廣西甜茶生理活性成分及其提取純化研究進(jìn)展

葛益銀，張 濤，張凌云，王忠華，*

（1.浙江萬里學(xué)院生物技術(shù)研究所，浙江寧波315100；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東廣州510642）

廣西甜茶生理活性成分及其提取純化研究進(jìn)展

葛益銀1，2，張 濤1，張凌云2，王忠華1，*

（1.浙江萬里學(xué)院生物技術(shù)研究所，浙江寧波315100；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東廣州510642）

廣西甜茶，為懸鉤子屬，具有較高的食用與藥用價值，如降血糖、血脂、血壓、促進(jìn)新陳代謝、調(diào)節(jié)人體免疫功能等功效。廣西甜茶含有甜茶苷、多酚、氨基酸、黃酮類化合物等多種生理活性成分，目前人們采用各種方法提取與純化這些功能性成分，并取得較大進(jìn)展。本文對廣西甜茶的生理活性成分、藥理作用、分離純化工藝及其開發(fā)與應(yīng)用研究作了較詳盡的綜述，為廣西甜茶的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供依據(jù)。

廣西甜茶，生理活性成分，分離純化

廣西甜茶（Rubus suavissimus S.Lee），又名甜葉懸鉤子，是二十世紀(jì)八十年代初調(diào)查發(fā)現(xiàn)的薔薇科懸鉤子屬一新種，為廣西特有的無毒、低熱能、高甜度和具有保健功能的野生珍稀甜味植物[1-2]。其為多年生帶刺落葉灌木，莖直立或傾斜，常被白粉，幼苗時紫紅色，上端皮刺較密，成長后變綠色，上半部無皮刺或稀具皮刺，先端常彎垂，髓心大；枝條稀疏，圓柱狀，稍軟，亦常彎垂，綠色，被白粉，疏生皮刺，上端多平滑，二年生枝條具短枝數(shù)條至十余條不等。單葉互生，掌狀深裂，裂片披針形或橢圓形，中央裂片較長，先端漸尖呈尾狀，邊緣具重鋸齒；花單生，白色；聚合果卵球形，幼時灰青色，熟時橙紅色，味甜可食[3]。懸鉤子在我國分布較廣，長江、珠江流域都可見到；在朝鮮、日本等國也有分布。但有甜味的主要分布在我國廣東、廣西及湖南、江西等省區(qū)[4]。

自1981年廣西甜茶被命名以來，國內(nèi)外的研究人員對其進(jìn)行了廣泛的研究，包括野生種質(zhì)資源評價、良種選育、化學(xué)成分、醫(yī)學(xué)、毒理學(xué)等方面。本文就廣西甜茶的生理活性成分、功能特性與分離純化工藝及其產(chǎn)品開發(fā)與應(yīng)用研究狀況進(jìn)行了較全面的綜述，為廣西甜茶的進(jìn)一步開發(fā)利用提供新的思路與技術(shù)支撐。

1 廣西甜茶的生理活性成分

據(jù)測定，甜茶干茶中含碳水化合物60%左右；蛋白質(zhì)及氨基酸1.8%～12.6%，且含有八種人體必須氨基酸；鮮葉維生素含量為64.01～114.86mg/100g，主要是類胡蘿卜素、維生素C、維生素E、葉酸、尼克酸、維生素A、維生素B12等；剛長定型綠色葉片含量最高，幼嫩芽葉次之，老黃葉最低。甜茶干茶總灰分在4.86%～5.2%之間，主要礦物質(zhì)為鉀、鈉、鈣、鐵、鎂、鋁、錳等元素以及磷酸鹽、碳酸鹽、氯化物等無機(jī)鹽[5]。廣西甜茶富含各種礦物質(zhì)含量，其中甜茶葉的Ca、K、Na、Mg和Mn含量明顯大于根和莖[6]。

