果蔬中多酚成分及其分析方法的研究進(jìn)展

范金波，蔡茜彤，鄭立紅，任發(fā)政，馮敘橋，*

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧錦州121013；2.河北科技師范學(xué)院，食品工程系，河北秦皇島066000；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083）

果蔬中多酚成分及其分析方法的研究進(jìn)展

范金波1，蔡茜彤1，鄭立紅2，任發(fā)政3，馮敘橋1，*

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧錦州121013；2.河北科技師范學(xué)院，食品工程系，河北秦皇島066000；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083）

果蔬是膳食的重要組成部分，富含多種多酚功能活性成分。多酚是植物的次級代謝產(chǎn)物，具有多種功效。多酚由于其強(qiáng)抗氧化活性，使其具有抗菌、抗病毒和抗炎的作用。天然來源多酚的開發(fā)以及在食品中的應(yīng)用已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。多酚種類繁多，分離、鑒定較復(fù)雜，研究者為了得到高靈敏度、高選擇性多酚分析方法進(jìn)行了大量研究。本文簡述了果蔬中的多酚成分，重點(diǎn)介紹了類黃酮、酚酸和單寧；綜述了多酚分析方法最近研究進(jìn)展，重點(diǎn)是基于色譜方法和分離技術(shù)的多酚的提取、分離和鑒定。以期為果蔬多酚在食品中的應(yīng)用提供參考和思路。

果蔬，多酚，提取，純化，性質(zhì)，方法

果蔬是膳食的重要組成部分，無論是鮮食還是加工產(chǎn)品在日常生活中都占有重要的地位。隨著人們生活水平的提高，人們對于食品的要求越來越高，更傾向于食用富含功能活性成分的食品。研究表明，果蔬作為植物源性食品原料，富含功能活性成分，包括多酚、類胡蘿卜素、有機(jī)堿、含氮化物和有機(jī)硫化物等[1]。

多酚成分是植物次生代謝產(chǎn)物，是果蔬的感官質(zhì)量和營養(yǎng)質(zhì)量的決定因素[2]。這些成分以一個苯環(huán)為支座包含一個或者多個羥基基團(tuán)，它們的結(jié)構(gòu)從簡單的苯類分子到復(fù)雜的高分子聚合體[3]。多酚成分是最廣泛存在的植物化學(xué)物質(zhì)，它對于植物的生理和形態(tài)起著非常重要的作用。多酚成分具有多樣的生物學(xué)功能，例如：植物抗毒素、拒食素、抗氧化劑[4]。這些生物活性對于植物生長和繁殖起著非常重要的作用，它們保護(hù)植物免于病原菌的侵?jǐn)_[5]。

研究報道天然來源的多酚成分作為食品防腐劑效果顯著，此外它還具有抗氧化、抗癌、抗輻射、降血壓、預(yù)防心腦血管疾病等多種功能活性[6-8]。目前，多酚已經(jīng)應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)的許多領(lǐng)域，例如：食品天然著色劑、食品防腐劑、顏料、化妝品等。因此，不同植物組織中多酚成分的分離鑒定成為研究的熱點(diǎn)[9]。

本文綜述了果蔬中主要的多酚成分和近年來多酚分析方法的研究進(jìn)展，重點(diǎn)是基于色譜方法和分離技術(shù)的多酚的提取、分離和鑒定方法。

1 果蔬中的多酚成分

多酚化合物指芳香烴中苯環(huán)上的氫原子被羥基取代所生成的化合物，是植物的重要次生代謝產(chǎn)物。多酚化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，但是都包含苯環(huán)和羥基基團(tuán)。根據(jù)苯環(huán)的數(shù)量和結(jié)合到苯環(huán)上的元素的不同將多酚分為類黃酮、酚酸、單寧、芪和木脂素類[10]。常見果蔬中的多酚成分見表1。

表1 常見果蔬中的多酚成分Table.1 Common phenolic compounds in fruits and vegetables

1.1 類黃酮

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的多酚種類超過8000種，其中有4000多種為類黃酮。類黃酮是一大類以苯色酮環(huán)為基礎(chǔ)的多酚化合物，分為黃酮、異黃酮、黃烷酮、黃酮醇、黃烷醇、花青素等[11]，廣泛存在于蘋果、香蕉、草莓、南瓜、胡蘿卜、西紅柿等水果、蔬菜中。類黃酮為低分子量化合物，由15個碳原子組成，按照C6-C3-C6結(jié)構(gòu)排列。類黃酮基本結(jié)構(gòu)包括兩個苯環(huán)，A和B，中間通過雜環(huán)C連接，C環(huán)取代基的多樣化決定了類黃酮的種類[11]。

