燙漂工藝對(duì)西蘭花多酚氧化酶的影響

張 帝，湯文晶，陳興京，張慶慶，*，湯義明，錢起光

（1.安徽工程大學(xué)，生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖241000；2.蕪湖新欣食品實(shí)業(yè)有限公司，安徽蕪湖241000）

燙漂工藝對(duì)西蘭花多酚氧化酶的影響

張 帝1，湯文晶1，陳興京1，張慶慶1，*，湯義明2，錢起光2

（1.安徽工程大學(xué)，生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖241000；2.蕪湖新欣食品實(shí)業(yè)有限公司，安徽蕪湖241000）

以鄰苯二酚為底物，通過(guò)分光光度計(jì)法，對(duì)西蘭花中的多酚氧化酶（PPO）進(jìn)行了研究，同時(shí)建立了西蘭花PPO活性測(cè)定方法。結(jié)果表明，西蘭花PPO活性的最適測(cè)定條件為：檢測(cè)波長(zhǎng)為415nm，反應(yīng)溫度為35℃，pH為7.2。同時(shí)對(duì)燙漂西蘭花的工藝進(jìn)行了研究，確定了最佳燙漂條件為：燙漂溫度為95℃，燙漂時(shí)間為90s，燙漂后立刻用冰水冷卻并凍藏，在此條件下，有效鈍化西蘭花PPO活性的同時(shí)還能有效的降低顏色的損失，具有良好的保色作用。

西蘭花，多酚氧化酶，燙漂，鈍化

西蘭花為十字花科蕓薹屬，一年生宿根草本植物。它是一種營(yíng)養(yǎng)成分齊全的高檔蔬菜，并具有增強(qiáng)肝臟的解毒能力、提高免疫力和防癌的優(yōu)點(diǎn)[1]。西蘭花中含有豐富的黃酮類和多酚類化合物，在加工過(guò)程中，當(dāng)組織完整性被破壞或膜受到傷害后，潛在的多酚氧化酶（PPO）大量被激活，催化原料中的多酚，使其氧化為醌，醌再發(fā)生聚合反應(yīng)生成黑色物質(zhì)，植物組織的褐變隨之發(fā)生[2-3]，這是導(dǎo)致西蘭花發(fā)生褐變的主要原因。燙漂是果蔬速凍加工前預(yù)處理的關(guān)鍵工藝，是為了破壞果蔬的氧化酶系統(tǒng)，能夠有效地鈍化多酚氧化酶的活性，防止因酶的氧化而產(chǎn)生褐變[4]，使制品保持美觀的色澤。本研究對(duì)西蘭花PPO的測(cè)定條件、燙漂過(guò)程中PPO的鈍化及護(hù)色作用進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，確定了西蘭花PPO反應(yīng)體系的最大吸收波長(zhǎng)，得到測(cè)定的反應(yīng)條件，并確定了最佳燙漂工藝，探討了燙漂對(duì)PPO的鈍化與西蘭花保鮮保色之間的關(guān)系，為蔬菜加工提供有效依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西蘭花 蕪湖新欣食品實(shí)業(yè)有限公司；其余試劑 均為分析純。

DS-200型高速組織搗碎機(jī) 江陰市保利科研器械有限公司；YP1002型電子天平 上海佑科儀器儀表有限公司；HS-J2型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)（中國(guó)）有限公司；L5型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司；pHS-3C型酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PPO粗酶液的提取及最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定 取洗凈的西蘭花花冠部分按料液比1∶5（w/v）加入預(yù)冷的磷酸緩沖液（0.2mol/L，pH=7.2）于組織搗碎勻漿機(jī)中，低溫勻漿2min，轉(zhuǎn)移至離心管中，于10000r/min、4℃離心15min，上清液即為粗酶液，4℃保存?zhèn)溆肹5]。取PPO粗酶液1mL，用磷酸鹽緩沖液（0.2mol/L，pH= 7.2）稀釋4倍后，在波長(zhǎng)350～800nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描。

1.2.2 反應(yīng)體系最大吸收波長(zhǎng)和PPO相對(duì)酶活的測(cè)定 取磷酸緩沖液（0.2mol/L，pH=7.2）2mL，0.2mol/L鄰苯二酚溶液1mL、PPO粗酶液1mL至比色皿中，迅速搖勻，35℃下靜置反應(yīng)5min。以磷酸鹽緩沖液為參比，在波長(zhǎng)350～800nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，確定反應(yīng)體系的最大吸收波長(zhǎng)。以在PPO最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定的吸光值表示PPO的相對(duì)酶活（即設(shè)同組實(shí)驗(yàn)中吸光值最大的相對(duì)酶活為100%）。

