葡萄糖氧化酶的固定化及其在快速檢測中的應用研究現(xiàn)狀

朱運平，劉文清，李秀婷，3，*，肖 林，王雅珍，伍少明，范園園

（1.北京工商大學食品學院，北京100048；2.食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京100048；3.北京市食品風味化學重點實驗室，北京100048；4.山東龍力生物科技股份有限公司，山東禹城251200）

葡萄糖氧化酶的固定化及其在快速檢測中的應用研究現(xiàn)狀

朱運平1，2，劉文清1，李秀婷1，3，*，肖 林4，王雅珍1，伍少明1，范園園1

（1.北京工商大學食品學院，北京100048；2.食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京100048；3.北京市食品風味化學重點實驗室，北京100048；4.山東龍力生物科技股份有限公司，山東禹城251200）

游離葡萄糖氧化酶在生產(chǎn)應用中易失活、儲存穩(wěn)定性差的缺點促進了人們對葡萄糖氧化酶固定化的方法及固定化載體的研究。固定化葡萄糖氧化酶在穩(wěn)定性、重復使用率等方面具有顯著的優(yōu)勢，在食品、醫(yī)藥、藥物殘留檢測等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，使得葡萄糖氧化酶的固定化技術(shù)成為人們熱衷的前沿生物技術(shù)之一。本文主要綜述了葡萄糖氧化酶的固定化方法與固定化載體，并對固定化葡萄糖氧化酶在快速檢測中的應用進行了闡述。

葡萄糖氧化酶，固定化，方法，快速檢測

葡萄糖氧化酶（GOD，E.C.l.l.3.4）能夠催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫，因其具有高效、專一、反應條件溫和等特點在食品、醫(yī)藥、發(fā)酵等領(lǐng)域中廣泛應用。游離的葡萄糖氧化酶在應用中存在穩(wěn)定性差、易失活、酶與底物難以分離，不利于產(chǎn)物的回收與連續(xù)生產(chǎn)等缺點[1-2]，因此，近年來人們致力于研究將游離葡萄糖氧化酶進行固定化，以彌補游離葡萄糖氧化酶在應用中的不足。酶固定化技術(shù)就是將酶束縛在某種載體中，保持酶活力，使固定化的酶能夠進行催化反應，并且可以重復使用[3]。傳統(tǒng)的葡萄糖氧化酶固定方法及載體存在一定缺陷，如酶易泄露，酶活損失較高，因此，目前國內(nèi)外學者不斷改進和發(fā)展新的固定化方法及固定化載體以解決目前葡萄糖氧化酶固定化過程中存在的問題，并不斷開拓固定化葡萄糖氧化酶的應用領(lǐng)域。如用具有導電性的金納米粒子固定葡萄糖氧化酶制備生物傳感器應用于快速檢測[4-6]。

葡萄糖氧化酶固定化的關(guān)鍵在于選用合適的固定化方法及固定化載體。本文對葡萄糖氧化酶的固定化方法、固定載體，及其相應固定化酶在食品快速檢測方面的應用現(xiàn)狀進行了綜述，旨在為固定化葡萄糖氧化酶的深入研究與應用拓展提供理論依據(jù)。

1 葡萄糖氧化酶固定化技術(shù)的研究現(xiàn)狀

1.1 葡萄糖氧化酶的固定化方法

關(guān)于葡萄糖氧化酶的固定化方法已有大量的文獻報道，不同的固定化方法對葡萄糖氧化酶的酶活性、穩(wěn)定性、重復使用率均有不同影響。目前葡萄糖氧化酶的固定化方法主要有四種：吸附法，包埋法，交聯(lián)法，共價結(jié)合法。其中吸附法和包埋法屬于物理法，交聯(lián)法和共價結(jié)合法屬于化學法[7-8]。