類黃酮往往可以作為還原劑、氫質(zhì)子供體、活性氧的猝滅劑，因此它是一種重要的抗氧化劑[12]。類黃酮是最常見的植物化學(xué)物質(zhì)，它能夠保護(hù)植物抗紫外線照射、抗真菌寄生蟲、抗病菌以及抗氧化損傷[13]。研究發(fā)現(xiàn)人們經(jīng)常攝入類黃酮物質(zhì)后，心血管疾病和癌癥的發(fā)病率會明顯的降低[13-14]。Day[15]研究了類黃酮物質(zhì)的攝入量與人體慢性病之間的關(guān)系，對805名65歲到84歲間的荷蘭老年男子進(jìn)行過為期5年的實(shí)驗(yàn)觀察，在這5年時間里主要通過控制攝入茶葉、洋蔥、蘋果等使類黃酮的攝入量平均每人每天為26mg，結(jié)果發(fā)現(xiàn)冠心病的死亡率與類黃酮物質(zhì)的攝入量呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)。正是因?yàn)閿z入類黃酮物質(zhì)可能會促進(jìn)公眾健康，果蔬及產(chǎn)品中富含類黃酮，因此果蔬中類黃酮研究成為人們研究的熱點(diǎn)。

1.2 酚酸

酚酸占飲食多酚成分的三分之一左右，在植物中主要以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)存在，結(jié)合態(tài)酚酸主要通過酯、醚或者乙縮醛連接，酚酸不同的存在形態(tài)直接影響其提取條件[16-18]。酚酸主要分為兩大類：羥基苯甲酸類和羥基肉桂酸類。羥基苯甲酸類包括沒食子酸、對羥基苯甲酸、3，4-二羥苯甲酸、香草酸、丁香酸；羥基肉桂酸類包括咖啡酸、阿魏酸、對香豆酸、芥子酸[19]。

1.3 單寧

單寧是高分子量的化合物，主要分為水解單寧和縮合單寧兩種。原花青素是一種縮合型單寧，它是類黃酮聚合體，目前類黃酮的生物合成路徑已經(jīng)完全清楚，但是導(dǎo)致其聚合的原因尚不清楚?？s合型單寧研究主要以表兒茶素和兒茶素為主。水解型單寧是沒食子酸的衍生物，沒食子酸被酯化和氧化形成更復(fù)雜的水解單寧[20]。

單寧有多種生物學(xué)活性，因此可以作為金屬螯合劑，蛋白質(zhì)沉淀劑和抗氧化劑。正是由于其生物作用的多樣性和結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，目前很難找到一個模型精確的預(yù)測其生物學(xué)活性。以后研究的目標(biāo)就是找到構(gòu)效關(guān)系，從而有效的預(yù)測其生物學(xué)活性[21]。

2 多酚的提取方法

近年來，天然產(chǎn)物中多酚物質(zhì)的提取相關(guān)研究倍受關(guān)注。多酚提取是多酚物質(zhì)分離、鑒定和應(yīng)用中非常重要的一個步驟，目前還沒有一個簡單化和標(biāo)準(zhǔn)化的提取方法。研究者對果蔬中多酚的提取和分析進(jìn)行大量的研究，其中原料包括新鮮的、粉末狀的、烘干的和凍干的原料[22]。萃取過程中會同時萃取糖類、有機(jī)酸和蛋白質(zhì)，因此需要進(jìn)一步純化[23]。溶劑萃取和超臨界萃取技術(shù)是最常用的多酚提取方法[24-25]。溶劑萃取分為液-液萃取和固液萃取兩種。

傳統(tǒng)的加熱、回流提取方法用于提取多酚時，往往需要長時間加熱，由于提取過程中多酚的離解、水解和氧化導(dǎo)致多酚大量損傷。近年來，許多提取新技術(shù)已經(jīng)開始應(yīng)用到植物活性成分的提取，包括超聲波輔助提取、微波輔助提取、酶輔助提取、超臨界液體提取和高靜壓輔助提取[26]。超聲波輔助提取操作簡單、成本低廉、高效，完全可以替代傳統(tǒng)的提取方法。研究報道采用超聲波輔助法提取杜仲葉中多酚比加熱提取、微波輔助提取和酶輔助提取更有效[27]。酶輔助提取法也是有效提取多酚的方法。Maier等[28]研究了通過酶輔助法改進(jìn)葡萄果渣多酚的實(shí)驗(yàn)室提取方法和中試提取方法。高靜壓能夠加強(qiáng)物質(zhì)的傳遞，研究發(fā)現(xiàn)通過高靜壓輔助提取咖啡中的咖啡因和番茄果泥中的類胡蘿卜素均能得到較好的得率[29]。

