） 山東奧康生物科技有限公司；2，6-二氯酚靛酚鈉鹽 為生物純；草酸 優(yōu)級(jí)純；無水乙醇、氫氧化鈉、冰乙酸、標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸（VC） 均為分析純；高嶺土 化學(xué)純；殼聚糖雙胍鹽酸鹽 為自制，經(jīng)元素分析測定其接枝率為50.5%。

DDS-12A型電導(dǎo)率儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司；果蔬材料硬度測試機(jī) 美國Instron公司；PR-α型數(shù)顯折光儀 日本ATAGO公司；SW-CI-IF型潔凈工作臺(tái) 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；LRH-250-S（Ⅱ）型微電腦控制恒溫恒濕培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠。

1.2 CGH的體外抗菌實(shí)驗(yàn)

1.2.1 對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制作用 采用二倍稀釋法[16]測定CTS和CGH對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（MIC）。

1.2.2 對番茄絲核菌菌絲體徑向生長的影響 將CTS和CGH分別配制成不同濃度的溶液，用1mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH=5～6。配制含藥品濃度分別為0.25、0.50、1.00、2.00mg/mL的PDA培養(yǎng)基，在已經(jīng)培養(yǎng)成熟的菌落（真菌PDA培養(yǎng)基）邊緣打取直徑5mm供試菌餅移入到含藥培養(yǎng)基中心，28℃恒溫培養(yǎng)，待對照組（CK，0mg/mL）菌落長滿平板時(shí)，用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算抑菌率[17]。

式中，D空白為對照菌落直徑，D藥品為處理菌落直徑。

1.3 圣女果的涂膜處理

制取0.5%（V/V）殼聚糖乙酸溶液，并用1mol/L NaOH溶液調(diào)至pH=5～6；用去離子水溶解不同質(zhì)量的CGH制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、2%和3%的膜溶液[18]，同時(shí)調(diào)節(jié)pH=5～6。挑選新鮮、且果皮顏色和大小均勻，無明顯病蟲害的圣女果為樣品，隨機(jī)分成5組（每組100個(gè)果實(shí)），其中一組將作為對照。將上述5組分別浸入制好的殼聚糖乙酸溶液中，靜置3min，瀝干，分別放入大小相同的籃中，室溫（28±2）℃下存放。

1.4 測試指標(biāo)及方法

圣女果于購買當(dāng)日分別進(jìn)行重量、可滴定酸（TA）含量、可溶性固形物（TSS）含量、VC含量、果實(shí)硬度、果皮細(xì)胞膜滲透率指標(biāo)的測定，貯藏期間每2d測定1次，每次每組隨機(jī)抽取果實(shí)10個(gè)，重復(fù)3次。

1.4.1 失重率測定 采用稱重法，分別測定待貯存的圣女果質(zhì)量（m0）與貯存一定時(shí)間后的質(zhì)量（mt）。

1.4.2 可滴定酸（TA）含量的測定 參照文獻(xiàn)[19]的方法，取10g果肉，用研缽磨碎，加以煮沸、冷卻、去除CO2的蒸餾水25mL，在沸水浴中提取30min，冷卻，過濾，移入50mL容量瓶中，定容至50mL，每次取10mL，加酚酞指示劑2滴，用0.1mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色在1min內(nèi)不褪色為終點(diǎn)。

式中：N：NaOH標(biāo)液的摩爾濃度，mol/L；V：消耗NaOH標(biāo)液的體積，mL；W：樣品用量；K：換量為適當(dāng)酸的系數(shù)（以蘋果酸為標(biāo)準(zhǔn)；K=0.067）。

1.4.3 可溶性固形物（TSS）含量測定 采用PR-32α數(shù)顯折光儀進(jìn)行測定。

1.4.4 VC含量測定 參考2，6-二氯酚靛酚法[20]準(zhǔn)確稱取10g左右的圣女果，加入30mL 2%草酸，打成漿狀，離心，準(zhǔn)確吸取上清液5mL，用標(biāo)定好的2，6-二氯酚靛酚鈉鹽滴定。另取5mL 2%草酸作空白對照滴定。

