利用葡萄枯枝蔓發(fā)酵生產(chǎn)木霉菌劑的初步研究

丁蘇，張勁，張瑛，楊瑩，管敬喜，文仁德，李瑋*

（1.廣西大學(xué)行健文理學(xué)院，廣西南寧530004；2.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄與葡萄酒研究所，廣西南寧530007）

利用葡萄枯枝蔓發(fā)酵生產(chǎn)木霉菌劑的初步研究

丁蘇1，張勁2，張瑛2，楊瑩2，管敬喜2，文仁德2，李瑋2*

（1.廣西大學(xué)行健文理學(xué)院，廣西南寧530004；2.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄與葡萄酒研究所，廣西南寧530007）

利用葡萄枯枝蔓和甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液為主要培養(yǎng)基原料，發(fā)酵生產(chǎn)綠色木霉（Trichoderma viride）孢子菌劑。以產(chǎn)孢量為測(cè)定指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)優(yōu)化了培養(yǎng)基的組成，并測(cè)試了發(fā)酵基質(zhì)不滅菌對(duì)于木霉發(fā)酵的影響。研究結(jié)果表明：葡萄枯枝蔓和糖蜜酒精發(fā)酵液適宜作為生產(chǎn)綠色木霉的廉價(jià)培養(yǎng)基，優(yōu)化后培養(yǎng)條件為固態(tài)基質(zhì)粒徑10～40目，糖蜜酒精發(fā)酵液中硫酸銨添加量1.0%，糖蜜酒精發(fā)酵液濃度5°Bx，培養(yǎng)基固液混合比2.5∶1（g∶mL）。在此條件下，綠色木霉JK-20直接發(fā)酵未滅菌培養(yǎng)基產(chǎn)孢子量可達(dá)1.12×1010CFU/g。

葡萄枝蔓；糖蜜酒精發(fā)酵液；綠色木霉；固態(tài)發(fā)酵

木霉是一類具有較強(qiáng)生物防治功效的絲狀真菌，其具有生長(zhǎng)迅速、能分泌多種抑菌物質(zhì)、能夠?qū)χ参锊≡M(jìn)行重寄生等生理特性，因而在國(guó)內(nèi)外被廣泛的用于多種植物病害的生物防治研究[1-3]。其中，綠色木霉（Trichoderma viride）因其生物防治效果明顯、環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)要求低等優(yōu)勢(shì)，成為生產(chǎn)木霉商品級(jí)菌劑的重要菌株。目前木霉的商品級(jí)農(nóng)藥劑主要為活性孢子粉制劑，通過(guò)葉面噴施、處理種子或灌施至土壤和植物根系等方式施用[4-7]。木霉孢子菌劑的生產(chǎn)大多采用糧食作為培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵[8-9]，生產(chǎn)成本較高，這導(dǎo)致木霉菌劑的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力不足。為了解決這一困擾木霉菌劑應(yīng)用的問(wèn)題，研究人員嘗試了許多利用農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及農(nóng)產(chǎn)品加工產(chǎn)生的生物質(zhì)廢棄物發(fā)酵木霉的方法[10-12]，并已取得了一些進(jìn)展。

近年來(lái)，由于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院開(kāi)發(fā)的葡萄“一年兩收栽培”技術(shù)體系在廣西推廣應(yīng)用[13]，廣西的葡萄栽培面積迅速擴(kuò)大，在帶來(lái)可觀的經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，栽培過(guò)程中產(chǎn)生的大量枯枝蔓，已經(jīng)成為難以處理的一大問(wèn)題。目前對(duì)于葡萄枯枝蔓的處理主要是通過(guò)焚燒的方式以消除葡萄園病原微生物孳生的風(fēng)險(xiǎn)，這樣就造成了環(huán)境的污染和生物質(zhì)資源的浪費(fèi)，不符合現(xiàn)代循環(huán)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展趨勢(shì)，但目前尚無(wú)對(duì)這一廢棄物資源加以利用的研究報(bào)道。

