鯉春病毒血癥病毒糖蛋白在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)與鑒定

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（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湖北武漢 430070；2.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東深圳 518001）

鯉春病毒血癥病毒糖蛋白在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)與鑒定

劉紅1，鄭曉聰2，于力2，王津津2，賈鵬2，何俊強(qiáng)2，史秀杰2，蘭文升2，葉奕優(yōu)2，劉葒2，吳志新1

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湖北武漢 430070；2.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東深圳 518001）

本實(shí)驗(yàn)利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)鯉春病毒血癥病毒（SVCV）糖蛋白。將SVCV糖蛋白基因（G）插入到供體質(zhì)粒pFastBacHTA中，再用構(gòu)建的質(zhì)粒pFastBac-G轉(zhuǎn)化E. coli DH10αBac感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，獲得含G基因的重組穿梭載體Bacmid-G。通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)將Bacmid-G轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf9細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒AcNPV-G。AcNPV-G感染Sf9細(xì)胞，超聲破碎后離心取上清進(jìn)行SDS-PAGE及Western Blot試驗(yàn)，結(jié)果可見(jiàn)大小約為57 kDa的蛋白條帶，并與羊抗SVCV血清發(fā)生特異性反應(yīng)。間接免疫熒光試驗(yàn)在感染AcNPV-G的Sf9細(xì)胞中觀察到熒光信號(hào)。試驗(yàn)結(jié)果表明，AcNPV-G在Sf9細(xì)胞中成功的表達(dá)了SVCV糖蛋白，且具有良好的免疫學(xué)活性。

鯉春病毒血癥病毒；糖蛋白；桿狀病毒表達(dá)

鯉春病毒血癥病毒（spring viremia of carp virus，SVCV）屬于彈狀病毒科水泡病毒屬[1-2]，是鯉科魚類急性、高致死率的傳染病，即鯉春病毒血癥（SVC）的病原。該病通常在春季水溫10～20℃時(shí)流行并引發(fā)幼魚和成魚大量死亡，暴發(fā)時(shí)1齡仔魚死亡率可達(dá)70%[3]，有資料記載，該病曾給歐洲鯉魚養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。因此自1993年至今，該病一直被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列在水生動(dòng)物疫病名錄[1，5-6]，是世界各國(guó)相關(guān)水生動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)積極防控的重點(diǎn)。2003年中國(guó)內(nèi)地首次報(bào)道分離出SVCV[7]。2008年起，農(nóng)業(yè)部將此病列入一類動(dòng)物疫病，SVCV目前是我國(guó)水生動(dòng)物疫病的重點(diǎn)監(jiān)測(cè)對(duì)象。

SVCV基因組是單鏈負(fù)RNA，編碼5種結(jié)構(gòu)蛋白：核蛋白（N）、磷蛋白（P）、膜蛋白（M）、糖蛋白（G）和病毒RNA依賴RNA聚合酶（L）[1，4，8]。其中糖蛋白在病毒表面形成三聚體，它與細(xì)胞膜受體結(jié)合并介導(dǎo)病毒內(nèi)吞作用[9-10]。表面糖蛋白是病毒最主要的抗原，它決定了病毒的血清學(xué)特征，可引起免疫應(yīng)答[11]。SVCV糖蛋白能與抗SVCV單克隆抗體發(fā)生反應(yīng)，含有SVCV-G基因的DNA疫苗能保護(hù)魚不受SVCV感染[5，11-12]。因此糖蛋白成為研制基因工程抗體的候選基因。

早在上世紀(jì)80年代桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于重組蛋白的產(chǎn)生[13]。由于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行翻譯后加工、表達(dá)產(chǎn)物與天然蛋白的生物活性一致，安全性高等優(yōu)點(diǎn)[14]，因此本研究擬選用昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行SVCV G基因的表達(dá)，為深入研究SVCV糖蛋白的生物學(xué)活性及其在病毒侵染過(guò)程中的功能和亞單位疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 毒株及試劑

SVCV A-1由本實(shí)驗(yàn)室分離保存[8]；草魚卵巢細(xì)胞（CO）、Sf9細(xì)胞、E. coli DH5α、E. coli DH10αBac等由本實(shí)驗(yàn)室保存；M199培養(yǎng)基及SF-900 Ⅲ SFM培養(yǎng)基為Gibco產(chǎn)品； AMV-反轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA 聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連 接 酶、Marker DL2000、wide range DNA Marker（100-6000 bp）、One Step RNA PCR試劑盒和Agarose Gel DNA Extraction試劑盒為Takara產(chǎn)品；pFastbacHTA載體質(zhì)粒和Cellfectin Reagent脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品；QIAGEN RNeasy Mini kit和DNeasy Blood & Tissue kit為QIGEN公司產(chǎn)品；兔抗羊IgG-HRP為Sigma產(chǎn)品；豚鼠抗羊IgG-FITC為CALTAG產(chǎn)品。