通過傳統(tǒng)固定化方法對葡萄糖氧化酶的固定，使得固定化酶不僅最適反應溫度得到了上升，酶的溫度穩(wěn)定性也相應提高；固定化對酶反應最適pH也有影響，一般使酶pH穩(wěn)定性提高；同時固定化酶表現(xiàn)出了良好的儲存穩(wěn)定性。張岳勛等[10]通過用羥基磷灰石為載體以吸附法固定葡萄糖氧化酶，使酶最適溫度提高了4℃，最適pH由原游離酶5.6上升到6.5，回收率提高了35.1%。肖志方等[11]以海藻酸鈣凝膠顆粒為載體采用包埋法將葡萄糖氧化酶固定，與游離酶相比最適溫度及pH分別提高了7℃、0.6，固定化葡萄糖氧化酶平均酶回收率為61.69%，重復使用率及儲存穩(wěn)定性也均有提高。Rauf及周濤等[12-13]分別采用交聯(lián)法與共價結(jié)合法對葡萄糖氧化酶固定化進行了研究，結(jié)果表明，固定化酶在pH穩(wěn)定性及儲存穩(wěn)定性方面均有明顯提高。

1.2 葡萄糖氧化酶的固定化載體

葡萄糖氧化酶的固定化按載體不同可分為：傳統(tǒng)載體材料固定及新型載體材料固定。傳統(tǒng)載體材料主要包括無機載體，有機高分子載體；新型載體材料分為磁性載體，導電載體等[14]。

1.2.1 傳統(tǒng)載體材料在葡萄糖氧化酶固定化中的應用

1.2.1.1 無機載體在葡萄糖氧化酶固定化中的應用

無機載體不僅價格低廉，而且具有來源方便、無毒、機械性及穩(wěn)定性好的特點。但無機載體結(jié)構(gòu)不易改變，影響了載體與酶之間的鍵合能力，而且在固定過程中會產(chǎn)生傳質(zhì)阻力，均不利于酶與固定載體的結(jié)合。通過對無機載體分子進行適當?shù)男揎椏梢愿纳拼祟愝d體對葡萄糖氧化酶的固定化效果。如美國、德國多家研究機構(gòu)通過對氧化鋁或二氧化硅無機載體進行修飾，顯著改善了酶與固定載體的結(jié)合效果[15]。

1.2.1.2 有機高分子載體在葡萄糖氧化酶固定化中的應用 有機高分子載體材料分為兩種：天然高分子凝膠載體與合成高分子有機材料載體。

a.天然高分子凝膠載體：天然高分子凝膠載體無毒、傳質(zhì)性好，但是強度低、易被微生物分解、使用壽命短。天然高分子載體在酶的固定化過程中能夠提高酶的親和力與生物相容性，有利于酶的固定化，改善酶促反應的微環(huán)境。瓊脂、海藻酸鈉等天然高分子載體材料已被廣泛應用，殼聚糖、甲殼素及其衍生物和絲素膜等則是新發(fā)展起來的天然高分子載體。

采用戊二醛，殼聚糖等天然高分子作為葡萄糖氧化酶固定載體，固定化酶不僅在操作穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性與底物親和力方面較游離酶顯著增強；利用交聯(lián)法將殼聚糖作為葡萄糖氧化酶的固定載體，制備生物傳感器能明顯增加膜的傳導性，這為固定化葡萄糖氧化酶在生物傳感器方面的應用提供了科學依據(jù)[16-17]。此外，有研究表明用賴氨酸修飾后的殼聚糖微球載體及以戊二醛作為交聯(lián)劑的殼聚糖微球應用于葡萄糖氧化酶的固定化中，不僅操作簡單，而且固定化的葡萄糖氧化酶具有很好的熱穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性、重復使用穩(wěn)定性，底物親和力也有所提高[18-20]。可見將天然高分子載體用于固定葡萄糖氧化酶具有顯著優(yōu)勢。

b.合成高分子有機材料載體：常見的合成高分子有機材料主要有聚丙烯酰胺，聚乙烯醇等。合成高分子有機材料強度大，但是傳質(zhì)差，近些年來人們開發(fā)出來了一些新型優(yōu)良載體，如聚乙烯醇氧化物、聚乙烯醇冷凍膠、聚苯乙烯磺酸鈉、聚苯乙烯/聚苯乙烯磺酸鈉PF凝膠載體（對苯二酚和甲醛聚合物）、多孔醋酸纖維素球形載體等。Rauf等[12]用醋酸纖維素有機玻璃固定葡萄糖氧化酶，不僅使酶的最適溫度提高，而且使酶呈現(xiàn)了良好的操作穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性。