3 多酚的分離和定量

目前人們對于多酚分析方法的靈敏度和選擇性要求越來越高，到目前為止盡管有大量的研究，但是不同多酚成分的分離和鑒定仍然比較困難，尤其是對于同時鑒定不同種類的多酚成分[11，14]。目前常用的多酚分離和定量方法主要有分光光度法、色譜法、毛細(xì)管電泳法等。

3.1 分光光度法

分光光度法可以用于植物多酚的定量，根據(jù)植物中多酚種類的不同采用不同的分光光度法，其中Folin-Ciocalteu法是測定總酚最常用的方法[2，11]，而原花青素法用來測定總的原花青素含量[4]。分光光度法能夠得到大量的多酚定性和定量的信息，加之操作簡單、成本低，目前已經(jīng)成為多酚定量的最常用的方法。分光光度法不足之處在于它僅僅估計(jì)總酚的量，而不是分離和定量單一的多酚成分。

3.2 色譜法

3.2.1 高效液相色譜法（HPLC） HPLC法是果蔬中多酚的分離鑒定的首選方法。HPLC法的色譜條件一般為：反相C18柱，紫外可見或者二級管陣列檢測器，雙溶劑系統(tǒng)（水和有機(jī)溶劑）。目前反相高效液相色譜已經(jīng)成為多酚分離和鑒定最常用的方法，其中檢測器包括DAD、質(zhì)譜和雙質(zhì)譜。表2總結(jié)了近年來部分HPLC法分離天然產(chǎn)物中多酚的研究報道。

表2 不同種類多酚成分HPLC法檢測條件Table.2 HPLC procedures in separation of different classes of polyphenolic compounds

HPLC法由于其靈敏度和檢測限的影響在分析復(fù)雜樣品（如：粗的提取物和環(huán)境樣品）時有一定的局限性。因此在進(jìn)行HPLC分析檢測前必須進(jìn)行樣品的預(yù)濃縮和純化。預(yù)濃縮就是為了簡化色譜分離，以更好的定性定量多酚成分。純化步驟是一個關(guān)鍵步驟，就是去除潛在的影響物質(zhì)。純化方法包括不相容溶劑間的細(xì)分法，Sephadex LH-20層析柱法，制備型液相法和固相萃取法等。

多酚通常通過高效吸附劑的吸附-解吸進(jìn)行純化，其中常用的吸附劑有C18和苯乙烯-二乙烯基苯共聚物[14]。研究者采用不同的大孔樹脂純化食用音加（INGA EDULIS）葉提取物中的多酚成分[30]。研究者采用不同的固體吸附劑對蜂蜜樣品進(jìn)行HPLC分析前的預(yù)分離和預(yù)濃縮[31]。固相萃取也常常用來純化多酚樣品，洗脫劑通常采用甲醇、乙醇或者它們的水溶液[14，31]。

HPLC法能夠勝任低分子量的多酚分析，而對于大分子量、結(jié)構(gòu)復(fù)雜多酚分析效果欠佳。目前，液質(zhì)連用技術(shù)（LC-MS）是植物多酚成分研究最好的方法和多酚結(jié)構(gòu)研究最有效的手段[32]。

3.2.2 高速逆流色譜法（HSCCC） HSCCC技術(shù)是20世紀(jì)70年代初，由美國國立健康研究院的Ito和Bowman在液液分配色譜的基礎(chǔ)上研究和發(fā)展起來的一種現(xiàn)代色譜分離制備技術(shù)[41]。HSCCC技術(shù)可直接制備分離粗提取，化合物的分離僅依賴于其不同的溶解性能，因其連續(xù)高效，回收率高，制備量大等特點(diǎn)，在各分離提純領(lǐng)域中的應(yīng)用越來越多，尤其是在天然產(chǎn)物活性成分的分離純化領(lǐng)域，目前已成為一種備受關(guān)注的新型分離純化技術(shù)。