本研究以葡萄枯枝蔓為固體發(fā)酵基質(zhì)，輔以廣西特色大宗農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液作為補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)成分的液體基質(zhì)，通過(guò)培養(yǎng)基優(yōu)化，嘗試?yán)梦礈缇牧畠r(jià)農(nóng)業(yè)廢棄物及加工副產(chǎn)物發(fā)酵生產(chǎn)綠色木霉孢子菌劑，以期實(shí)現(xiàn)廣西葡萄栽培廢棄物的循環(huán)再利用，并為發(fā)酵生產(chǎn)廉價(jià)木霉菌劑提供新的技術(shù)路線。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄枯枝蔓由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院明陽(yáng)葡萄基地提供；糖蜜酒精發(fā)酵液由南寧糖業(yè)集團(tuán)提供。

綠色木霉（Trichoderma viride）JK-20：廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄與葡萄酒研究所篩選并保藏。

保藏培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，自來(lái)水1 000 mL，pH自然。

產(chǎn)孢子固體培養(yǎng)發(fā)酵基質(zhì)：葡萄修剪產(chǎn)生的枯枝蔓，甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液，（NH4）2SO4。

葡萄糖（分析純）、硫酸銨（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉（生化級(jí)）：北京奧博星公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XB-K-25血球計(jì)數(shù)板：上海安信光學(xué)儀器公司；HH. B11.600-S恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；B11-2磁力攪拌器：上海司樂(lè)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將保藏的綠色木霉JK-20斜面上的孢子用生理鹽水洗下制備成濃度為105CFU/mL的單孢子懸浮液，稀釋涂布于PDA平板上，30℃培養(yǎng)36 h，挑取生長(zhǎng)迅速、表面長(zhǎng)滿綠色孢子的單菌落接種于PDA斜面上，30℃培養(yǎng)3 d，至斜面培養(yǎng)基表面長(zhǎng)滿。

1.3.2 固態(tài)發(fā)酵方法及產(chǎn)孢量測(cè)定

將葡萄枯枝蔓按要求粉碎過(guò)篩，（NH4）2SO4預(yù)先溶解于稀釋至5°Bx的糖蜜酒精發(fā)酵液中，二者按比例混合均勻后，稱取10 g裝入250 mL三角瓶中封口滅菌，活化后的綠色木霉斜面種子用生理鹽水制備濃度為107CFU/mL的單孢子懸浮液。將單孢子懸浮液接入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)5 d。發(fā)酵后取1 g發(fā)酵物，0.1%吐溫水稀釋，在磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?，血球?jì)數(shù)板測(cè)定孢子濃度[14]。

1.3.3 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的單因素試驗(yàn)

粒徑對(duì)產(chǎn)孢量的影響：將葡萄枯枝蔓按常規(guī)粉碎，分別過(guò)10目、40目和80目篩，得到4種不同細(xì)度的基質(zhì)，其粒徑大小范圍由粗到細(xì)分別為≥10目、10～40目、40～80目、≤80目，將它們對(duì)應(yīng)編號(hào)為1、2、3、4號(hào)樣品。按葡萄枯枝蔓顆粒/糖蜜酒精發(fā)酵液2∶1（g∶mL）的比例加入5°Bx的糖蜜酒精發(fā)酵液，充分混勻后按每瓶裝料量100 g的量分裝于500 mL三角瓶中，121℃濕熱滅菌30 min，冷卻后每瓶接種1 mL種子液，30℃靜置培養(yǎng)5 d，至基質(zhì)表面長(zhǎng)滿均勻的綠色孢子為止。培養(yǎng)物于45℃烘干后，用無(wú)菌水洗滌制備孢子懸浮液，再用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定孢子生成量。