此外，許多學(xué)者對甜茶葉中的化學(xué)成分進(jìn)行了定性研究，他們利用親脂性原理，發(fā)現(xiàn)提取物中含有皂甙、甾體及萜類、有機(jī)酸、香豆素與萜類內(nèi)酯化合物等[7-8]。他們還利用RP-HPLC法，采用保留時間定性，證實了甜茶葉中含有甜茶素、多酚、氨基酸、黃酮類化合物等；其水提物的水解產(chǎn)物中含有槲皮素與山奈酚[7-8]。

2 廣西甜茶的藥理作用

廣西甜茶，民間稱為“神茶”，常飲有滋肝補(bǔ)腎、清熱解毒、生津潤肺、止咳化痰和利咽的功效，廣泛用于醫(yī)藥、飲料和食品中。對于廣西甜茶的具體藥理作用，以及生理活性成分的功效，國內(nèi)外學(xué)者開展了卓有成效的研究，取得較大進(jìn)展。主要包括以下幾點。

2.1 抗過敏、抗炎的作用

過敏反應(yīng)是指一部分人對花粉、化學(xué)物質(zhì)、動物皮毛甚至某些食物等有特殊的感受性，是一種異常的免疫反應(yīng)。國內(nèi)外的研究普遍認(rèn)為甜茶多酚是抗過敏活性的主要成分[9-10]，韋保耀等[11]采用Morgan-Elson法追蹤測定廣西甜茶抗過敏活性成分，經(jīng)過薄板層析、紫外光譜、紅外光譜定性及高效液相色譜檢測，發(fā)現(xiàn)廣西甜茶中抗過敏有效成分為C6-C3-C6水解型鞣花鞣質(zhì)。滕建文等[12]采用小鼠被動皮膚過敏實驗、小鼠耳廓腫脹實驗、大鼠皮膚毛細(xì)血管通透性實驗和二硝基氯苯致遲發(fā)型皮膚過敏實驗對甜茶提取物進(jìn)行抗過敏性評價，結(jié)果表明甜茶的抗過敏活性物質(zhì)屬于水解多酚類，而且其作用與純度有關(guān)。方耀高等[13]則進(jìn)行2，4-二硝基氟苯（DNFB）及綿羊紅細(xì)胞（SRBC）誘發(fā)的小鼠遲發(fā)型過敏反應(yīng)和小鼠異種被動皮膚過敏反應(yīng)（PCA），觀察給予連續(xù)口服廣西甜茶提取物的抗過敏作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與模型組相比，連續(xù)口服廣西甜茶提取物125、250、500mg/kg均能顯著抑制由DNFB誘發(fā)小鼠耳腫脹及血管通透性的增高。高山等[14]采用大鼠被動皮膚過敏等類似的方法，觀察甜茶提取物的抗過敏作用。結(jié)果表明甜茶提取物能明顯抑制大鼠被動皮膚過敏和小鼠耳異種被動皮膚過敏引起的炎癥滲出：延長豚鼠支氣管痙攣引起哮喘發(fā)作的潛伏期；減少二硝基氯苯所致遲發(fā)型皮膚過敏小鼠耳片重量，并對組織胺誘發(fā)豚鼠足跖腫脹有一定的對抗作用。

2.2 抗氧化、清除體內(nèi)自由基的功效

譚冬明[8]利用分光光度法進(jìn)行了甜茶各成分清除自由基實驗和測定總抗氧化能力，并與人工合成的抗氧化劑BHT比較。結(jié)果表明，甜茶抗氧化能力有效成分為甜茶黃酮，在同濃度下清除自由基能力：甜茶黃酮提取物＞BHT＞粗品，甜茶素沒有清除自由基能力；同濃度下（0.5mg/mL）總抗氧化能力：甜茶黃酮提取物＞BHT＞粗品。曹培培等[15-16]則是采用·OH化學(xué)發(fā)光體系，加入不同濃度甜茶醇提物后測定發(fā)光強(qiáng)度來檢測其自由基清除能力。結(jié)果表明，甜茶提取物在5～10mg/mL濃度范圍內(nèi)具有較強(qiáng)的自由基清除能力和抑制不同氧化劑激發(fā)的脂質(zhì)過氧化作用。

