MALDI-TOF-MS在愛德華氏菌檢測中的應(yīng)用

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（廈門出入境檢驗檢疫局，福建廈門 361026）

MALDI-TOF-MS在愛德華氏菌檢測中的應(yīng)用

龔艷清，郭書林，陳信忠，楊俊萍，葉妍妍

（廈門出入境檢驗檢疫局，福建廈門 361026）

為建立快速檢測和鑒定魚類常見的愛德華氏菌的方法，采用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）方法對來自淡水魚的遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）和鮰愛德華氏菌（E. ictaluri）進行檢測和鑒定。為測試該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性，采用營養(yǎng)肉湯、BHI瓊脂、DHL和TSA等4種不同培養(yǎng)基，以及用肉湯分別培養(yǎng)24 h、36 h、48 h和72 h的菌株進行檢測，結(jié)果表明對該菌的蛋白質(zhì)譜圖影響很小；冷凍保存2年的菌株，用MALDI-TOF-MS進行檢測，鑒定分值變化很小。對分離自不同水生動物的遲緩愛德華氏菌菌株進行檢測，均可得到準確的結(jié)果。表明MALDI-TOF-MS技術(shù)可以快速、準確地檢測和鑒定這兩種愛德華氏菌。

基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）；遲緩愛德華氏菌；鮰愛德華氏菌；檢測；鑒定

愛德華氏菌廣泛分布于海水和淡水中，感染各種養(yǎng)殖水生動物，對水產(chǎn)養(yǎng)殖危害極大。對鰻魚、鯰魚、鱔魚和其他多種動物致病，可造成嚴重經(jīng)濟損失[1-3]。引起魚類發(fā)病的病原菌主要為遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌?，F(xiàn)已知遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）是多種淡、海水養(yǎng)殖魚類的重要病原菌，引起魚類腎臟、肝臟膿瘍病灶的疾病，損失嚴重，是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中危害較大的病原菌[3]。該菌適應(yīng)性強，能適應(yīng)多種不同宿主的體內(nèi)環(huán)境，除了魚類，該菌還可感染兩棲類、爬行類和哺乳類，也是愛德華氏菌屬中唯一能夠感染人類的種類，成為一種人畜共患病的病原菌；鮰愛德華氏菌（E. ictaluri）也可使魚類發(fā)病，但危害性比遲緩愛德華氏菌小，目前已報道的主要導致斑點叉尾鮰腸敗血癥，可以危害所有規(guī)格的斑點叉尾鮰，但主要影響苗種存活率，已成為美國養(yǎng)殖斑點叉尾鮰最主要的疾病之一。

傳統(tǒng)的細菌鑒定方法依據(jù)細菌的形態(tài)學和生理生化特性分析，不僅耗時長，而且由于生化特性容易受培養(yǎng)基、保存時間等因素的影響，常常給鑒定帶來困難。近年來快速發(fā)展的基因檢測技術(shù)在微生物鑒定方面取得了一定的應(yīng)用，但由于其敏感性高，容易出現(xiàn)假陽性，而且對近似種的細菌鑒定還存在一些不足。因此，對一些與人和動物關(guān)系密切的病原菌還需要建立更加快速、準確、實用的檢測和鑒定方法。本研究應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）技術(shù)建立了檢測和鑒定兩種常見愛德華氏菌的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌株

本實驗所用的遲緩愛德華氏菌（編號1101）和鮰愛德華氏菌（編號HSA-1）菌株購自武漢水生生物研究所，兩株菌株經(jīng)生化及分子生物學方法確認。

1.1.2 細菌培養(yǎng)基和生化鑒定卡

營養(yǎng)肉湯、BHI瓊脂、DHL瓊脂和TSA瓊脂等細菌培養(yǎng)基由北京陸橋技術(shù)有限公司提供；生化鑒定GN卡由法國生物梅利埃公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜儀（MALDI Biotyper），德國布魯克公司；全自動微生物鑒定儀VITEK 2（compact 30），法國生物梅利埃公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的復(fù)活與檢測