1.2.3 溫度對(duì)PPO酶促反應(yīng)速率的影響 按照1.2.2的方法，其余條件不變，分別在溫度為20、25、30、35、40、45、50℃條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在415nm下測(cè)定PPO粗酶液OD值，測(cè)得不同溫度條件下的相對(duì)酶活，確定最佳酶促反應(yīng)溫度。

1.2.4 pH對(duì)PPO酶促反應(yīng)速率的影響 按照1.2.2的方法，選定溫度為35℃，其余條件不變，調(diào)整磷酸緩沖液的pH分別為6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在415nm下測(cè)定PPO粗酶液OD值，測(cè)得不同pH條件下的相對(duì)酶活，確定最佳酶促反應(yīng)pH。

1.2.5 底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速率的影響 按照1.2.2的方法，選定溫度為35℃，pH7.2，其余條件不變。分別加入濃度為0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4mol/L的鄰苯二酚溶液1mL作為底物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在415nm下測(cè)定PPO粗酶液OD值，測(cè)得不同底物濃度條件下的相對(duì)酶活，確定酶促反應(yīng)的最佳底物濃度。

1.2.6 最佳燙漂溫度的選擇 燙漂溫度對(duì)PPO活性的影響 分別稱取適量的西蘭花花冠于為80、85、90、95、100℃的熱水中燙漂，時(shí)間分別為30、60、90、120、150s。處理至規(guī)定時(shí)間后，迅速放入-1℃冰水中冷卻3min，瀝干后按照1.2.1的方法處理獲得PPO粗酶液并分為兩部分，一部分用磷酸鹽緩沖液稀釋4倍，在678nm處測(cè)定其OD678值，以O(shè)D678值作為西蘭花的保色指標(biāo)。另一部分在PPO最佳反應(yīng)條件下測(cè)定PPO殘存酶活。

1.2.7 最佳燙漂時(shí)間的選擇 分別稱取適量西蘭花花冠95℃中水燙漂30、60、90、120、150、180、210s，處理至規(guī)定時(shí)間后迅速放入-1℃冰水中冷卻3min，瀝干瀝干后按照1.2.1的方法處理獲得PPO粗酶液并分為兩部分，一部分用磷酸鹽緩沖液稀釋4倍，在678nm處測(cè)定其OD678值，另一部分按照1.2.1的方法處理，在PPO最佳反應(yīng)條件下測(cè)定PPO殘存酶活。

1.2.8 燙漂后冷卻方法的選擇 稱取適量西蘭花花冠若干份，在溫度為95℃的熱水中分別燙漂30、60、90、120、150s。處理至規(guī)定時(shí)間后，每種試樣分兩部分處理：一部分處理完畢后用風(fēng)扇進(jìn)行吹風(fēng)冷卻至室溫并瀝干，按照1.2.1的方法處理，測(cè)定PPO殘存酶活；另一部分用迅速放入-1℃冰水中冷卻3min，瀝干后再用聚乙烯薄膜包裹放入冰箱冷凍室中凍藏，取部分凍藏的試樣按照1.2.1的方法處理，測(cè)定PPO殘存酶活，比較兩部分所測(cè)酶活的差異[6]（燙漂過(guò)程的PPO相對(duì)酶活均以相同批次的未經(jīng)處理的西蘭花花冠所提取的PPO粗酶液的活性作為最大值）。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定

PPO粗酶液和體系反應(yīng)產(chǎn)物在可見(jiàn)光350～800nm之間的波長(zhǎng)掃描圖如圖l所示。

圖1 波長(zhǎng)掃描譜圖Fig.1 Wavelength scanning spectra

由圖1可看出，PPO粗酶液在678nm處有最大吸收峰，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7-8]，葉綠素的吸收波長(zhǎng)在600～700nm之間，以678nm作為葉綠素的測(cè)定波長(zhǎng)，其OD值可作為西蘭花燙漂后保色的指標(biāo)，波長(zhǎng)掃描前期沒(méi)有波峰出現(xiàn)，排除了其他物質(zhì)對(duì)PPO活性測(cè)定的影響。而PPO反應(yīng)體系產(chǎn)物在415nm具有最大吸收峰，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[9-12]，PPO反應(yīng)的最大吸收波長(zhǎng)在405～420nm之間，以415nm作為PPO活性的最大測(cè)定波長(zhǎng)。體系產(chǎn)物在415nm后掃描曲線較為平滑，且在600～700nm之間無(wú)吸收峰，說(shuō)明底物鄰苯二酚對(duì)葉綠素有破壞作用且在實(shí)驗(yàn)條件下破壞的較為徹底。