1.1.2 引物

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的SVCV G基因序列（AJ318079）設(shè)計(jì)引物。上游引物GF：GCGGAATTCATGTCTATCATCAGCTACAT（劃線處為EcoR I位點(diǎn)），下游引物GR：GCGCTCGAGTTAAACTAAAGACCGCATTT （劃線處為Xho I位點(diǎn)）。通用引物M13（上游引物：5’GTTTTCCCAGTCACGAC 3’；下游引物：5’CAGGAAACAGCTATGAC 3’）參考Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)使用手冊(cè)設(shè)計(jì)，引物均由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 SVCV病毒增殖及RNA提取

將凍存的SVCV病毒懸液接種于24h內(nèi)長(zhǎng)滿單層CO細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，于18℃～20℃ 下在M199培養(yǎng)基中培養(yǎng)直至細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）出現(xiàn)，收集細(xì)胞懸液，反復(fù)凍融3次后3000g離心10 min，收集上清后利用QIAGEN RNeasy Mini kit提取總RNA （按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作）。

1.2.2 糖蛋白基因的擴(kuò)增

采用One Step RNA PCR Kit，以SVCV基因組為模板，以GF、GR為引物擴(kuò)增糖蛋白基因（G gene），擴(kuò)增反應(yīng)體系參照試劑盒說(shuō)明書，RTPCR反應(yīng)程序擴(kuò)增：50℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94℃預(yù)變性2 min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保溫。用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)。

1.2.3 質(zhì)粒pFastBac-G的構(gòu)建

用Agarose Gel DNA Extraction Kit回收純化SVCV-G基因，用EcoR I和Xho I分別對(duì)回收產(chǎn)物和pFastbacHTA雙酶切，然后用T4連接酶16℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，重組質(zhì)粒pFastBac-G經(jīng)酶切鑒定后將新鮮菌液送華大基因進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 重組穿梭載體Bacmid-G的構(gòu)建

將重組供體質(zhì)粒pFastBac-G轉(zhuǎn)化到含有Bacmid和輔助質(zhì)粒的DH10αBac感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)座，在含IPTG、X-gal 、卡那霉素、慶大霉素及四環(huán)素的LB 平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落三次劃線純化，經(jīng)M13通用引物進(jìn)行PCR 鑒定后，獲得重組穿梭載體Bacmid-G。

1.2.5 重組桿狀病毒（AcNPV-G）的獲得及鑒定

堿裂解法提取Bacmid-G，利用CellfectinReagent脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基（SF-900Ⅲ）的Sf9細(xì)胞，當(dāng)發(fā)生細(xì)胞病變后，收集細(xì)胞懸液，離心取上清即獲得重組桿狀病毒（AcNPV-G），具體操作參照Bac-To-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)操作手冊(cè)及轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。待80%細(xì)胞病變后收集細(xì)胞上清，作為P1代重組病毒。將P1代重組病毒繼續(xù)感染Sf9細(xì)胞，經(jīng)3代擴(kuò)大培養(yǎng)后，收集細(xì)胞培養(yǎng)物上清作為重組病毒母液，4℃避光保存?zhèn)溆谩Ｌ崛≈亟M桿狀病毒總DNA基因組，用M13引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。

1.2.6 重組蛋白表達(dá)及Western-blot檢測(cè)

重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞72 h后，收集細(xì)胞，PBS洗滌2次后超聲破碎，-20℃保存?zhèn)溆?。用相同的方法處理正常?xì)胞。將超聲破碎產(chǎn)物10000g離心10 min后取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用3%BSA室溫封閉1 h，PBS洗膜3次后以羊抗SVCV血清為一抗，室溫孵育1.5 h，然后PBS洗膜3次，加入1∶3000稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG，室溫孵育1 h，用PBST、PBS各洗膜3次后，加DAB顯色液顯色，觀察特異性條帶。

1.2.7 目的蛋白的表達(dá)效果的鑒定

將Sf9細(xì)胞鋪于六孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將獲得的第二代重組桿狀病毒AcNPV-G接種于細(xì)胞，27℃培養(yǎng)72 h，用預(yù)冷的PBS洗滌3次；然后用4℃預(yù)冷的丙酮-甲醇（1∶1）固定液于4℃固定10 min，PBS洗滌3次，自然風(fēng)干；以1% BSA 37℃封閉30 min；加入1∶200稀釋的羊抗SVCV血清，37℃作用l h；用PBS洗滌3次后，加入1∶200稀釋的FITC標(biāo)記的豚鼠抗羊二抗，37℃作用l h；用PBS洗滌5次，自然風(fēng)干；熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，未感染的Sf9昆蟲細(xì)胞同時(shí)作對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 SVCV-G基因片段的擴(kuò)增