1.2.2 新型載體材料在葡萄糖氧化酶固定化中應用

1.2.2.1 磁性載體在葡萄糖氧化酶固定化中的應用

磁性載體就是在具有磁性微粒的表面修飾功能性基團，使其與目標分子、細胞或膠體顆粒產(chǎn)生親和性，從而利用磁性顆粒制備出來的合適的載體[21]。磁性載體固定葡萄糖氧化酶主要是利用其磁效應，使固定化酶在反應體系中能夠被外磁場富集、分離和回收，方便了對酶反應進程的控制，同時也提高了酶的使用效率[13]。如帶有磁性的納米顆粒（NPs）合成Co-B/SiO2/NH2NPs用于固定葡萄糖氧化酶，在生物燃料細胞和生物傳感器上應用，具有高靈敏度與穩(wěn)定性[22]。

表1 固定葡萄糖氧化酶方法及其優(yōu)缺點Table.1 The merits of different methods on immobilization of glucose oxidase

很多學者在磁性載體的利用上多會選擇鐵氧化物，如姜德生等[20]將殼聚糖與Fe3O4納米粒子制成復合微粒，再與戊二醛交聯(lián)后使復合微球硬化，使得固定化的酶易于從混合體系中分離。另外，程娟[23]利用CuTAPP-Fe3SO4納米復合粒子固定葡萄糖氧化酶并且構(gòu)建了靈敏度高，穩(wěn)定性好的光纖葡萄糖生物傳感器。磁性載體方便分離回收的優(yōu)點使得人們越來越親睞用磁性載體固定葡萄糖氧化酶。

1.2.2.2 導電載體在葡萄糖氧化酶固定化中的應用導電載體分為兩類，一類是導電高聚物載體，一類是導電復合物載體。

導電高聚物主要是含共軛結(jié)構(gòu)和帶電的聚合物，包括聚吡咯、聚苯胺、聚噻吩等。Talay等[24]用聚吡咯和聚氨酯復合材料對葡萄糖氧化酶進行了固定化，并且制備成了生物傳感器，固定化酶在100bar、30℃時酶活力和比活達到最高，分別為0.040U/cm2和4.9U/mg，并且儲存21d酶活性仍保留80%。

導電復合體是通過對一些特殊物質(zhì)復合形成導電復合體。吳國權(quán)等[25]用納米碳管和納米金導電復合體對葡萄糖氧化酶固定化，并且制成了傳感器用于血糖濃度的測量，該生物傳感器不僅靈敏度高、穩(wěn)定性強、重復性好，而且成本低，操作簡單快速，能定量檢測血糖濃度。采用導電復合體固定化葡萄糖氧化酶制備生物傳感器在集成化設(shè)計與實現(xiàn)多通道多參數(shù)同步檢測方面具有推動作用。而且導電載體因其具有導電性在葡萄糖氧化酶固定化中的應用也多見于生物傳感器的開發(fā)。

2 固定化葡萄糖氧化酶在快速檢測中的應用

由于葡萄糖氧化酶在啤酒氧化，果汁澄清及面粉品質(zhì)改良等方面具有顯著改善產(chǎn)品品質(zhì)的效果[26-27]，固定化葡萄糖氧化酶在此類食品加工領(lǐng)域中也有廣泛應用。而固定化葡萄糖氧化酶另一個重要的應用領(lǐng)域是快速檢測行業(yè)，國內(nèi)外學者對固定化葡萄糖氧化酶在快速檢測的領(lǐng)域也有多項研究。本部分主要針對固定化葡萄糖氧化酶在食品，醫(yī)藥等領(lǐng)域的快速檢測行業(yè)應用現(xiàn)狀進行綜述。