圖2 溫度對(duì)PPO活性的影響Fig.2 Effect of temperature on PPO activity

2.2 PPO活性最佳反應(yīng)條件的確定

2.2.1 PPO反應(yīng)最適溫度的確定 溫度對(duì)西蘭花PPO活性的影響見(jiàn)圖2，由圖2可知，西蘭花PPO反應(yīng)最適溫度為35℃。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，不同植物的PPO最適溫度不同，可能是因?yàn)椴煌参锏腜PO的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)上的差異所導(dǎo)致[13]，也可能是由于不同植物體內(nèi)和PPO發(fā)生協(xié)同作用的酶類的不同所導(dǎo)致。如圖2所示，PPO活性先隨溫度升高而上升，在35℃時(shí)達(dá)到最大值。由于隨著溫度繼續(xù)升高，分子的熱運(yùn)動(dòng)加劇，PPO空間結(jié)構(gòu)改變，活性中心三維結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致PPO活力降低[13]，這與酶的特性相一致。在20～50℃時(shí)，西蘭花PPO相對(duì)較穩(wěn)定，所以在燙漂過(guò)程中可通過(guò)高溫處理，鈍化PPO的活性[14]，在貯藏過(guò)程中，盡量選擇低溫以降低PPO的活性。

2.2.2 PPO反應(yīng)最適pH的確定 由圖3可知，采用鄰苯二酚為底物時(shí)pH對(duì)西蘭花PPO活力的影響，西蘭花PPO反應(yīng)最適pH為7.2。這也與文獻(xiàn)報(bào)道多數(shù)水果中的PPO在接近中性pH時(shí)顯示最大的活力相一致。在酸性和堿性時(shí)，酶活力急劇下降，當(dāng)pH＜6.2或pH＞7.8時(shí)，PPO相對(duì)酶活顯著下降。原因是PPO作為一種含銅的蛋白質(zhì)，當(dāng)pH較低時(shí)，輔基銅將以Cu2+的形式解離出來(lái)；當(dāng)pH較高時(shí)，輔基銅則會(huì)解離生成Cu（OH）2[15]，兩種情況均可使PPO的活性顯著降低。在果蔬加工貯藏中，通過(guò)調(diào)節(jié)pH可有效的抑制PPO活力。

圖3pH對(duì)PPO活性的影響Fig.3 Effect of pH on PPO activity

2.2.4 PPO反應(yīng)最適底物濃度的確定 圖4為底物濃度對(duì)PPO活性的影響，在供試反應(yīng)體系中，當(dāng)鄰苯二酚濃度為0.05～0.25mol/L時(shí)，酶活性呈上升增長(zhǎng)趨勢(shì)，酶活與濃度成正比例的關(guān)系，表現(xiàn)為一級(jí)反應(yīng)。當(dāng)濃度為0.25～0.4mo1/L時(shí)，酶活性的變化趨于平緩，表現(xiàn)為零級(jí)反應(yīng)。說(shuō)明該酶促反應(yīng)適宜的鄰苯二酚用量為0.25mol/L，當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到這一適宜值時(shí)，再增加底物濃度對(duì)酶的活性作用不大。這是因?yàn)楫?dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，有一些酶的活性部位未能與底物結(jié)合，隨著底物濃度的增加，更多的酶活性部位與底物相結(jié)合，使酶促反應(yīng)充分進(jìn)行，在達(dá)到一定濃度后，所有的酶活性部位都與底物結(jié)合，此時(shí)，酶活性部位被底物飽和，進(jìn)一步提高底物濃度也不能提高酶活性，酶活性達(dá)到最大值[16]。

圖4 底物濃度對(duì)PPO活性的影響Fig.4 Effect of the substrate concentration on PPO activity

2.3 燙漂工藝的確定

2.3.1 最佳燙漂溫度的確定 圖5為西蘭花在不同溫度燙漂不同時(shí)間對(duì)PPO活性的影響，由圖5可知，85℃燙漂150s后，PPO相對(duì)酶活仍有39%，而100℃處理30s后，PPO相對(duì)酶活僅有33%；80～95℃燙漂150s后，PPO相對(duì)酶活在39%～27%之間，而100℃處理150s后，PPO相對(duì)酶活僅有10%，說(shuō)明燙漂溫度越高，燙漂時(shí)間越長(zhǎng)，PPO相對(duì)酶活越低，這與酶在高溫下變性這一特點(diǎn)相符合。其中100℃鈍化酶活的能力最為顯著。但是在蔬菜燙漂加工時(shí)除了要鈍化PPO活性，還要考慮蔬菜的保色和保鮮，不同燙漂溫度對(duì)西蘭花顏色的影響見(jiàn)圖6。