式中，w：100g樣品（鮮重，F(xiàn)W）含VC毫克數(shù)，VA：滴定樣品所耗用的染料平均體積，mL；VB：滴定空白對照所耗用的染料的平均體積，mL；VT：樣品提取液的總體積，mL；VS：滴定時(shí)所取樣品提取液體積，mL；A：1mL染料能氧化抗壞血酸量，mg/mL；W：待測樣品的質(zhì)量，g。

1.4.5 硬度的測定 用果蔬材料硬度測試機(jī)測定圣女果的硬度。所選擇探頭為圓錐形，基部直徑為4mm，硬度值用N/cm2表示。

1.4.6 細(xì)胞膜透性測定 根據(jù)文獻(xiàn)[21]將圣女果果肉切成5mm×5mm塊狀，混勻后稱取5.0g于50mL燒杯中，加40mL蒸餾水，用電導(dǎo)率儀測出電導(dǎo)率（P0），浸泡10min后測出電導(dǎo)率（P1），再將燒杯放置于水浴鍋中，加熱煮沸10min后補(bǔ)足失去的水分，冷卻后測定電導(dǎo)率（P2）。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

每處理3個(gè)重復(fù)，數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用最低顯著性差異法（LSD）在0.05水平上進(jìn)行顯著性差異檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用 通過二倍稀釋法測得CGH對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC值分別為0.31mg/mL和0.62mg/mL，而CTS對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC值分別的0.62mg/mL和1.25mg/mL，由此可得出CGH抑制這兩種細(xì)菌的活性強(qiáng)于CTS，并且CGH對G+的抗菌性要強(qiáng)于G-。這可能同菌細(xì)胞壁組成相關(guān)，大腸桿菌比金黃色葡萄球菌多了一層外層膜（outer membrane），外層膜中除了含有脂多糖、核糖和O抗原外，還有孔蛋白，而這種孔蛋白只允許特定的分子通過，所以CGH對其抑制活性較弱[22]。

2.1.2 對番茄絲核菌的抑制作用 CTS及CGH對番茄絲核菌的抑制作用如圖1所示。

圖1表明，CTS與CGH對番茄絲核菌絲生長都具有抑制活性。當(dāng)濃度為2.00mg/mL時(shí)，CGH對番茄絲核菌的抑制率為100%，而CTS為80.4%，說明CGH的抑菌作用明顯強(qiáng)于CTS。這可能源于CGH胍基易質(zhì)子化而導(dǎo)致其正電性大于CTS，更有利于吸附在菌體細(xì)胞上，擾亂細(xì)胞的正常生理活動(dòng)而抑制病菌的生長。

圖1CTS及CGH對番茄絲核菌的抑菌率Fig.1 The fungistasis activities of various concentrations of CTS and CGH against Rhizoctonia solani Kuhn

2.2 失重率的變化

測定了不同涂膜的圣女果在貯藏過程中果實(shí)失重率的變化，結(jié)果如圖2所示。

圖2CTS和CGH涂膜對圣女果室溫貯藏期間失重率變化的影響Fig.2 Effect of CTS and CGH coatings on mass loss of cherry tomatoes during room temperature storage

結(jié)果表明，平行3次測定失重率偏差很小，導(dǎo)致圖2中偏差線不明顯。由圖2可見，隨著圣女果存放時(shí)間延長，各組失重率不斷上升，經(jīng)過12d室溫存放后，經(jīng)過3%CTS、1%CGH、2%CGH和3%CGH涂膜處理的圣女果的失重率分別為7.8%、8.9%、8.1%和7.5%，而對照樣為10.4%。在同樣為3%的濃度下，用CGH處理過的圣女果失重率低于CTS，表明3%CGH對圣女果的保鮮作用優(yōu)于3%CTS。另外，1%CGH和2%CGH涂膜效果不如3%CTS好，原因可能是由于膜厚度不夠，導(dǎo)致果實(shí)中水分蒸發(fā)相對較快。