2.1 固定化葡萄糖氧化酶在葡萄糖含量檢測中的應用

隨著固定化酶技術(shù)的不斷發(fā)展，生物傳感器應運而生，科學工作者將固定后的葡萄糖氧化酶制成生物傳感器應用在食品、醫(yī)學等領(lǐng)域。生物傳感器在食品方面主要用于食品中葡萄糖含量的控制與分析檢測，如在釀酒過程中對葡萄糖濃度進行連續(xù)檢測，更好地控制發(fā)酵過程；葡萄糖可被葡萄糖氧化酶氧化成葡萄糖酸和過氧化氫，過氧化氫與辣根過氧化物酶發(fā)生顏色反應，其反應產(chǎn)物在530nm下的吸收峰度值會隨葡萄糖濃度的增加而增加，利用這一原理可以測定葡萄糖含量[28-30]，因此，在醫(yī)學上，該種生物傳感器多用于糖尿病人血糖含量的檢測。固定化葡萄糖氧化酶檢測葡萄糖含量具有反應時間短、保存期較長、靈敏度高、反應快捷等優(yōu)點[31]。

2.2 固定化葡萄糖氧化酶在葡萄糖酸制備中的應用

葡萄糖氧化酶可以催化葡萄糖生產(chǎn)葡萄糖酸和過氧化氫。工業(yè)上將葡萄糖氧化酶固定化后生產(chǎn)葡萄糖酸可以提高葡萄糖氧化酶的使用率，節(jié)約生產(chǎn)成本[32]。

2.3 固定化葡萄糖氧化酶在蛋白純化中的應用

在蛋白生產(chǎn)工業(yè)中，固定化葡萄糖氧化酶主要用于蛋白的純化，通過消除蛋白中的葡萄糖，提高蛋白純度。Sisak等[33]通過實驗用戊二醛做交聯(lián)劑固定葡萄糖氧化酶來消除蛋白中的葡萄糖，從而使蛋白質(zhì)量顯著提高。

2.4 固定化葡萄糖氧化酶在藥物殘留檢測中的應用

在藥物殘留檢測中，固定化葡萄糖氧化酶作為偶聯(lián)劑的免疫傳感器可用于磺胺類藥物的檢測。葡萄糖氧化酶偶聯(lián)SMD后形成葡萄糖-SMD，利用抗原與抗體結(jié)合產(chǎn)生電信號，通過氧化峰電流的增值來測定SMD含量[34]。在制成的葡萄糖氧化酶-克倫特羅免疫傳感器中，可對克倫特羅（瘦肉精）進行快速檢測，靈敏度高、重現(xiàn)性好、檢測限低[35]。

3 展望

固定化葡萄糖氧化酶的諸多優(yōu)點，使得科研工作者們持之以恒地對固定化技術(shù)進行改善，雖然目前固定化葡萄糖氧化酶仍有缺點，但我們相信隨著固定化氧化酶研究的不斷深入，葡萄糖氧化酶的固定化技術(shù)會更加成熟，固定化葡萄糖氧化酶的應用會更加廣泛。

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Immobilization of glucose oxidase and its application in rapid detection

ZHU Yun-ping1，2，LIU Wen-qing1，LI Xiu-ting1，3，*，XIAO Lin4，WANG Ya-zhen1，WU Shao-ming1
（1.School of Food and Chemical Engineering，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China；2.Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients，Beijing Technology&Business University，Beijing 100048，China；3.Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry，Beijing 100048，China；4.Shandong Longlive Bio-technology Public Limited Company，Yucheng 251022，China）

Drawbacks of free glucose oxidase in application of production encourage people to study on the immobilization of glucose oxidase.The well stability，high reproducibility and other virtues of immobilized glucose oxidase have a significant advantage.Meanwhile，the immobilized enzyme plays an important role in food，medicine，residue detection of drugs.All of these make glucose oxidase enzyme immobilization technology be one of the most important frontier areas of biological technology.This article mainly summarized these various methods and fixed carriers of the immobilization of glucose oxidase，and the application of immobilized glucose oxidase in rapid detection were also stated.

glucose oxidase；immobilization；method；rapid detection

TS201.1

A

1002-0306（2014）04-0337-04

2013－05－23 *通訊聯(lián)系人

朱運平（1980-），女，博士，副教授，研究方向：功能性食品。

國家自然科學基金項目（31101332）；北京市屬高等學校人才強教計劃資助項目（PHR 20110872）；國家高技術(shù)研究發(fā)展（863）計劃項目（2012AA021502）；國家科技支撐計劃項目（2011BAD24B01）。