固液基質(zhì)配比對(duì)產(chǎn)孢量的影響：分別按葡萄枯枝蔓顆粒/糖蜜酒精發(fā)酵液1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1和3.0∶1（g∶mL）配制發(fā)酵基質(zhì)，按上述方法接種、發(fā)酵并測(cè)定孢子生成量。

糖蜜酒精發(fā)酵液濃度對(duì)產(chǎn)孢量的影響：分別調(diào)整糖蜜酒精發(fā)酵液的濃度為1.0°Bx、2.5°Bx、5.0°Bx、7.5°Bx和10.0°Bx，按上述中方法接種、發(fā)酵并測(cè)定孢子生成量。

氮源添加量對(duì)產(chǎn)孢量的影響：分別在混料前將0.5%、 1%、2%、3%和4%的（NH4）2SO4溶于糖蜜酒精發(fā)酵液中，混料后按上述方法接種、發(fā)酵并測(cè)定孢子生成量。

1.3.4 利用未滅菌基質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)木霉菌劑試驗(yàn)

將木霉種子孢子液接種于經(jīng)121℃高壓溫?zé)釡缇?0 min或未滅菌的糖蜜酒精發(fā)酵液中，預(yù)培養(yǎng)24 h后，分別與經(jīng)121℃高壓溫?zé)釡缇?0 min和未滅菌的固體基質(zhì)混合，30℃靜置培養(yǎng)5 d，至基質(zhì)表面長(zhǎng)滿均勻的綠色孢子為止。培養(yǎng)物于45℃烘干后，用無(wú)菌水洗滌制備孢子懸浮液，懸浮液用8層擦鏡紙過(guò)濾除菌絲后，稀釋涂布于PDA平板上，30℃靜置培養(yǎng)36 h，統(tǒng)計(jì)木霉菌落的生成量，換算出孢子的生成量。通過(guò)對(duì)比研究基質(zhì)是否滅菌對(duì)于木霉菌劑發(fā)酵的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 固體基質(zhì)粒徑對(duì)產(chǎn)孢量的影響

在固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，固體基質(zhì)的粒徑大小對(duì)發(fā)酵的影響很大[12]，粒徑過(guò)大，基質(zhì)的比表面積則小，微生物難以在短時(shí)間內(nèi)充分利用基質(zhì)顆粒，粒徑過(guò)小，則容易造成培養(yǎng)基結(jié)團(tuán)或內(nèi)部空隙過(guò)小，不利于發(fā)酵系統(tǒng)的傳質(zhì)、傳熱。因而，兩種情況均不利于微生物充分利用基質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)。不同基質(zhì)粒徑條件下綠色木霉JK-20的產(chǎn)孢子量如圖1所示。由圖1可知，2號(hào)處理樣品（粒徑為10～40目）的基質(zhì)最適于木霉產(chǎn)孢，其產(chǎn)孢量可達(dá)1.2×1010CFU/g干培養(yǎng)物。

圖1 固體基質(zhì)粒徑對(duì)于產(chǎn)孢量的影響Fig.1 Effect of particle size of raw materials on spore production

2.1.2 固液基質(zhì)配比對(duì)產(chǎn)孢量的影響

在固態(tài)發(fā)酵中，適宜的固液配比能使培養(yǎng)基具有最適的含水量，從而保持較好的疏松度，有利于微生物生長(zhǎng)和發(fā)酵過(guò)程中的傳質(zhì)傳熱[15-16]。本實(shí)驗(yàn)中，糖蜜酒精發(fā)酵液為固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)基基質(zhì)提供了水分、無(wú)機(jī)鹽類、部分氮源和碳源。不同的葡萄枯枝蔓顆粒/糖蜜酒精發(fā)酵液條件下JK-20的產(chǎn)孢子量結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，當(dāng)葡萄枯枝蔓顆粒/糖蜜酒精發(fā)酵液為2.5∶1（g∶mL）時(shí)JK-20的產(chǎn)孢子量最高，達(dá)到1.37×1010CFU/g干培養(yǎng)物。