2.3 對變形鏈球菌的抑制作用

李莉[17]采用比色法觀察不同濃度的甜茶提取物-甜茶皂苷對變形鏈球菌的生長、玻棒黏附的影響，結(jié)果表明甜茶皂苷在濃度高于0.625g/100mL時對變形鏈球菌的黏附有抑制性，黏附力隨甜茶皂苷濃度升高而降低。黃麗微[18]通過體外研究發(fā)現(xiàn)，在試管稀釋法實驗中，甜茶甙濃度在20g/100mL以上的培養(yǎng)基內(nèi)無變鏈菌生長，濃度在10g/100mL以下的培養(yǎng)基內(nèi)均有變鏈菌生長，且隨著甜茶甙濃度的降低，溶液中變鏈菌的濃度增加。甜茶甙可抑制變鏈菌產(chǎn)酸，并顯著抑制變鏈菌在表面的粘附作用，其抑制作用明顯高于同濃度的木糖醇。甜茶甙對變鏈菌菌液中葡萄基轉(zhuǎn)移酶的酶活性也具有一定抑制作用，降低了變鏈菌水不溶性胞外多糖的合成，較同濃度的木糖醇有更明顯的抑制作用[18]。

2.4 具止咳祛痰、抗炎、止痛和鎮(zhèn)靜作用

民間早有使用甜茶代茶飲用的習(xí)慣，用于治療咽炎。目前有研究報道甜茶提取物有抗過敏和舒張支氣管作用[19-20]。鐘正賢等[21]采用動物實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)廣西甜茶提取物對小鼠濃氨水實驗性咳嗽有止咳作用；能明顯增加小鼠呼吸道酚紅排出量；抑制小鼠二甲苯所致耳腫；可減少醋酸所致扭體次數(shù)和抑制自發(fā)活動；廣西甜茶提取物的急性毒性實驗表明，其最大耐受量為199.8g/kg。

2.5 抑制動物小腸收縮運(yùn)動作用

黃彥峰等[22]采用離體腸段實驗法和小腸推進(jìn)運(yùn)動實驗法，觀察不同濃度甜茶提取液對家兔離體小腸收縮活動及小鼠在體小腸推進(jìn)運(yùn)動的效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對家兔不同部位離體小腸平滑肌的收縮運(yùn)動均有抑制作用，使其張力降低，收縮幅度變小，而高劑量組對收縮頻率有減少作用；對小鼠小腸運(yùn)動有明顯的抑制作用。同樣，趙麗平等[23]采用常規(guī)離體灌注小腸平滑肌標(biāo)本活動的實驗方法，針對不同劑量的甜茶提取液，觀察用藥前后的平滑肌收縮幅度和收縮頻率的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在收縮幅度方面，低、中、高劑量組均有高度顯著性差異；在收縮頻率方面，低劑量組無變化，中、高劑量組有顯著性差異。滴加乙酰膽堿后，被抑制收縮的離體小腸的收縮力顯著上升，表明兩者有一定的拮抗作用。

2.6 抗腫瘤作用

吳燕春等[24]研究發(fā)現(xiàn)，廣西甜茶總黃酮在體外可抑制S180、H22和L1210腫瘤株的增殖，其中對H22抑制作用最強(qiáng)（IC5046.31μg/mL）；對S180抑制作用次之（IC5071.48μg/mL）；對L1210抑制作用最弱（IC50163.59μg/mL）。黃榮崗等[25]則是對廣西甜茶提取物體內(nèi)抗腫瘤實驗進(jìn)行研究，分別考察提取物對小鼠肉瘤S180和小鼠肝癌H22移植瘤的作用，結(jié)果表明低、中、高劑量組甜茶提取物均對小鼠肉瘤S180或肝癌H22移植瘤有不同程度的抑制作用，其中高劑量組對兩種瘤體的抑制作用均達(dá)到顯著水平。