用營養(yǎng)肉湯對細菌進行復(fù)活后接種于BHI和DHL培養(yǎng)36 h，進行MALDI-TOF-MS檢測。

1.3.1.1 樣品處理

挑取可疑單個菌落于1.5 mL的離心管中，用生理鹽水10000 r/min離心2min洗滌二次；用75%的酒精固定細菌的表面蛋白；用等量的 70%甲酸和乙腈溶解表面蛋白，10000 r/min離心2 min。

1.3.1.2 點靶

吸取1.3.2.1中的上清點靶。先點1 μL上清于樣品靶板上，同時點1 μL標準品溶液（校準靶板），待液體干后立即點1 μL基質(zhì)溶劑。

1.3.1.3 質(zhì)譜圖的采集和分析

應(yīng)用MALDI Biotyper儀器，選擇BioTyper par的采集方法對細菌的圖譜進行采集。用標準品對儀器進行校準后，采集樣品質(zhì)譜圖。應(yīng)用BioTyper軟件對細菌質(zhì)譜圖進行分析和鑒定。

1.3.2 重復(fù)性實驗

兩種愛德華氏菌分別接種10份營養(yǎng)肉湯，30℃培養(yǎng)24～36 h后按上述方法進行MALDI-TOFMS檢測，比較該方法得到的質(zhì)譜圖和檢測結(jié)果的重復(fù)性。

1.3.3 培養(yǎng)基對MALDI-TOF-MS檢測的影響

分別采用肉湯、BHI、DHL和TSA瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)36h后進行MALDI-TOF-MS檢測和鑒定，比較培養(yǎng)時間對細菌蛋白質(zhì)譜圖的影響。

1.3.4 培養(yǎng)時間對MALDI-TOF-MS檢測的影響

用營養(yǎng)肉湯37℃培養(yǎng)，分別在24 h、36 h、48 h和72 h對菌株進行MALDI-TOF-MS檢測和鑒定，比較培養(yǎng)時間對細菌蛋白質(zhì)譜圖的影響。

1.3.5 保存時間對MALDI-TOF-MS檢測的影響

對保存2年的菌株復(fù)活后采集質(zhì)譜圖，與菌株‐70℃保存前的質(zhì)譜圖進行對比，比較細菌保存時間對質(zhì)譜圖的影響。

1.3.6 全自動微生物鑒定儀（VITEK）法

按照儀器的操作要求，將1.3.1中培養(yǎng)的單個特征性菌落種于含3.5%鹽的營養(yǎng)瓊脂斜面，37℃培養(yǎng)24～36 h。用滅菌棉簽取適量細菌用稀釋液稀釋至特定濃度，用VITEK 2 GN鑒定卡進行鑒定，并與菌株保存前的生化指標進行比對，比較其生化反應(yīng)的穩(wěn)定性。

1.3.7 不同來源的遲緩愛德華氏菌的MALDITOF-MS鑒定

將冷凍保存的從羅非魚、鰻魚、大菱鲆、鯉魚、牛蛙及甲魚等水生動物中分離，并經(jīng)形態(tài)和生化鑒定為遲緩愛德華氏菌的20株菌株用肉湯培養(yǎng)液復(fù)活，進行MALDI-TOF-MS鑒定，并與菌株保存前的生化鑒定結(jié)果進行比較，判斷MALDI-TOF-MS檢測結(jié)果的準確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 MALDI-TOF-MS檢測結(jié)果

2.1.1 MALDI Biotyper的判斷標準和鑒定結(jié)果

判斷標準是待檢細菌與數(shù)據(jù)庫中標準菌株質(zhì)譜圖的符合度，用得分表示，得分愈高，說明待測菌株的譜圖同質(zhì)譜庫中某一標準菌株的譜圖（質(zhì)量和峰高）愈相近。分值在2.300～3.000之間，標記為（+++），可完全確認菌株鑒定結(jié)果；分值在2.000～2.299之間，標記為（++），可基本確認菌株鑒定結(jié)果；分值在1.700～1.999之間，標記為（+），該菌株鑒定為不確定結(jié)果；分值在0.000～1.699之間，標記為（-），可判斷不是該種細菌。