近年來HSCCC技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物中黃酮類化合物的分離純化研究。Sutherland等[42]綜述了關(guān)于HSCCC技術(shù)分離純化天然產(chǎn)物有效成分的文獻(xiàn)報道，其中關(guān)于黃酮類化合物的報道有近一半。Cao等[43]利用凝膠色譜-HSCCC和液液萃取-HSCCC兩種方法分離和純化蘋果渣多酚。最佳的分離條件是采用Sephadex LH-20柱色譜層析，乙醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫。郭琳博等[44]利用HSCCC技術(shù)對柿子中的兒茶素類物質(zhì)進(jìn)一步分離純化得到兒茶素和表兒茶素。陸英等[45]采用HSCCC技術(shù)對紫甘薯花色苷分離純化最終得到了兩個高純度的花色苷單體組分。HSCCC將越來越多的用于生命科學(xué)、生物醫(yī)藥及食品科學(xué)等領(lǐng)域，相信在不久的將來HSCCC將發(fā)展成為一種更加成熟的可產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的高效分離純化技術(shù)。

3.3 毛細(xì)管電泳（CE）

CE是一種可以替代HPLC進(jìn)行分離的技術(shù)，特別適合于中低分子量極性成分的分析，與HPLC相比用時更短、分離效果更好[36]。CE由于其高效、短時、低樣品消耗等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)逐漸成為各種樣品多酚分析的常用手段。另外，與HPLC和GC相比，CE主要的不足是低靈敏度和較差的重現(xiàn)性[14]。研究報道采用CE進(jìn)行天然植物中類黃酮化合物的分離和鑒定，CE更適合于花青素的分離、鑒定和定量分析[36，46]。CE與ESIMI聯(lián)用可以用于花青素和類黃酮的鑒定[47]。

4 多酚結(jié)構(gòu)分析方法

4.1 核磁共振（NMR）

NMR技術(shù)在食品中的應(yīng)用越來越廣泛。該技術(shù)具有樣品準(zhǔn)備簡單、測量程序簡單、儀器穩(wěn)定和容易分析等優(yōu)點(diǎn)。目前應(yīng)用最廣泛的是氫核NMR和碳核NMR。植物樣品的NMR圖譜可以作為樣品比較、鑒定和分類的“指紋”。食品的樣品準(zhǔn)備相當(dāng)簡單，根據(jù)樣品天然狀態(tài)不同而異。某些樣品必須進(jìn)行前處理，例如：萃取或者分離。高分辨率的氫核NMR和碳核NMR樣品準(zhǔn)備時經(jīng)常加入5%～10%的重水到溶液中。

NMR技術(shù)在食品分析應(yīng)用中最大的限制因素是設(shè)備昂貴，樣品檢測成本高；再有NMR技術(shù)與HPLC或者GC相比，靈敏度不高。然而，該技術(shù)多種優(yōu)勢比成本更重要，這些優(yōu)勢是其他技術(shù)無法提供的。第一個優(yōu)勢體現(xiàn)在強(qiáng)大結(jié)構(gòu)解析能力；第二個優(yōu)勢是NMR可能是食品提取物的篩選的最好非靶技術(shù)：所有的主要代謝產(chǎn)物（脂肪酸，氨基酸和有機(jī)酸，糖，芳香族化合物）可以通過NRM技術(shù)同時檢測。

Caridi等[36]獲得洋蔥中槲皮素糖苷的1H NMR和1D NMR圖譜，并對槲皮素糖苷進(jìn)行了定量。Zhang等[48]以含重氫的DMSO和甲醇為溶劑，測定了胡桃核的1H NMR和13C NMR圖譜，從而鑒定胡桃核的抗氧化活性。目前，1H NMR和13C NMR已經(jīng)成為花青素鑒定的首選方法。NMR技術(shù)常常用來鑒定花青素與其他化合物的反應(yīng)的生成物，例如：苯乙烯酸衍生物、過氧化氫自由基、兒荼素和黃酮醇等[47]。

4.2 質(zhì)譜（MS）

MS是一種分析技術(shù)，主要用來分析分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，例如肽類、多酚和其他化學(xué)物質(zhì)。MS在多酚研究中扮演著重要的角色，主要用來分析多酚化合物結(jié)構(gòu)組成。MS原理是化學(xué)物質(zhì)在高真空下，經(jīng)物理化學(xué)途徑形成帶電粒子，某些帶電粒子可進(jìn)一步斷裂，通過對樣品離子質(zhì)荷比的分析而實(shí)現(xiàn)對樣品進(jìn)行定性和定量。