圖5 不同溫度燙漂不同時(shí)間對(duì)PPO活性的影響Fig.5 Effect of the blanching different temperature with different time on PPO activity

圖6為西蘭花燙漂90s后在678nm處測(cè)得的OD678值。由圖6可看出，燙漂溫度為80～95℃，OD678值略有下降但幅度很小，但燙漂溫度為100℃燙漂90s后，OD678值驟降至0.081。說(shuō)明西蘭花中所含的葉綠素會(huì)在95～100℃條件下會(huì)被破壞。結(jié)合圖5，選擇95℃作為燙漂溫度進(jìn)行研究。

圖6 不同溫度燙漂90s后的OD678值Fig.6 OD678value of different blanching temperature after the 90s

2.3.2 最佳燙漂時(shí)間的確定 圖7不僅表明西蘭花在95℃燙漂不同時(shí)間對(duì)PPO活性的影響，還能表明對(duì)西蘭花顏色的影響，由圖7可看出，燙漂處理30s和90s后，PPO相對(duì)酶活由53%下降到35%，降幅較大，原因是由于燙漂時(shí)間過(guò)短，西蘭花內(nèi)部沒(méi)有處理徹底，內(nèi)部殘存的PPO相對(duì)酶活比較高，燙漂90s和210s后，西蘭花PPO相對(duì)酶活僅由35%下降到26%。下降幅度較小，原因是由于西蘭花內(nèi)部處理徹底，整個(gè)樣品燙漂充分，酶活鈍化較徹底。

由圖7還可以看出，西蘭花在燙漂處理30～120s之間，OD678值下降幅度較小，而在燙漂120s以后，OD678值下降幅度較大，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因應(yīng)該和PPO活性變化的原因一樣。綜合來(lái)看，選擇90s和120s作為燙漂時(shí)間較為合理，此時(shí)西蘭花PPO相對(duì)酶活分別為35%和30%，同時(shí)都可以有效的護(hù)色。從生產(chǎn)角度出發(fā)，選擇90s作為處理時(shí)間可以有效的減少成本。因此選擇燙漂90s作為西蘭花燙漂時(shí)間。

圖7 95℃燙漂不同時(shí)間對(duì)PPO活性和OD678值的影響Fig.7 Effect of the different blanching time at 95℃on PPO activity and OD678value

2.3.3 冷卻方法對(duì)PPO活性的影響 冷卻方法對(duì)西蘭花PPO活性的影響如圖8所示。由圖8可知，經(jīng)過(guò)95℃燙漂處理90s，經(jīng)過(guò)冰水冷卻的西蘭花PPO相對(duì)酶活（35%）低于常溫（20～25℃）吹風(fēng)冷卻的西蘭花的PPO相對(duì)酶活（45%），這是因?yàn)榻?jīng)冰水冷卻后凍藏的西蘭花植物細(xì)胞中會(huì)形成冰晶會(huì)使胞內(nèi)可溶性PPO失活，并且在凍結(jié)過(guò)程中大量胞內(nèi)液向胞外滲透，胞內(nèi)未凍液高離子強(qiáng)度可能會(huì)造成可溶性PPO活性下降[17]。

圖8 冷卻方法對(duì)PPO活性的影響Fig.8 Effect of the type of cooling on PPO activity

由圖8還可以看出，隨著燙漂時(shí)間的增加，常溫吹風(fēng)冷卻和冰水冷卻的相對(duì)酶活差值增加。這是因?yàn)闋C漂過(guò)程中，隨著燙漂時(shí)間的增加，PPO鈍化的較為充分，冷卻方式對(duì)PPO活性的影響更為明顯。選擇冰水冷卻可以直接有效的降低PPO活性并且有利于后續(xù)加工工藝的操作。

3 結(jié)論

在實(shí)驗(yàn)條件下，西蘭花PPO以鄰苯二酚為底物，

其PPO活性的最佳測(cè)定波長(zhǎng)為415nm，最佳反應(yīng)溫度為35℃，最佳pH為7.2，最佳底物濃度為0.25mol/L。在西蘭花的加工和貯藏過(guò)程中要避開(kāi)此溫度和pH，以避免發(fā)生酶促褐變。
燙漂可以有效地鈍化西蘭花PPO活性，并以PPO活性和葉綠素OD678為指標(biāo)，適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)溫度和時(shí)間，結(jié)合工廠生產(chǎn)的情況，確定了西蘭花在95℃燙漂90s時(shí)，燙漂后立刻用冰水冷卻并凍藏的燙漂工藝條件，其PPO殘存酶活在35%，對(duì)西蘭花的顏色還有較好的保護(hù)作用，滿足了廠家生產(chǎn)的要求，同時(shí)，能有效延長(zhǎng)西蘭花的貯藏期，為提高其食用價(jià)值和商品價(jià)值提供了理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