上述兩種愛德華氏菌經(jīng)Biotyper數(shù)據(jù)庫鑒定后，與數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)的愛德華氏菌的匹配分值分別為：遲緩愛德華氏菌為2.495、鮰愛德華氏菌2.367，且兩種愛德華氏菌的質(zhì)譜圖比較相似，即其具有相近的蛋白組成，以此可以與其它非愛德華氏菌進行區(qū)分。圖1為兩種愛德華氏菌在分子量5000～8500間的質(zhì)譜圖，從圖中可以看出，兩種愛德華氏菌之間的質(zhì)譜峰存在明顯的差異，可以進行愛德華氏菌的種間鑒別。表1為兩種愛德華氏菌在分子量5000～8500之 間 的峰值比較，從表中可以看出鮰愛德華氏 菌 在5000～8500區(qū)間有20個可讀峰值，而遲緩愛德華氏菌只有16個，缺少5384、7273、7983、8382左右的峰值。而且兩種細菌的重復(fù)性試驗結(jié)果表明，其質(zhì)譜圖變化很小，表現(xiàn)出很好的重復(fù)性，遲緩愛德華氏菌與數(shù)據(jù)庫中Edwardsiella tarda ATCC 36.1 EGS的匹配分值均在2.45～2.495之間，與Edwardsiella tarda HL 23.1 EGS 的匹配分值均在2.35～2.392之間，與Edwardsiella tarda ATCC 35.1 EGS 的匹配分值均在2.302～2.31之間；鮰愛德華氏菌與數(shù)據(jù)庫中Edwardsiella ictaluri 885 EGS的匹配分值均在2.35～2.367之間，與Edwardsiella ictaluri DSM 13697 HAM的匹配分值均在2.046～2.1之間，說明MALDI-TOF-MS技術(shù)具有良好的重復(fù)性。

2.1.2 培養(yǎng)基對愛德華氏菌質(zhì)譜檢測結(jié)果的影響

采用營養(yǎng)肉湯、BHI瓊脂、DHL瓊脂和TSA瓊脂等4種不同的培養(yǎng)基對愛德華氏菌進行MALDI-TOF-MS檢測，結(jié)果見表2，表明4種培養(yǎng)基培養(yǎng)的細菌均能得到良好的匹配分值，比較其蛋白質(zhì)譜圖沒有明顯的差異。說明這些細菌在不同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到的MALDI-TOF-MS蛋白質(zhì)譜圖基本不變，具有良好的穩(wěn)定性。

2.1.3 培養(yǎng)時間對愛德華氏菌質(zhì)譜檢測結(jié)果的影響

圖1兩種愛德華氏菌MALDI-TOF-MS圖譜

表1兩種愛德華氏菌在分子量5000～8500間的蛋白組成比較

表2愛德華氏菌在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)的質(zhì)譜檢測結(jié)果

取培養(yǎng)約24 h、36 h、48 h和72 h 4個不同時間段的愛德華氏菌進行MALDI-TOF-MS檢測，結(jié)果見表3，表明不同生長階段的細菌用MALDITOF-MS檢測得到的蛋白質(zhì)譜圖基本保持不變，與數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)參考菌株的匹配分值均在2.3以上，而且至少72 h內(nèi)，其蛋白質(zhì)譜圖沒有明顯的變化，不影響MALDI-TOF-MS檢測結(jié)果。說明這些細菌在不同生長階段得到的MALDI-TOF-MS蛋白質(zhì)譜圖具有良好的穩(wěn)定性。

