IMS-FMO捕獲及富集派琴蟲方法的建立

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（中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100029）

IMS-FMO捕獲及富集派琴蟲方法的建立

鄧俊花，林祥梅，馮春燕，王彩霞，吳紹強

（中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100029）

目的派琴蟲病是世界范圍內(nèi)的海洋貝類寄生蟲病，現(xiàn)有的檢測方法或敏感性低，或檢測費用高、或操作困難，難以普及推廣。本研究將建立一種新的貝類派琴蟲免疫磁珠分離純化檢測方法。方法本研究方法包括四部分：（i）捕獲；（ii）熒光顯微鏡觀察；（iii）富集；（iv）方法敏感性評價。結(jié)果本研究建立的派琴蟲免疫磁珠分離純化方法，檢測派琴蟲限度可達103個/mL，整個檢測過程僅需1個小時，特異性良好。結(jié)論派琴蟲免疫磁珠分離純化方法將為水產(chǎn)品中派琴蟲的檢測提供一種快速簡便的技術(shù)支持。

奧爾森派琴蟲；免疫磁珠分離；熒光顯微觀察；分析；檢測

派琴蟲病是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的法定報告水生動物疾病之一。目前在世界范圍內(nèi)廣泛流行，對世界蛤仔等海洋軟體動物生長繁殖帶來了極大的危害，并對水產(chǎn)品養(yǎng)殖及貿(mào)易造成了嚴重的經(jīng)濟損失[1]。2008年農(nóng)業(yè)部首次將派琴蟲病列入蛤仔主要感染的寄生蟲病。吳紹強等[2]于2008年5月至2009年5月期間對我國東部沿海一帶（其中包括青島、山東、寧波和福州等監(jiān)測點）的監(jiān)測點海域采集菲律賓蛤仔，并對派琴蟲感染情況進行調(diào)查，結(jié)果顯示蛤仔派琴蟲的感染率在43.75%～95.83%之間不等，幾乎每只蛤仔體內(nèi)都有派琴蟲的感染。

鑒于派琴蟲對水產(chǎn)品危害的嚴重程度，國內(nèi)外開展了很多的研究工作。梁玉波等于2001年應用巰基醋酸鹽培養(yǎng)基（FTM）培養(yǎng)法成功培養(yǎng)派琴蟲[3]。目前，OIE規(guī)定為“黃金標準”的檢測方法是巰基醋酸鹽培養(yǎng)基（FTM）培養(yǎng)法，該方法被廣泛用于派琴蟲的鑒定，但是此類方法操作過程耗時過長，敏感性較低，只有當每克組織蟲體數(shù)大于103個時才能檢出蟲體[4]。另外，派琴蟲還有其它一些檢測方法，如普通PCR、熒光PCR、原位雜交、組織切片以及環(huán)介導等溫擴增（LAMP）等方法，感染率低的貝類樣品極易出現(xiàn)假陰性。因此，研究一種快速分離純化、富集及鑒定派琴蟲的方法對我國貝類養(yǎng)殖則顯得十分重要和迫切。

免疫磁珠分離技術(shù)（Immunomagnetic Separation，IMS）是以抗體包被的磁珠為載體，通過抗體與反應介質(zhì)中特異性抗原結(jié)合形成抗原-抗體復合物，此復合物在磁場的作用下定向移動，從而分離抗原。免疫磁珠分離技術(shù)具有分離樣品速度快、特異性強、操作簡單、不需要昂貴的儀器設備等特點，而且不影響被分離細胞或其它生物材料的生物學性狀和功能，目前已在醫(yī)學和生物學的許多方面發(fā)揮了重要作用，尤其是在分離及鑒定病原體方面應用廣泛[5-14]。

吖啶橙作為熒光染料，可通過與DNA和RNA的連接堿基對和磷酸鹽基團結(jié)合，使細胞中的DNA和RNA同時染色而顯示不同顏色的熒光。菌體借助激光共聚焦掃描型顯微鏡（LSCM）進行形態(tài)觀察，以直觀確認免疫磁珠捕獲菌體的效果。