SVCV糖蛋白基因經(jīng)PCR擴(kuò)增，片段大小約為1530bp（圖1）。

2.2 重組轉(zhuǎn)移載體的雙酶切鑒定

圖1 RT-PCR產(chǎn)物電泳圖

用EcoR I和Xho I對(duì)重組質(zhì)粒pFastBac-G進(jìn)行雙酶切鑒定，雙酶切后產(chǎn)生大小約為1530 bp和 4800 bp的目的條帶（圖2），與預(yù)期結(jié)果相符。測(cè)序結(jié)果表明，該轉(zhuǎn)化菌的質(zhì)粒中含有目的基因片段，且讀碼框正確，重組質(zhì)粒pFastBac-G構(gòu)建成功。

圖2 pFastBac-G質(zhì)粒的雙酶切鑒定

2.3 重組桿狀病毒的獲得

在無(wú)血清條件下，用Cellfectin脂質(zhì)體介導(dǎo)Bacmid-G DNA 轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf9細(xì)胞單層，逐日觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染約72 h 后細(xì)胞明顯出現(xiàn)腫脹變大現(xiàn)象，部分細(xì)胞脫落（圖3），而對(duì)照細(xì)胞生長(zhǎng)良好，表明已經(jīng)獲得重組桿狀病毒AcNPV-G。收集病變細(xì)胞培養(yǎng)上清液，低速離心去除細(xì)胞及碎片即為目的病毒液。

2.4 重組桿狀病毒基因組PCR鑒定

以提取的重組桿狀病毒基因組DNA為模板，用通用引物M13進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在4000bp左右有一條特異性條帶（圖4），與預(yù)期結(jié)果一致。結(jié)果表明成功獲得含有SVCV糖蛋白基因的重組病毒。

圖3 AcNPV-G感染72h后Sf9細(xì)胞病變情況

圖4重組桿狀病毒AcNPV-G的PCR鑒定

2.5 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE及Western-blot檢測(cè)

對(duì)感染AcNPV-G 72 h的Sf9細(xì)胞超聲破碎后進(jìn)行SDS-PAGE及Western-blot鑒定，以正常細(xì)胞為對(duì)照。SDS-PAGE結(jié)果顯示在57 kDa處有明顯的條帶，而對(duì)照組則無(wú)此條帶（圖5A）。Westernblot結(jié)果顯示57 kDa處有一條特異性條帶，而對(duì)照組則無(wú)（圖5B），表明重組蛋白獲得表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物可與羊抗SVCV血清發(fā)生特異性反應(yīng)，具有良好的免疫學(xué)活性。

圖5表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE及Western-blot檢測(cè)

2.6 間接免疫熒光鑒定目的蛋白的表達(dá)

間接免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AcNPV-G感染的Sf9細(xì)胞出現(xiàn)特異性熒光（圖6），且熒光在細(xì)胞表面，而對(duì)照細(xì)胞則無(wú)特異性熒光，這說(shuō)明SVCV糖蛋白在昆蟲細(xì)胞中成功表達(dá)，且分布在細(xì)胞表面。

圖6間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)目的蛋白表達(dá)（400×）

3 討論

SVCV基因組編碼5種結(jié)構(gòu)蛋白（分別N、P、M、G和L）。其中糖蛋白由509個(gè)氨基酸組成，位于病毒表面，形成三聚體的囊膜粒子，介導(dǎo)病毒的內(nèi)吞作用[3，10]，是病毒感染時(shí)病毒與細(xì)胞相互作用的重要因子，其具有豐富的抗原表位，有較強(qiáng)的免疫原性，決定病毒血清學(xué)特性[15]。利用基因工程技術(shù)表達(dá)具有免疫原性的蛋白對(duì)免疫檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展具有重要意義，為深入研究SVCV 糖蛋白的功能及研制有效疫苗，本研究嘗試?yán)脳U狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)SVCV糖蛋白。

目前很多研究采用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)蛋白，雖然原核表達(dá)具有操作簡(jiǎn)單、成本低廉和表達(dá)效率高等優(yōu)點(diǎn)，但原核表達(dá)系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善，包涵體的形成使表達(dá)產(chǎn)物的生物活性較低。而桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行翻譯后加工、其表達(dá)產(chǎn)物與天然蛋白的生物活性一致，且安全性高等優(yōu)點(diǎn)[14]。目前，已有報(bào)道利用桿狀病毒載體表達(dá)的傳染性造血器官壞死癥病毒（IHNV）糖蛋白能夠誘發(fā)極小魚苗的保護(hù)性免疫反應(yīng)[16]，羅衛(wèi)等[17]（2008）在昆蟲細(xì)胞中成功的表達(dá)了病毒性神經(jīng)壞死病毒（VNNV）的衣殼蛋白，具有良好的免疫學(xué)活性。這些研究表明，利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)研制魚類疫苗將可能為魚類疫苗研究開(kāi)辟一條新的途徑。