[1]勾雪嬌，袁云香，吳翠平，等．西蘭花的實(shí)用價(jià)值分析[J]．農(nóng)產(chǎn)品加工，2012（4）：72-73．

[2]Kiattesak D，Richard K A．Comparatative study of polyphenoloxidases from taro and potato[J]．Food Chemistry，1999，64（3）：351-359．

[3]孔俊豪，孫慶磊，涂云飛，等．多酚氧化酶酶學(xué)特性研究及其應(yīng)用進(jìn)展[J]．中國(guó)野生植物資源，2011，30（4）：13-17．

[4]李余霞，王清章，李潔，等．速凍藕帶燙漂工藝研究[J]．北方園藝，2011（14）：158-161．

[5]張福平，屈佳慧．豌豆多酚氧化酶的特性及抑制劑研究[J]．廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（5）：135-146．

[6]程宏，侯金鐸，劉浪．幾種蔬菜燙漂后過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定[J]．冷飲與速凍食品工業(yè)，1997（2）：15-27．

[7]曹建敏，姚恒．烤煙葉片葉綠素含量的測(cè)定及其與SPAD值的關(guān)系[J]．分子植物育種，2009，7（1）：56-62．

[8]袁方，李鑫，余君萍，等．分光光度法測(cè)定葉綠素含量及其比值問(wèn)題的探討[J]．植物生理學(xué)通訊，2009，45（1）：63-66．

[9]周向軍，高義霞，袁毅君，等．“黑美人”馬鈴薯多酚氧化酶的特性研究[J]．食品工業(yè)科技，2011，32（1）：115-117．

[10]韓龍，王貴慶．國(guó)產(chǎn)大麥多酚氧化酶酶學(xué)特性的初步研究[J]．啤酒科技，2008（12）：49-51．

[11]鐘振聲，潘曉琴，方穎通．菊芋多酚氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)[J]．華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，38（12）：135-139．

[12]許正虹，劉璇，高彥祥．紫甘薯多酚氧化酶性質(zhì)研究[J]．食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32（8）：18-22．

[13]王磊，阮征，駱成堯，等．馬鈴薯多酚氧化酶酶學(xué)特性及熱穩(wěn)定性模型的研究[J]．食品工業(yè)科技，2012，33（1）：92-96．

[14]Wang M，Sun J，F(xiàn)eng WH，et al．Identification of a ripeningrelated lipoxygenase in tomato fruit as blanchingindicator enzyme [J]．Process Biochemistry，2008（43）：932-936．

[15]Wang JH，Jiang WB，Wang BG，et al．Partial properties of polyphenol oxidase in mango[J]．Journal of Food Biochemistry，2007（31）：45-55．

[16]孫月娥，張俊韜，王衛(wèi)東．金針菇中多酚氧化酶活性測(cè)定及其護(hù)色研究[J]．食品工業(yè)，2011（11）：68-70．

[17]晏紹慶，劉寶林，華澤釗．凍結(jié)速率對(duì)蘋果片多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶活性影響的研究[J]．食品工業(yè)科技，2000，21（2）：8-10．

Effects of blanching conditions on polyphenol oxidase activity of broccoli

ZHANG Di1，TANG Wen-jing1，CHEN Xing-jing1，ZHANG Qing-qing1，*，TANG Yi-ming2，QIAN Qi-guang2
（1．College of Biology and Chemical Engineering，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China；2．Wuhu Xinxin Food Industrial Co．，Ltd.，Wuhu 241000，China）

Polyphenol oxidase（PPO）of broccoli was investigated through spectrophotometric method by using catechol as substrate．And an examination method for the activity of broccoli PPO was established．Results showed that the optimum conditions for detection of PPO activity from broccoli were as followings：absorption wave length 415nm，35℃and pH7.2．The processing technology about blanching was investigated，results indicated that optimum condition of blanching was at 95℃for 90s，after blanching treated with cooling type of ice water immediately．Under the condition，the PPO activity of broccoli could be effectively passivation and the loss of color could reduce effectively，giving a good color retention．

broccoli；polyphenol oxidase；blanching；passivation

TS201.1

A

1002-0306（2014）04-0144-04

2013－07－08 *通訊聯(lián)系人

張帝（1989－），男，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)與利用。

蕪湖市年度科技計(jì)劃（2011農(nóng)業(yè)-13）。