本研究借助免疫磁珠分離技術(shù)和熒光顯微鏡技術(shù)建立一種快速分離純化、富集及鑒定派琴蟲的方法，以期對新鮮貝類及加工食品快速診斷和檢測提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

派琴蟲培養(yǎng)懸液，本實驗室保存；Dynabeads Antibody Coupling Kit購 自Invitrogen（USA） 公司；派琴蟲細胞壁特異性單克隆抗體（即，抗派琴蟲膜蛋白的單克隆抗體，Perkinsus CB5D4 McAb）由中國檢科院動物檢疫研究所實驗室制備[15]，濃度1.5mg/mL，-20℃保存；吖啶橙（AO）染料購自Sigma公司；體外培養(yǎng)的派琴蟲由本實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 派琴蟲免疫磁珠的制備

參照Dynabeads Antibody Coupling Kit進行操作，具體方法如下：5mg Dynabeads M-270 beads加入1mL C1洗滌，分別加入240μL、230μL、220μL、210μL、200μL、190μL C1懸浮磁珠，對應加入單克隆抗體（McAb）10μL ，20μL，30μL，40μL，50μL，60μL，加入250μL C2，混勻。37℃，1000r/min下孵育25h。磁力收集，上清溶液命名為W1，其含有McAb的濃度由NanoDrop （ND-1000）（USA）分光光度計進行測定。按照以下公式計算磁珠與McAb的結(jié)合率。結(jié)合率=（C0×V0-CW1×VW1）/（C0×V0）×100%（其中，V0代表加入派琴蟲單克隆抗體的體積；C0表示派琴蟲單克隆抗體的濃度；CW1表示上清溶液中McAb的濃度；VW1表示上清溶液的體積。）

磁珠分別經(jīng)HB、LB、SB洗滌后，加入800μL SB，室溫，1000r/min，吸附15min。去上清，并用500μL SB重懸，此時溶液為派琴蟲免疫磁珠溶液，4℃保存。

1.2.2 分離純化及富集派琴蟲方法的建立

1.2.2.1 分離純化派琴蟲

派琴蟲培養(yǎng)懸液200μL，4000r/min離心5min，PBS（pH=7.4）溶液洗滌1次，最終加入200μL PBS（pH=7.4）溶解；與20μL洗滌后的免疫磁珠溶液混勻，37℃，1000r/min，分別吸附10min，15min，20min，25min，30min，40min，50min，60min。吸附后PBS（pH=7.4）洗滌2次，加入20μL PBS（pH=7.4）重懸磁珠，進行熒光顯微鑒定。

1.2.2.2 熒光顯微鑒定

取10μL派琴蟲抗原抗體復合物與磁珠的結(jié)合物溶液，加入10倍稀釋的吖啶橙染色液2μL，混勻，涂片，借助激光掃描共聚焦顯微鏡（Olympus IX81）進行鏡檢（100X），參照文獻[16]評價免疫磁珠捕獲派琴蟲的效果。

1.2.2.3 富集派琴蟲

派琴蟲抗原抗體復合物與磁珠的結(jié)合物溶液收集磁珠后加入100μL 0.1M檸檬酸鹽溶液（pH=3.1）促進磁珠與派琴蟲分離。含有派琴蟲溶液低速離心收集，加入培養(yǎng)基或者PBS（pH=7.4）進行后續(xù)檢測試驗。

1.2.3 免疫磁珠分離派琴蟲的敏感性評價

1.2.3.1 免疫磁珠從派琴蟲培養(yǎng)懸液中分離派琴蟲的檢測限測定

處理好的9μg/mg beads濃度的免疫磁珠，與濃度分別為107個/mL、106個/mL、105個/mL、104個/mL、103個/mL、102個/mL的派琴蟲培養(yǎng)懸液進行反應，吖啶橙染色鏡檢考察反應效果，并計分，確定產(chǎn)生陽性反應的最低派琴蟲培養(yǎng)物的濃度，即此為最低檢測限。