本研究利用桿狀病毒Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)成功地表達(dá)了SVCV糖蛋白。對(duì)感染細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行重組桿狀病毒PCR鑒定，結(jié)果表明重組桿狀病毒構(gòu)建成功且重組病毒存在于感染上清中，這與羅衛(wèi)等（2008）研究結(jié)果一致。間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果表明糖蛋白在昆蟲細(xì)胞中成功表達(dá)，根據(jù)熒光信號(hào)位于細(xì)胞表面可以確定表達(dá)的糖蛋白分布于細(xì)胞表面。目前有研究將抗原蛋白與桿狀病毒的囊膜糖蛋白GP64的信號(hào)肽序列，跨膜結(jié)構(gòu)域以及胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行融合表達(dá)，使抗原蛋白定位在昆蟲細(xì)胞膜表面，當(dāng)桿狀病毒出芽時(shí)，抗原蛋白便整合到病毒的囊膜上，因而可以直接收集重組桿狀病毒作為疫苗。前人的研究發(fā)現(xiàn)彈狀病毒的糖蛋白也可以展示在昆蟲細(xì)胞膜上，并且水皰性口炎病毒（VSV）和狂犬病毒（RV）的糖蛋白已被證明整合在重組桿狀病毒囊膜上[18]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)SVCV的糖蛋白可以展示在昆蟲細(xì)胞膜上，結(jié)合前人的研究以及桿狀病毒自身的特性，分析SVCV G極有可能也整合到重組桿狀病毒囊膜上，并且有可能作為一種抗SVCV的疫苗。

對(duì)感染重組病毒的細(xì)胞超聲破碎后離心取上清進(jìn)行SDS-PAGE，從電泳圖中可以看到分子量約57kDa的蛋白帶，說(shuō)明表達(dá)的蛋白是可溶性的，但目的蛋白帶較弱，說(shuō)明存在表達(dá)量較低的不足之處。2010年黃鋒濤[19]等利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)斑點(diǎn)叉尾鮰病毒囊膜蛋白ORF6時(shí)，也發(fā)現(xiàn)過(guò)目的蛋白的表達(dá)量不高。這可能與Sf9細(xì)胞密碼子偏愛(ài)性有關(guān)。Western-blot結(jié)果表明，表達(dá)的糖蛋白可以與抗SVCV血清發(fā)生特異性雜交反應(yīng)，具有良好的生物學(xué)活性。因此，本研究為今后進(jìn)一步開(kāi)展對(duì)SVCV糖蛋白的生物活性研究以及亞單位疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)， 也為發(fā)展新型SVCV的快速檢測(cè)和診斷試劑提供了前提。

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Expression and Identifcation of Spring Viremia of Carp Virus Glycoprotein in Baculovirus Expression System

Liu Hong1，Zheng Xiaocong2，Yu Li2，Wang Jinjin2，Jia Peng2，He Junqiang2，Shi Xiujie2，Lan Wensheng2，Liu Hong2，Wu Zhixin1
（1.College of Fisheries，Huazhong Agricultural University，Wuhan，Hubei 430070； 2.The Key Laboratory of Aquatic Animal Diseases，Shenzhen Exit & Entry Inspection and Quarantine Bureau，Shenzhen，Guangdong 518001）

In this study，baculovirus expression system was used to express glycoprotein of spring viremia of carp virus（SVCV）. The glycoprotein gene of SVCV was cloned into the pFastBacHTA vector，followed by transformation into competent cells DH10αBac for blue-white selection. The positive recombinant bacmid-G was transfected to Sf9 cell in logarithmic growth phase with Cellfectin Reagent induction to obtain recombinant Baculovirus AcNPV-G. A specifc 57 kDa protein band and hybridizing reaction between expressed protein and positive serum of SVCV were observed by SDS-PAGE and Western blot. For indirect immunofuorescence，specifc fuorescence signals were observed in Sf9 cells infected by AcNPV-G. The results indicated that SVCV glycoprotein had been expressed in Sf9 cells with immunological activity.

spring viremia of carp virus；lycoprotein；baculovirus expression system

S941.416；Q786

：A

：1005-944X（2014）06-0074-05

質(zhì)檢總局公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201210055和201210214）資助

劉葒，liuhong@szciq.gov.cn；吳志新，wuzhixin @mail.hzau.edu.cn