2.3 TA含量的變化

測得不同涂膜圣女果在相同存放條件下TA含量的變化如圖3所示。

結(jié)果表明，在貯藏過程中，由于存放條件為室溫，溫度和濕度變化較大，導(dǎo)致圣女果中TA含量出現(xiàn)波動(dòng)，但其總體趨勢是波動(dòng)下降的。另外，從貯藏后期的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過12d后，由3%CTS、3%CGH涂膜處理的圣女果的可滴定酸含量分別為0.32%、0.35%，而對照組可滴定酸含量為0.16%。其中，12d后3% CGH涂膜的圣女果可滴定酸含量是對照組的2倍，這可能源于CGH涂膜處理后減少了圣女果中水分的蒸發(fā)，抑制了水果的呼吸，從而延緩了果實(shí)新陳代謝的速度。由此可得幾組涂膜處理中，3%CGH對圣女果酸含量的保持效果最好。

圖3 圣女果貯藏過程中TA含量的變化圖Fig.3 Effect of CTS and CGH coatings on TA content of cherry tomatoes during room temperature storage

2.4 TSS含量的變化

測得不同涂膜的圣女果在貯藏過程中可溶性固形物含量的變化如圖4所示。

圖4 圣女果貯藏過程中TSS含量的變化Fig.4 Effect of CTS and CGH coatings on TSS content of cherry tomatoes during room temperature storage

可溶性固形物含量是指該果實(shí)中包含的能溶于水的糖、酸、礦物質(zhì)等占果實(shí)總質(zhì)量的百分率[23]?？扇苄怨绦挝锏姆e累與果實(shí)在貯藏過程中細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的變化和多糖降解為低分子糖相關(guān)[24]。當(dāng)果實(shí)成熟后，可溶性固形物含量將呈上升趨勢[25]。結(jié)果表明，貯藏6d后，對照組的可溶性固形物含量上升速度增快，12d后達(dá)到9.2%，而經(jīng)3%CGH涂膜的增長速度較緩，12d后可溶性固形物含量為7.2%，并且低于3% CTS涂膜的7.5%。

2.5 VC含量的變化

圣女果中含有豐富的VC，是普通番茄的1.7倍。眾所周知，VC是衡量水果營養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)，通常因貯存時(shí)間的延長使果實(shí)中的VC氧化分解而快速下降，所以常以VC的含量損失來評(píng)價(jià)水果的品質(zhì)。測得不同涂膜條件下圣女果在貯藏過程中VC含量的變化如圖5所示。

圖5表明，所有圣女果在貯藏期間VC含量均有所下降，但涂膜組圣女果VC含量降低的速度均小于對照，說明涂膜具有一定的保鮮效果。其原因可能是在果皮中形成的膜阻止了空氣中部分氧的進(jìn)入而減少VC的氧化。并且研究發(fā)現(xiàn)，常溫下貯存12d后，測得經(jīng)3%CTS處理的圣女果VC含量為21.03mg/100g FW，而3%CGH處理的圣女果VC含量達(dá)到21.70mg/100g FW，表明CGH保鮮作用優(yōu)于CTS。

圖5 圣女果貯藏過程中VC含量的變化圖Fig.5 Effect of CTS and CGH coatings on VCcontent of cherry tomatoes during room temperature storage

2.6 硬度變化

果實(shí)的硬度是指果肉抗壓力強(qiáng)弱的程度，果肉抗壓力愈強(qiáng)，果實(shí)的硬度就愈大。果實(shí)硬度的大小可以反映貯藏過程中及貯藏結(jié)束時(shí)果實(shí)品質(zhì)的優(yōu)劣。測得不同涂膜處理的圣女果在貯藏過程中硬度的變化如圖6所示。

圖6 圣女果貯藏過程中硬度的變化圖Fig.6 Effect of CTS and CGH coatings on firmness of cherry tomatoes during room temperature storage

圣女果采收后，使其軟化的生理生化因素很多，但主要是通過果實(shí)內(nèi)果膠物質(zhì)含量變化引起的。果實(shí)中脂氧合酶（LOX）、果膠酶等酶的活性隨果實(shí)成熟度的增加而迅速增加，使果實(shí)硬度下降[26]。結(jié)果表明，在貯藏的中前期，圣女果保持鮮脆狀態(tài)，硬度變化不大，而在貯藏后期，果實(shí)由于失水硬度迅速下降。并且發(fā)現(xiàn)，在常溫條件下存放12d后，空白樣的圣女果硬度為19.139N/cm2，而經(jīng)過3%CTS、1%CGH、2%CGH和3%CGH涂膜處理的圣女果的硬度分別為21.082、20.101、20.827、21.121N/cm2，表明CTS和CGH對圣女果均有保鮮作用，但是在同是3%的濃度下，CGH對圣女果硬度的保持效果優(yōu)于CTS。