1.2.3.2 免疫磁珠從派琴蟲模擬陽性病料中分離派琴蟲的檢測限測定

（1）派琴蟲模擬陽性病料制備

取新鮮的無感染的貝類樣品，將貝殼棄掉，取腮、套膜及閉合肌25mg置于滅菌的離心管，研磨器研碎，加入PBS（pH7.4）溶液1mL，130r/ min，離心1min，上清留用。取1mL派琴蟲培養(yǎng)懸液，4000r/m離心5min，蟲體加入上清，混勻。調(diào)節(jié)此派琴蟲陽性模擬溶液至107個/mL、106個/ mL、105個/mL、104個/mL、103個/mL、102個/ mL的不同濃度。

（2）處理好的9μg/mg beads濃度的免疫磁珠，與濃度分別為107個/mL、106個/mL、105個/mL、104個/mL、103個/mL、102個/mL的派琴蟲陽性模擬溶液進行反應，吖啶橙染色鏡檢考察反應效果，并計分，確定產(chǎn)生陽性反應的最低派琴蟲模擬溶液的濃度，即此為最低檢測限。

1.2.4 免疫磁珠從貝類樣品中分離、富集及鑒定派琴蟲

1.2.4.1 貝類樣品的處理

選取垂死的新鮮貝類樣品5份（樣品編號：P1～P5），分別取腮、套膜及閉合肌等組織25mg研磨，加PBS溶解后瞬時離心，上清溶液4000r/ min， 離心5min，用PBS（pH7.4）溶液洗滌1次。最終用200μL PBS（pH7.4）重懸蟲體。

1.2.4.2 免疫磁珠分離派琴蟲

處理好的免疫磁珠加入蟲體，37℃吸附。吸附完畢，用磁力收集器收集磁珠，洗滌后加入PBS（pH7.4）溶液重懸，取適量染色鏡檢。

1.2.4.3 洗脫及富集派琴蟲

吸附派琴蟲的免疫磁珠，加入100μL 0.1M檸檬酸鹽溶液（pH3.1）洗脫，磁珠用磁力收集器（MPC）去除，含有蟲體的上清4000r/min離心后，加入200μL PBS（pH=7.4）重懸。

1.2.4.4 熒光PCR方法鑒定

上述5份貝類樣品用上述所述方法富集后，將富集得到的派琴蟲進行熒光PCR方法鑒定，同時設立陽性和空白對照：陽性對照為派琴蟲陽性模擬溶液；空白對照為新鮮無感染的貝類樣品組織處理上清。按照QIAGEN公司的商品化試劑盒（DNeasy Blood and Tissue Kit）提取富集得到的派琴蟲的DNA。然后采用熒光PCR方法[17]進行鑒定。

2 結(jié)果

2.1 派琴蟲單克隆抗體與磁珠結(jié)合比率的優(yōu)化

當抗體加入量為30uL時，磁珠與抗體的結(jié)合條件最佳。表1為不同McAb量的磁珠與抗體的結(jié)合率。

表1 RFTM培養(yǎng)法和原位雜交法的樣品檢測結(jié)果

由表1可以看出，不同包被濃度的派琴蟲單克隆抗體包被量與磁珠結(jié)合率的數(shù)據(jù)顯示，一開始磁珠充足，所以抗體幾乎全部結(jié)合到磁珠上，結(jié)合率均在90%左右。隨著抗體加入量的增加，抗體出現(xiàn)富足，導致二者結(jié)合率逐漸降低。但抗體的加入量為30μL，即磁珠包被抗體濃度為9μg McAb/ mg beads時，二者處于最佳結(jié)合比例。