3 廣西甜茶生理活性成分的提取與純化技術(shù)研究

縱觀廣西甜茶的生理活性功能，起主要作用的是甜茶多酚、黃酮類物質(zhì)以及甜茶苷三類物質(zhì)。因此人們采用各種方法對廣西甜茶上述三類生理活性成分開展了分離純化技術(shù)的比較與工藝優(yōu)化研究，取得可喜進(jìn)展。

3.1 甜茶多酚的提取與純化

據(jù)研究表明，廣西甜茶中含有超過10%的甜茶茶多酚[4]，在甜茶素浸提過程中絕大部分甜茶茶多酚也被提取出來，這些甜茶茶多酚是甜茶粗提物苦澀味的主要來源。高程海等[26]通過對水抽提、醇抽提、水提堿轉(zhuǎn)法三種甜茶多酚抽提工藝進(jìn)行對比，得出水提堿轉(zhuǎn)法為較好的一種抽提方法。通過正交實驗得出，影響甜茶多酚提取效率的主要因素為抽提時間，其次為pH，受提取溫度和料液比的影響較小；最佳提取工藝為提取溫度85℃，時間30min，pH8.5，料液比1∶10，在此條件下的甜茶多酚得率為3.91%。程雅芳等[27]利用響應(yīng)面分析法對復(fù)合酶輔助提取甜茶多酚的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)選出最佳提取條件為纖維素酶和果膠酶以3∶4的比例混合而成的復(fù)合酶；在45℃的水浴條件下，加酶量為0.6%（m/m）、pH4.95、酶解時間47.76min、料液比1∶23.58（g/mL），酶解后的原料用體積分?jǐn)?shù)40%的乙醇溶液、料液比1∶28（g/mL）、溫度70℃回流提取70min，甜茶茶多酚得率為13.32%。

甜茶素粗提物廢渣中含有豐富的甜茶茶多酚，具有較高的開發(fā)利用價值。林繼元等[28]通過靜態(tài)吸附實驗，選出DM-301大孔吸附樹脂對甜茶茶多酚有較高的吸附量和很高的解析率，是分離純化甜茶茶多酚的良好吸附劑。通過動態(tài)吸附實驗得知，提取液適合的上柱濃度為2mg/mL，上柱液的pH為5.5，流速為1.2BV/h。通過對比實驗，選飽和柱的最佳洗脫劑為70%的乙醇溶液；洗脫品中甜茶茶多酚純度達(dá)72.12%。水解型鞣花鞣質(zhì)為廣西甜茶中主要的一類活性物質(zhì)，是存在于植物體內(nèi)的一類結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的多元酚類化合物。高程海等[29]研究了8種大孔吸附樹脂及聚酰胺對水解鞣質(zhì)的吸附與解析性能，從中選出LSA-21樹脂具有較大吸附量和解吸率。薛茗月等[30]進(jìn)一步通過動態(tài)吸附實驗得知當(dāng)上柱濃度為3mg/mL、pH為4.8、流速為1.2BV/h，用60%乙醇洗脫可得相對較高純度的水解鞣質(zhì)（71.03%）。最近有學(xué)者以甜茶根為原料，經(jīng)提取、有機(jī)溶劑萃取、重結(jié)晶等，得到了鞣花酸晶體。