圖2 固液基質(zhì)比例對(duì)于產(chǎn)孢量的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on spore production

2.1.3 糖蜜酒精發(fā)酵液濃度對(duì)產(chǎn)孢量的影響

糖蜜酒精發(fā)酵液在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)木霉的生長(zhǎng)提供了多種營(yíng)養(yǎng)成分[17]。糖蜜酒精發(fā)酵液濃度過(guò)低，木霉的菌絲體生長(zhǎng)較弱，影響孢子的生成總量；糖蜜酒精發(fā)酵液濃度過(guò)高，木霉菌絲體生長(zhǎng)過(guò)于旺盛，也會(huì)影響孢子的分化。糖蜜酒精發(fā)酵液的濃度對(duì)JK-20的產(chǎn)孢子量的影響如圖3所示。由圖3可知，產(chǎn)孢子量隨糖蜜酒精發(fā)酵液的濃度增大而增加，當(dāng)糖蜜酒精發(fā)酵液的濃度＞5°Bx，產(chǎn)孢量趨于穩(wěn)定，因而選擇5°Bx作為最適糖蜜酒精發(fā)酵液濃度。

圖3 糖蜜酒精發(fā)酵液濃度對(duì)于產(chǎn)孢量的影響Fig.3 Effect of molasses alcohol fermentation mash concentration on spore production

2.1.4 （NH4）2SO4添加量對(duì)產(chǎn)孢量的影響

圖4 （NH4）2SO4添加量對(duì)于產(chǎn)孢量的影響Fig.4 Effect of(NH4)2SO4addition on spore production

（NH4）2SO4是常用的廉價(jià)無(wú)機(jī)氮源，適量無(wú)機(jī)氮源能促進(jìn)菌絲體生長(zhǎng)，有利于產(chǎn)孢量的增加，但過(guò)量的氮會(huì)抑制孢子的分化。（NH4）2SO4添加量對(duì)JK-20的產(chǎn)孢子量的影響如圖4所示。由圖4可知，當(dāng)（NH4）2SO4添加量達(dá)到1.0%之后，繼續(xù)添加（NH4）2SO4對(duì)于木霉菌產(chǎn)孢沒(méi)有顯著促進(jìn)。因此（NH4）2SO4最適添加量為1.0%。

2.2 利用未滅菌基質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)木霉菌劑試驗(yàn)

木霉菌劑等生物農(nóng)藥與化學(xué)農(nóng)藥相比，成本偏高是其主要劣勢(shì)之一。應(yīng)用農(nóng)業(yè)生產(chǎn)或農(nóng)產(chǎn)品加工過(guò)程中產(chǎn)生的生物質(zhì)廢棄物生產(chǎn)木霉菌劑的最主要目的之一就是降低生產(chǎn)和使用成本。而對(duì)發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行滅菌操作，需要消耗大量的蒸汽和能源，對(duì)于發(fā)酵設(shè)備的要求也較高，這樣會(huì)造成更高的生產(chǎn)成本，不利于技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用。因此，在確定最優(yōu)發(fā)酵條件后對(duì)部分或全部發(fā)酵基質(zhì)不進(jìn)行任何滅菌處理，直接進(jìn)行接種發(fā)酵，結(jié)果如表1所示。由表1可知，在發(fā)酵基質(zhì)未滅菌的條件下，JK-20最終產(chǎn)孢子量少于經(jīng)121℃高壓溫?zé)釡缇?0 min條件下產(chǎn)孢子量，這可能是因?yàn)樵谖礈缇鷹l件下，發(fā)酵基質(zhì)中存留有大量的野生雜菌，與木霉JK-20發(fā)生了競(jìng)爭(zhēng)作用，從而在一定程度上影響了JK-20的菌絲體生長(zhǎng)和孢子的生成量。其中，固體基質(zhì)滅菌與否對(duì)于木霉產(chǎn)孢子量的影響略大于糖蜜酒精發(fā)酵液滅菌與否的影響，這可能是因?yàn)槠咸芽葜β诼短飙h(huán)境下堆放過(guò)程中攜帶了更多的與木霉存在競(jìng)爭(zhēng)作用的微生物。盡管如此，但由于省去了滅菌環(huán)節(jié)，無(wú)需滅菌設(shè)備及無(wú)菌發(fā)酵設(shè)備，發(fā)酵過(guò)程的成本大大下降，這使得利用未滅菌基質(zhì)發(fā)酵木霉菌劑具備很大的優(yōu)勢(shì)。