2.2 免疫磁珠捕獲派琴蟲的形態(tài)學鑒定

免疫磁珠捕獲派琴蟲的顯微圖如圖1所示。顯微鏡下，沒有結(jié)合派琴蟲的免疫磁珠處于散落狀態(tài)，捕獲派琴蟲的免疫磁珠成堆聚集，大量顯示發(fā)熒光的派琴蟲與磁珠交錯結(jié)合在一起（圖1）。

圖1免疫磁珠捕獲派琴蟲不同階段顯微鏡圖

2.3 免疫磁珠捕獲派琴蟲時間的選擇

不同時間免疫磁珠捕獲派琴蟲的效果數(shù)據(jù)顯示，吸附時間為30min時，免疫磁珠捕獲派琴蟲的效果評價計分值最高，因此，免疫磁珠與派琴蟲在一定量的情況下，吸附30min，可以達到理想的捕獲效果（圖2）。

圖2不同捕獲時間的免疫磁珠分離派琴蟲結(jié)果的計分

2.4 免疫磁珠從派琴蟲培養(yǎng)液中分離派琴蟲的檢測限測定

顯微鏡檢可見，隨著反應溶液中派琴蟲濃度逐級降低，反應后磁珠分散程度增大，與之相對應，磁珠捕獲派琴蟲的效果降低。同時，多個磁珠與多個派琴蟲交錯結(jié)合在一起的現(xiàn)象減少，到102個/ mL濃度時，鏡下只能看到少量單個磁珠結(jié)合單個派琴蟲。零分反應的磁珠在鏡下完全分散，全部視野中未發(fā)現(xiàn)有派琴蟲結(jié)合磁珠。由數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，在該試驗條件下，當派琴蟲培養(yǎng)液濃度為102個/ mL時，免疫磁珠無法分離到派琴蟲。因此，用純化抗體9μg/mg beads濃度包被磁珠從派琴蟲培養(yǎng)液中分離派琴蟲的檢測限約為102個/mL。

表2免疫磁珠捕獲不同濃度派琴蟲培養(yǎng)液的效果計分

2.5 免疫磁珠從派琴蟲模擬陽性病料中分離派琴蟲的檢測限測定

隨著派琴蟲模擬陽性病料濃度的降低，免疫磁珠捕獲派琴蟲的鏡檢現(xiàn)象同“免疫磁珠從派琴蟲培養(yǎng)液中捕獲派琴蟲”。結(jié)合鏡檢結(jié)果得出，在該試驗條件下，當派琴蟲陽性模擬病料濃度為103個/ mL時，鏡下只能看到少量單個磁珠結(jié)合單個派琴蟲。因此，用純化抗體9μg/mg beads濃度包被磁珠從派琴蟲陽性模擬病料中分離派琴蟲的檢測限約為103個/mL。

表3免疫磁珠捕獲不同濃度派琴蟲陽性模擬病料的效果計分

2.6 免疫磁珠從貝類樣品中分離派琴蟲的鑒定

5份貝類樣品用免疫磁珠捕獲法富集后，鏡檢結(jié)果參照文獻[16]進行計分評價（表4）。將富集樣品分別提取DNA進行熒光PCR鑒定，均出現(xiàn)擴增現(xiàn)象，與鏡檢結(jié)果相符。