LC-MS聯(lián)用技術(shù)是植物多酚研究最有效的分析方法，尤其是對于花青素結(jié)構(gòu)的研究。LC-MS可以進(jìn)行復(fù)雜多酚結(jié)構(gòu)的鑒定，如：原花青素、原花色素、原花翠素和鞣酸[49]。劉玉芹等[50]應(yīng)用高效液相色譜-電噴霧/四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析了紫甘藍(lán)和羽衣甘藍(lán)中的花色苷成分，分別從紫甘藍(lán)和羽衣甘藍(lán)中分離并檢測到了16種和17種花色苷，方法快速、準(zhǔn)確、不需標(biāo)準(zhǔn)品。王百川等[51]建立國產(chǎn)油橄欖葉中多酚化合物的超高壓液相色譜-飛行時間質(zhì)譜定性分析方法，鑒定出了橄欖葉中15種多酚化學(xué)成分?？紫楹绲萚52]利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了濃縮果汁中多酚物質(zhì)的測定方法，結(jié)果表明該方法重復(fù)性好、靈敏度高。

4.3 近紅外光譜（NIR）

NIR是一種有效的、快速的、準(zhǔn)確的、無損的分析方法。Hall等[53]應(yīng)用NIR技術(shù)預(yù)測了紅茶葉中黃素的含量和水分含量。Schulz等[54]采用NIR技術(shù)預(yù)測了綠茶葉中生物堿和多酚成分同時存在。研究者利用NIR技術(shù)分析綠茶中的主要多酚成分的含量并進(jìn)行綠茶抗氧化活性的定量分析[55]。最近，NIR技術(shù)用來同時分析綠茶中游離氨基酸含量、咖啡因含量、總酚含量和多糖含量[33]。NIR技術(shù)作為一種快速、無損檢測技術(shù)在果蔬多酚成分檢測方面將有廣闊的應(yīng)用前景。

5 結(jié)論

果蔬多酚具有多種生物活性，應(yīng)用領(lǐng)域日趨廣泛。高純度植物多酚的提取分離將會成為植物多酚開發(fā)利用的發(fā)展方向。隨著研究的不斷深入，人們對于多酚分析方法的要求越來越高，目前為止盡管有大量的研究，但是對于同時鑒定不同種類的多酚成分仍然比較困難，這就要求提高原有分析方法的靈敏度和選擇性或者開發(fā)出新的高靈敏度和高選擇性的分析方法。

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Research progress in polyphenolic compounds and its methods for characterisation in fruits and vegetables

FAN Jin-bo1，CAI Xi-tong1，ZHENG Li-hong2，REN Fa-zheng3，F(xiàn)ENG Xu-qiao1，*
（1.Food Science Research Institute of Bohai University，F(xiàn)ood Safety Key Lab of Liaoning Province，Jinzhou 121013，China；2.Department of Food Engineering，Hebei Normal University of Science And Technology，Qinhuangdao 066600，China；3.College of Food Science&Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

Fruits and vegetables，with functional components such as phenolic compounds，are important diet parts of human beings.Polyphenols are known as secondary plant metabolites and exert several functional activities.These components possess also antimicrobial，antiviral and anti-inflammatory properties along with their high antioxidant capacity.Development and application of polypenols derived from natural source have already become a research priority in food industry.Methods of determination and characterisation of polyphenol variety are complex，many efforts have been made to provide a highly sensitive and selective analytical method for the determination and characterisation of polyphenols.The aim of this paper was to elucidate polyphenols in fruits and vegetables，such as flavonoids，phenolic acids and tannins and to provide information on the most recent developments in the chemical investigation of polyphenols emphasising the extraction，separation and determination of these compounds by chromatographic and spectral techniques.The purpose of this paper was to provide reference and ideas on application of polypenols in food.

fruits and vegetables；polyphenols；extraction；purification；characterization；methods

TS201.2

A

1002-0306（2014）04-0374-06

2013－07－31 *通訊聯(lián)系人

范金波（1977-），男，博士，講師，主要從事食品生物化學(xué)方面的研究。

渤海大學(xué)人才引進(jìn)基金項(xiàng)目（BHU20120301）；渤海大學(xué)博士啟動基金項(xiàng)目（BHU201250）。