表1 綠色木霉JK-20利用未滅菌基質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)孢子量Table 1 Spore production of T.viride JK-20 by non-sterilizedfermentation substrate

3 結(jié)論

結(jié)果表明，葡萄枯枝蔓和糖蜜酒精發(fā)酵液適宜作為生產(chǎn)綠色木霉的廉價(jià)培養(yǎng)基，本研究?jī)?yōu)化后培養(yǎng)條件為固態(tài)基質(zhì)粒徑10～40目，糖蜜酒精發(fā)酵液中硫酸銨添加量1.0%，糖蜜酒精發(fā)酵液濃度5°Bx，培養(yǎng)基固液混合比2.5∶1（g∶mL）。在此條件下，綠色木霉JK-20直接發(fā)酵未滅菌培養(yǎng)基產(chǎn)孢子量可達(dá)1.12×1010CFU/g。

綠色木霉是一種應(yīng)用很廣的生物防治微生物，能夠防治灰霉病等多種由植物病原真菌引起的植物病害。目前，生產(chǎn)成本偏高，是阻礙木霉菌劑推廣應(yīng)用的主要原因之一。利用農(nóng)業(yè)及農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)產(chǎn)生的生物質(zhì)廢棄物，在不經(jīng)滅菌的條件下直接接種綠色木霉發(fā)酵制備木霉菌劑，雖然與使用滅菌基質(zhì)相比，其孢子產(chǎn)量有所下降，但其孢子產(chǎn)量仍可達(dá)到已有生物防治菌菌劑生產(chǎn)的水平[18-20]。由于減少了滅菌環(huán)節(jié)，生產(chǎn)成本和工藝難度大幅降低，便于普通種植戶自行完成，因此該新工藝具有一定的應(yīng)用前景。

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Production of Trichoderma viride culture using grape branches

DING Su1,ZHANG Jing2,ZHANG Ying2,YANG Ying2,GUAN Jingxi2,WEN Rende2,LI Wei2*
(1.Xingjian College of Science and Liberal Arts,Guangxi University,Nanning 530004,China; 2.Viticulture and Wine Research Institute,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530007,China)

Trichoderma viride spore culture was produced using grape branches and molasses alcohol fermentation mash as main medium material. Using spore production as index,the medium composition was optimized by single factor test,and the effect of non-sterilization fermentation substrate on T.viride fermentation was investigated.The result showed that the low-cost medium of grape branches and molasses alcohol fermentation mash was suitable for T.viride fermentation.The optimal medium was obtained as follows:particle size of the solid substrate 10-40 mesh,(NH4)2SO41.0%in molasses alcohol fermentation mash,molasses alcohol fermentation mash 5°Bx and solid-liquid ratio 2.5∶1(g∶ml).Under this condition,the spore production of T.viride JK-20 by fermenting non-sterilized medium was 1.12×1010CFU/g.

grape branches;molasses alcohol fermentation mash;Trichoderma viride;solid-substrate fermentation

Q939.96

A

0254-5071（2014）10-0032-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.008

2014-08-05

廣西自然科學(xué)基金（2013GXNSFBA019074）；廣西大學(xué)行建文理學(xué)院科研基金（2013ZKLX03）

丁蘇（1985-），女，助教，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锕こ獭?/p>

*通訊作者：李瑋（1984-），男，助理研究員，博士，研究方向?yàn)槲⑸锕こ獭?/p>