表4免疫磁珠從貝類樣品中捕獲派琴蟲的效果計分

圖3富集得到的派琴蟲熒光PCR鑒定圖

3 討論

3.1 血清學診斷的特異性主要取決于診斷試劑的特異性，并與血清學檢查方法的選擇有關(guān)。ELISA方法具有敏感性高、操作簡便、不需要昂貴的儀器設備等優(yōu)點，但更適用于純化的可溶性抗原。特異性強的診斷抗原將極大地增加檢測結(jié)果的可靠性。同時，更加純的抗原可以檢測到更加微量的抗體。為提高ELISA反應的特異性，解決非特異性交叉反應和假陽性結(jié)果產(chǎn)生的問題，必須得到純化的派琴蟲病原體。IMS技術(shù)在從復雜樣品中富集和純化低含量的寄生蟲方面具有獨特的優(yōu)勢。優(yōu)質(zhì)的磁珠具有高度的均一性和良好的順磁性，在與復雜的生物樣品反應時受到顆粒性雜質(zhì)等的影響較小，可有效排除其它干擾成分，獲得純化菌體。日本科學家對比了IMS和培養(yǎng)法檢測胃腸道幽門螺桿菌的效果，結(jié)果顯示IMS能夠從胃黏膜富集到幽門螺桿菌并獲得純培養(yǎng)，而單純培養(yǎng)法則極易因其它細菌的過度生長而掩蓋了幽門螺桿菌的存在[18]。ARVE LUND等利用特異性的抗體包被磁珠可以從混有不同血清型（K88-）的大腸桿菌混合液中特異性的分離K88+大腸桿菌，分離物純度可達到97%以上[16]。此外，IMS被證明是一種有效的微生物診斷方法。包被好的磁珠具有高度的反應特異性，可根據(jù)表面抗原的差異從若干中混雜菌中分離低含量的目標菌株，并有效地排除各種反應抑制劑的干擾，有利于其它檢測技術(shù)的應用[19-20]。

3.2 IMS被證明是一種有效的微生物診斷方法，對某些細菌已有成熟的檢測試劑盒出售，比如沙門氏菌和大腸桿菌O157。免疫磁珠分離反應后的檢查方法可以有多種：培養(yǎng)法、染色鏡檢法等可用于活體細菌或細胞的檢測，PCR法還可檢測到死亡的微生物。派琴蟲蟲體較大，易于辨認，因此我們選用吖啶黃染色鏡檢的方法檢查磁珠分離效果。實驗結(jié)果顯示低倍、高倍鏡和油鏡下均可清楚地看到派琴蟲蟲體結(jié)合到磁珠上。

3.3 IMS作為直接的檢測方法，其敏感性和分離純度（特異性評價）是兩個最重要的方法評價指標。本研究的結(jié)果顯示，對于派琴蟲培養(yǎng)液，IMS的最低檢測限可達102/mL，這與許多文獻報道的結(jié)果接近[21]；對于派琴蟲模擬陽性病料，IMS的檢測限只能達到103/mL，這可能是由于貝類組織研磨離心后上清樣品中顆粒樣雜質(zhì)過多影響磁珠反應造成的。IMS法受到溶液中顆粒性雜質(zhì)的干擾程度與免疫微球的大小有關(guān)。使用更大的微球可能有助于減少這種干擾[19，22]。在IMS分離派琴蟲特異性評價中，包被好的免疫磁珠可以特異性地從含有大量細胞成分的組織勻漿液中分離派琴蟲病原體，而與其它雜菌沒有交叉反應，且不受細胞成分影響，顯示了良好的分離特異性。

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Development of IMS-FMO Method for Capture and Concentration of Perinsus olseni

Deng Junhua，Lin Xiangmei，F(xiàn)eng Chunyan，Wang Caixia ，Wu Shaoqiang
（Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100029）

ObjectivePerkinsosis is a worldwide parasitic disease of marine mollusks. Many rapid methods are available for detection of Perkinsus，but they are often insensitive or expensive or require a high degree of technical ability to perform. Here，a novel assay was developed for the detection of Perkinsus.MethodThe assay contained four stages：（i）capture；（ii）fluorescence microscope observation （FMO）；（iii）concentration；（iv）assay sensitivity evaluation.ResultThe detection limit of the assay was about 103/mL，and the test procedure could be fnished in 1 hour.ConclusionAn immunomagnetic separation（IMS）-FMO assay for detection of Perkinsus was developed providing a rapid， simple， and sensitive technique for detection of Perkinsosis.

Perinsus olseni；IMS；FMO；Assay；Detection

S944.344

：A

：1005-944X（2014）06-0084-05

質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項（201010016）；國家科技支撐計劃課題（2012BAK11B04）

吳紹強（E-mail sqwu@sina.com）