表3不同培養(yǎng)時間愛德華氏菌質(zhì)譜檢測結(jié)果

2.1.4 細菌冷凍保存對MALDI-TOF-MS檢測的影響

保存兩年的菌株復(fù)活后的質(zhì)譜圖與保存前的質(zhì)譜圖基本沒有差異，結(jié)果見圖2和圖3。鑒定分值遲緩愛德華氏菌分別為 2.491和 2.496；鮰愛德華氏菌分別為2.364和2.356。說明該方法具有很好的穩(wěn)定性。

2.2 生化鑒定結(jié)果

VITEK 2 GNTest Kit鑒定卡可以對革蘭氏陰性菌的48項生化指標進行鑒定，兩株細菌的大部分生化結(jié)果一致，只在D-甘露醇、蔗糖、L-阿拉伯糖、檸檬酸鹽、H2S等生化反應(yīng)上有差異，上述2株愛德華氏菌經(jīng)全自動微生物鑒定儀鑒定后，均能區(qū)分開來，符合率在95-99%之間。冷凍保存兩年后的菌株的生化與保存前的生化會有差異，符合率也低于90%，如：鳥氨酸脫羧酶和賴氨酸脫羧酶保存前為陽性，保存后變?yōu)殛幮?，脂酶由陰性變?yōu)榭梢傻龋f明用傳統(tǒng)的生化反應(yīng)來鑒定細菌存在一定的缺陷。

2.3 不同來源遲緩愛德華氏菌的MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果

對復(fù)活的20個遲緩愛德華氏菌的菌株進行MALDI-TOF-MS鑒定，其質(zhì)譜圖變化很小，與數(shù)據(jù)庫中遲緩愛德華氏菌的匹配分值都均在2.35以上，可信度很高。說明MALDI-TOF-MS技術(shù)具有很好的準確性。而VITEK對20株遲緩愛德華氏菌的鑒定值有5株只有85%，在結(jié)果判斷上可信度有所降低。

3 討論

目前針對愛德華氏菌的鑒定方法報道的有分子生物學方法、酶聯(lián)免疫法及傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)生化鑒定法[4-14]，尚無應(yīng)用MALDI-TOF-MS方法鑒定愛德華氏菌的報道，本文通過對水生動物致病的兩種常見愛德華氏菌分別應(yīng)用MALDI-TOF-MS技術(shù)及傳統(tǒng)生化鑒定方法進行檢測，結(jié)果表明MALDI-TOF-MS在檢測時間、重復(fù)性、穩(wěn)定性、準確性等方面的總體表現(xiàn)均優(yōu)于傳統(tǒng)生化鑒定方法。而且不同細菌培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌株、不同生長階段的細菌以及冷凍保存兩年后的菌株均可以用于MALDI-TOFMS檢測，得到準確的鑒定結(jié)果。

圖2保存時間對遲緩愛德華氏菌MALDI-TOF-MS圖譜的影響

圖3保存時間對鮰愛德華氏菌MALDI-TOF-MS圖譜的影響

MALDI-TOF-MS技術(shù)以細菌表面蛋白為檢測對象，通過量化分析每種細菌的表面蛋白組成，與標準參考菌株的MALDI-TOF-MS圖譜進行比較，從而得出鑒定結(jié)果。由于每種生物的蛋白組成經(jīng)過長期的進化，具有很好的穩(wěn)定性。細菌的蛋白組成也主要取決于遺傳因素，受培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間以及其它培養(yǎng)條件等外部因素的影響很小。因此，與其他技術(shù)相比，MALDI-TOF-MS具有很好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

[1] 董麗，王印庚，張正，等.養(yǎng)殖大菱鲆細菌性紅體病病原菌的分離與鑒定[J] .海洋科學，2009，33（7）：57-63．

[2] 王印庚，秦蕾，張正，等.養(yǎng)殖大菱鲆的愛德華氏菌病[J].水產(chǎn)學報，2007，31（4）：487-495．

[3] 秦蕾，王印庚，張曉君.遲鈍愛德華氏菌感染大菱鲆的病理學研究[J].中國水產(chǎn)科學，2009，16（3）：411-4l9.