3.2 黃酮類物質(zhì)的提取與純化

黃酮類化合物是植物次生代謝產(chǎn)物之一，廣泛存在自然界的某些植物和漿果中，其功效是多方面的，可有效清除體內(nèi)的氧自由基、改善血液循環(huán)、降低膽固醇等。研究表明，甜茶各部位總黃酮含量依次為嫩葉、中莖皮、老莖皮、果實、嫩莖皮、老葉、中莖、老莖[31]。林繼元等[32]通過正交實驗得出最佳提取條件為乙醇濃度30%，料液比1∶30，提取溫度50℃，提取時間40min。在該條件下總黃酮的提取得率為3.85%[33]。其中影響廣西甜茶葉總黃酮提取效果的主次因素為：乙醇濃度＞溶劑用量＞提取次數(shù)＞提取時間。程雅芳等[34]則是采用乙醇回流提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法和復(fù)合酶輔助提取法分別對廣西甜茶中總黃酮的提取工藝進(jìn)行了研究。實驗結(jié)果表明，超聲波輔助提取的方法提取率最高，其最佳提取工藝條件為乙醇濃度為50%（v/v），料液比為1∶40，超聲波功率和提取時間分別為52W、30min，提取溫度為40℃，其提取得率可達(dá)12.69%。至于如何富集純化廣西甜茶中的黃酮類物質(zhì)，有學(xué)者利用聚酰胺對廣西甜茶提取物進(jìn)行分離層析，并采用紫外分光光度法，以根皮苷含量為指標(biāo)，從而篩選出的最優(yōu)工藝參數(shù)，即將樣液濃度控制在3.39～5.24mg/mL范圍內(nèi)，上樣液體積控制在4BV以內(nèi)，室溫下以流速2BV/h吸附飽和；解吸時先用4BV水洗，再用6BV的95%乙醇解吸，流速2BV/h，收集洗脫液。結(jié)果95%乙醇洗脫液總固物中總黃酮純度可達(dá)71.55%，精制度高達(dá)591.94%[35]。天然黃酮類化合物種類眾多，而以廣西甜茶葉為原料提取黃酮，經(jīng)水解、有機(jī)溶劑萃取、柱層析等，得到高純度甙元；經(jīng)熔點、TLC、液相色譜、紅外光譜、核磁共振法等進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征分析，證實甜茶含有黃酮甙，其甙元為槲皮素和山奈酚[36]。

3.3 甜茶苷的提取與純化

廣西甜茶的主要甜味成分是甜茶苷（Rubusoside），又稱甜茶素、甜葉懸鉤子苷，為斯替維醇（Steviol）和葡萄糖結(jié)合而成的四環(huán)二萜甙，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與甜葉菊苷（Stevioside，斯替維甙）相似[37]。其甜味的純正程度接近蔗糖，相對甜度是2%蔗糖溶液的150倍[38]。甜茶苷作為一種高甜度、低熱量、口味純正的非蔗糖天然甜味劑，日益受到重視，是廣西甜茶中有效活性成分提取純化研究最多的，也取得較大進(jìn)展。如盧昕等[39]采用反相高效液相色譜法（反相C18柱；甲醇-水體積比為85∶15）溶液為流動相，流速1.0mL/min；紫外檢測（波長210nm；柱溫20℃；外標(biāo)法定量）測定了廣西甜茶中的甜茶素，結(jié)果表明甜茶素的質(zhì)量濃度為20～1200mg/L時，其峰面積與質(zhì)量濃度具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.998。最近樊蘭蘭等[40]采用RSLC-DAD技術(shù)（色譜柱為Dionex RSLC120 C18柱（50mm×2.1mm，2.2μm），流動相為乙腈-水（36∶64），檢測波長205nm，柱溫40℃，流速0.3mL/min，進(jìn)樣量2μL）測定了廣西甜茶制劑中的甜茶素含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甜茶素的線性范圍為0.03～0.6μg；樣回收率為99.1%，RSD為0.97%（n=9）。林繼元等[41]運(yùn)用超聲波輔助提取技術(shù)從廣西甜茶中提取甜茶素可顯著降低浸提溫度，縮短浸提時間，提高浸提效率。以乙醇水溶液為浸提溶劑，在40kHz超聲波條件下，廣西甜茶甜茶素的最佳提取工藝條件為乙醇水溶液的濃度為30%，溶劑用量為30BV，浸提時間20min，浸提2次，浸提溫度為40℃，甜茶素的提取率可達(dá)5.6%。周如金等[42]的研究結(jié)果表明AB-8樹脂是理想的甜茶苷吸附劑，適宜純化條件為：原料液質(zhì)量濃度為7.7mg/L、pH約為8、流速為3BV/h、室溫下以70%乙醇溶液為洗脫劑、用量為5BV或40℃下以60%乙醇溶液為洗脫劑。陳全斌等[43]以甜茶葉為原料，加水煮沸（3次）、過濾合并濾液、柱吸附、水洗至無色、75%乙醇洗脫、將洗脫液干燥得粗提、用無水乙醇溶解、過濾、旋干、精制產(chǎn)品。取精制品柱層析、重結(jié)晶等，制備出單體，經(jīng)紅外光譜、核磁共振結(jié)構(gòu)表征分析，表明該化合物為甜茶苷。