2.7 細(xì)胞膜滲透性的變化

隨著果實(shí)采后存放時(shí)間的延長，果實(shí)中細(xì)胞膜滲透性逐漸改變甚至喪失，引起細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)大量外滲[27]，因而細(xì)胞膜滲透性可作為果實(shí)衰老的重要指標(biāo)。測得不同涂膜的圣女果在貯藏過程中細(xì)胞滲透率的變化結(jié)果如圖7所示。

圖7 圣女果貯藏過程中細(xì)胞膜滲透率的變化圖Fig.7 Effect of CTS and CGH coatings on ion leakage of cherry tomatoes during room temperature storage

圖7表明，隨著存放期增長，各實(shí)驗(yàn)組圣女果的細(xì)胞膜滲透性均逐步增加。存放12d后，測得3%CGH和3%CTS涂膜的圣女果細(xì)胞膜滲透率分別為27.4%和31.3%，均明顯低于對照組的42.4%，表明CGH和CTS涂膜都具有保鮮作用。并且發(fā)現(xiàn)，從第4d開始，同樣是3%濃度的涂膜，用CGH涂膜處理的圣女果細(xì)胞膜滲透率就明顯低于CTS的涂膜處理。由些可見，圣女果在常溫貯藏過程中，3%CGH涂膜處理比3%CTS更有助于保持圣女果細(xì)胞組織的完整性。

3 結(jié)論

體外抗菌實(shí)驗(yàn)表明，CGH對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和番茄絲核菌的生長抑制作用均強(qiáng)于CTS，當(dāng)CGH濃度為2.00mg/mL時(shí)，可完全抑制番茄絲核菌的生長。與CTS相比，CGH溶液涂膜處理圣女果可顯著減緩果實(shí)質(zhì)量的損失，保持TA、TSS和VC的含量以及果實(shí)的硬度，減緩細(xì)胞膜滲透率的增長，有效地延緩了果實(shí)的衰老過程，起到了保鮮保質(zhì)的作用。然而，為了進(jìn)一步提高該類殼聚糖衍生物膜的保鮮作用，其抗菌作用機(jī)理有待于進(jìn)一步研究，需要進(jìn)一步改善膜力學(xué)性能等。

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Effects of chitosan biguandine hydrochloride coating on storage quality of cherry tomato and its antimicrobial activities

CHEN Jia-yang1，LUO Yong-xiang1，LU Wang-jin2，F(xiàn)U Xia-bing1，LE Xue-yi1，*
（1.Department of Applied Chemistry，College of Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；2.College of Horticulture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

The antimicrobial activities of Chitosan biguandine hydrochloride（CGH）against S.Aureus，E.Coli and Rhizoctonia solani Kuhn were studied，respectively.Cherry tomatoes mass-loss ratio，firmness，total soluble solid，VCcontent，film penetration ratio and soluble acid content was examined attentively after fresh-keeping process with CGH as coating film.The minimal inhibited concentrations（MIC）against S.Aureus and E.Coli were 0.31 and 0.62mg/mL，respectively.CGH at 2.00mg/mL had a total antifungal effect on Rhizoctonia solani Kuhn.CGH with concentration of 3%coated on the cherry tomatoes showed a better preservation effect after 12d storage under（28±2）℃.The mass-loss，firmness，total soluble solid，VCcontent，film penetration ratio and soluble acid content were 7.5%，21.121N/cm2，7.2%，21.70mg/100g FW（fresh weight），27.4%and 0.35%，respectively.

chitosan biguandine hydrochloride；cherry tomatoes；antibacterial activity；fresh-keeping

TS255.3

A

1002-0306（2014）04-0306-05

2013－06－21 *通訊聯(lián)系人

陳佳陽（1986-），女，碩士研究生，研究方向：生物材料及水果保鮮。

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011B020310005）；華南農(nóng)業(yè)大學(xué)211工程基金項(xiàng)目（2009B010100001）。