[4] 李晨，王秀華，黃倢.3種主要水產(chǎn)病原菌多重PCR檢測方法的建立[J]..漁業(yè)科學進展，2010，31（3）：100-107.

[5] 鄧顯文，謝芝勛，謝志勤，等.多重聚合酶鏈反應(yīng)快速檢測嗜水氣單胞菌和愛德華菌[J].中國人獸共患病雜志， 2008，24（8）：752-754.

[6] 鄧顯文，謝芝勛，劉加波，等.羅非魚遲緩愛德華氏菌的分離與鑒定[J].水生態(tài)學雜志，2009，2（1）：114-117．

[7] 鄧顯文，謝芝勛，劉加波，等.廣西斑點叉尾鮰愛德華氏菌的分離鑒定[J].廣西農(nóng)業(yè)科學，2008，39（2）：231-235．

[8] 梁萬文，陳明，余曉麗，等.斑點叉尾鮰腸敗血癥PCR診斷方法的建立[J].大連水產(chǎn)學院學報，2007，22（4）：264-269.

[9] 賈俊濤，曹際娟，陳吉祥，等.大菱鲆遲鈍愛德華氏菌病病原菌的分子生物學鑒定及系統(tǒng)發(fā)育學分析[J].中國漁業(yè)質(zhì)量與標準，2012，2（1）：41-46.

[10] 鄧顯文，謝芝勛，謝麗基，等.二溫式聚合酶鏈反應(yīng)鑒別診斷遲緩愛德華氏菌病[J].水生態(tài)學雜志，2009，30（2）：158-160.

[11] 鄧先余，羅文，譚樹華，等.黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）“紅頭病”病原菌遲鈍愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）的分離及鑒定[J].海洋與湖沼，2008，39（5）：511-516.

[12] 徐進，羅曉松，曾令兵.黃顙魚鲇愛德華氏菌的分離鑒定及其致病性研究[J].淡水漁業(yè)， 2009，39（6）：47-52.

[13] 陳福艷，陳明，黃婷，等.六須鯰暴發(fā)性敗血癥病原菌的分離與鑒定[J].大連水產(chǎn)學院學報， 2011，26（1）：63-67.

[14] 李重實，李強，劉海燕，等. 鯰愛德華氏菌間接酶聯(lián)免疫快速檢測法的建立[J].廣東海洋大學學報， 2010， 30（4）：17-21.

Detection and Identifcation of Edwardsiella sp. by Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry

Gong Yanqing，Guo Shulin，Chen Xinzhong，Yang Junping，Ye Yanyan
（Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Xiamen 361026）

Matrix assisted laser desorption/ionization time of fight mass spectrometry（MALDI-TOF-MS）was experimentally used to test and identify the reference strains Edwardsiella tarda and E. ictaluri isolated from freshwater fsh to establish a rapid method for detection and identifcation of Edwardsiella sp. In order to verify its stability and repeatability，the bacteria cultured in different medium such as nutrient broth，BHI agar，DHL and TSA，and in different time intervals of 24，36，48 or 72 h were tested with the mass spectrometry and little impacts were found. There were no changes of the identifcation scores of the bacteria preserved for two years using MALDI- TOF-MS. The strains of E. tarda isolated from different aquatic animals could also be exactly identifed by the method. It was shown that the MALDITOF-MS technique could be used to detect the two Edwardsiella sp. quickly and accurately.

matrix assisted laser desorption/ionization time of fight mass spectrometry（MALDI-TOF- MS）；Edwardsiella tarda；Edwardsiella ictaluri；detection；identifcation

R446.5；S941.42

：A

：1005-944X（2014）06-0089-05

國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局公益項目（201210055）；國家質(zhì)檢總局科研項目（2013IK045）

陳信忠