4 廣西甜茶的產(chǎn)品開發(fā)與展望

甜茶在廣西民間一直作為茶飲用，在國內(nèi)甜茶除了制作成品干茶外，也可制成袋泡茶或加工成茶飲料。在日本，甜茶被開發(fā)成多種飲料、糖果和藥粒等。近年來，隨著肥胖癥、糖尿病及心血管病患者人數(shù)日益增多，人們越來越希望食品中所使用的蔗糖被無熱值或低熱值的甜味劑所替代，因而甜茶甙有望成為新的甜味劑，并作為一種新型的非致齲性糖代用品。在前人研究的基礎(chǔ)上，陳小芳[44]按照保健食品的配方原則與健齒護(hù)齒的保健目標(biāo)，通過正交實驗，確定甜茶護(hù)齒含片的最優(yōu)處方為甜茶甙5.5g，微晶纖維素20g，糊精74.5g，薄荷腦1g，再采用傳統(tǒng)濕法制粒法，以片劑的生產(chǎn)方法制備。

綜上所述，廣西甜茶內(nèi)含物質(zhì)豐富，具有“茶、糖、藥”3種功效，其發(fā)展前景非常廣闊。從目前的研究技術(shù)與水平，結(jié)合廣西甜茶自身的特點，未來的研究方向可從以下幾個方面進(jìn)行。第一是廣泛收集野生甜茶種質(zhì)資源的基礎(chǔ)上進(jìn)行廣西甜茶選種與育種工作，同時開展相對應(yīng)的綠色高效栽培技術(shù)研究，從而保證廣西甜茶原料的品質(zhì)與產(chǎn)量；第二是將傳統(tǒng)茶類的加工方式融入廣西甜茶的加工工藝中，制成各類茶飲料，拓寬廣西甜茶的市場需求與銷售渠道，更好地滿足不同消費(fèi)者的需求；第三是繼續(xù)加強(qiáng)廣西甜茶中各類生理活性成分分析與檢測，并根據(jù)其特性分別開展最適提取純化方法與工藝研究，同時開展廣西甜茶各類生理成分的毒理學(xué)實驗，為廣西甜茶的進(jìn)一步開發(fā)與利用提供科學(xué)依據(jù)。

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Research progress in physiologically active compounds，products isolation and purification of Rubus suavissimus S.Lee

GE Yi-yin1，2，ZHANG Tao1，ZHANG Ling-yun2，WANG Zhong-hua1，*
（1.Institute of Biotechnology，Zhejiang Wanli University，Ningbo 315100，China；2.College of Horticulture，South China Agriculture University，Guangzhou 510642，China）

Guangxi sweet tea，Rubus suavissimus S.Lee was a kind of raspberry.It had high edible and medicinal value，such as reducing of blood sugar，blood fat，blood pressure，promoting metabolism，regulating the body’s immune function and so on.Rubus suavissimus S.Lee which was rich in nutritional components，containing several physiologically-active compounds like rubusoside，polyphenols，flavonoids，amino acids，etc. So far，many methods are used to extract and purify above functional ingredients and the advances have been gained.The biologically active components，pharmacological effects，separation and purification process development and application of Rubus suavissimus S.Lee were in detail reviewed in this paper，which would provide the basis for the further research and development of Guangxi sweet tea.

Rubus suavissimus S.Lee；physiologically-active compounds；isolation and purification

S571.1

A

1002-0306（2014）04-0388-05

2013－01－08 *通訊聯(lián)系人

葛益銀（1987-），女，碩士研究生，主要從事園藝植物資源利用方面的研究。