傳染性造血器官壞死病毒的新型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）熒光檢測(cè)技術(shù)

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（深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東深圳 518045）

傳染性造血器官壞死病毒的新型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）熒光檢測(cè)技術(shù)

何俊強(qiáng)，史秀杰，盧體康，賈鵬，鄭曉聰，于力，蘭文升，王津津，劉葒

（深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東深圳 518045）

本研究建立了一種檢測(cè)傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）的新型熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法，為實(shí)驗(yàn)室及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)IHNV提供特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、能實(shí)時(shí)觀察擴(kuò)增熒光信號(hào)的檢測(cè)技術(shù)。針對(duì)IHNV全基因組序列設(shè)計(jì)了一組6條LAMP特異性引物，對(duì)4株不同來(lái)源的IHNV和8株不同的病毒進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)和靈敏度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該方法具有高度特異性，檢測(cè)靈敏度可達(dá)3.64×10-7μg/μL，比常規(guī)RT-PCR高1000倍，與熒光RT-PCR方法相當(dāng)。通過(guò)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）和熒光檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，使其檢測(cè)時(shí)間能縮短至15～20分鐘內(nèi)完成檢測(cè)，并可杜絕由于開(kāi)蓋加染料而導(dǎo)致的假陽(yáng)性率偏高問(wèn)題，在魚(yú)病快速檢測(cè)上具有重要意義。

傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）；熒光檢測(cè)

傳染性造血器官壞死病（infectious haematopoietic necrosis，IHN）是鮭鱒魚(yú)類的一種嚴(yán)重的傳染性疾病，常造成魚(yú)苗或幼魚(yú)70%～90%的死亡率，在某些病例中甚至接近100%，對(duì)世界鮭鱒魚(yú)類養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。其病原為傳染性造血器官壞死病毒（IHNV），病毒粒子形態(tài)為彈狀，直徑80nm～90nm，長(zhǎng)度為160nm～180nm，有囊膜，屬于魚(yú)類彈狀病毒（fsh rhabdovirus）[2]。由于該病對(duì)鮭鱒魚(yú)類養(yǎng)殖造成的巨大危害，目前該病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIR）列入水生動(dòng)物疫病名錄，我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病。

起初IHN只流行于北美洲和歐洲部分地區(qū)，1968年該病隨紅大麻哈魚(yú)魚(yú)卵從阿拉斯加傳入日本北海道[3]，近來(lái)隨著水生動(dòng)物及其產(chǎn)品進(jìn)出口貿(mào)易的急劇增加，又傳入我國(guó)，并在我國(guó)局部地區(qū)流行[4]。目前常用于檢測(cè)感染和非感染狀態(tài)的IHNV的方法主要包括原位雜交、免疫組織化學(xué)、在體內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的免疫金標(biāo)記方法[5]、ELISA[6]以及RTPCR[7]、熒光RT-PCR[8]等分子生物學(xué)方法。而檢測(cè)和診斷IHNV的經(jīng)典方法是利用魚(yú)類細(xì)胞系進(jìn)行病毒分離，再通過(guò)抗體中和試驗(yàn)確認(rèn)有無(wú)病毒。這種方法對(duì)于滴度較低的病毒感染很靈敏，但操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，通常在病毒感染很?chē)?yán)重后才能出現(xiàn)明顯陽(yáng)性結(jié)果。本研究利用新型的熒光檢測(cè)技術(shù)，成功建立了檢測(cè)IHNV的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）熒光檢測(cè)方法，能為實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供一種更為快速和易于操作的檢測(cè)方法，對(duì)本病快速檢測(cè)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病毒懸液

4株不同來(lái)源的傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）分別為：IHNV-UK和IHNV-32-87（英國(guó)CEFAS贈(zèng)送）、IHNV-S（中科院水生所贈(zèng)送）、IHNV-20130238（本實(shí)驗(yàn)室分離保存）；4株同屬?gòu)棤畈《究频牧棤畈《緦伲╪ovirhabdovirus）的水生動(dòng)物病毒，分別為：鯉春病毒血癥病毒（spring viraemia of carpvirus，SVCV）、牙鲆彈狀病毒（hiramerhabdovirus，HRV）、病毒性出血性敗血癥病毒（viral haemorrhagic septicemia virus，VHSV）、 狗 魚(yú) 幼 魚(yú) 彈 狀 病 毒（pike fryrhabdovirus，PFRV）[9]；4株常見(jiàn)的魚(yú)類病毒分別為：魚(yú)類病毒性神經(jīng)壞死病病毒（viral nervous necrosis virus，VNNV）、鰤?mèng)~腹水病毒（yellowtail ascites virus，YAV）、傳染性胰腺壞死病毒（infectious pancreatic necrosis virus，IPNV）、傳染性鮭魚(yú)貧 血 病 病 毒（infectious salmon anaemia virus，ISAV）。其中SVCV、HRV、VHSV和VNNV病毒懸液均由本實(shí)驗(yàn)室分離保存；YAV和IPNV由中科院水生所贈(zèng)送；PFRV由德國(guó)慕尼黑大學(xué)贈(zèng)送；ISAV由ISA挪威OIE參考實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。

1.2 試劑

LAMP反應(yīng)試劑Isothermal Master Mix為英國(guó)OptiGene公司產(chǎn)品；核酸抽提使用QIAamp Viral RNA Mini Kit為QIAGEN公司產(chǎn)品；AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、One Step RNA PCR Kit（AMV）、One Step PrimeScript RT-PCR Kit均為T(mén)akara公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）的全基因組序列（GenBankAccessionNo. X89213.1），使用LAMP Designer軟件（http：//www.optigene. co.uk/lamp-designer/）設(shè)計(jì)一組6條LAMP的特異性引物（表1）：正向外引物（F3）、反向外引物（B3）、正向內(nèi)引物（FIP）、反向內(nèi)引物（BIP）、環(huán)狀正向引物（LF）、環(huán)狀反向引物（LB）。

表1 IHNV環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增設(shè)計(jì)引物序列

1.4 病毒RNA提取

病毒RNA提取按照QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini Kit（50）試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，RNA濃度使用Eppendorf BioPhotometer測(cè)定。熒光PCR和常規(guī)PCR靈敏度對(duì)比試驗(yàn)使用同批次提取的核酸。

1.5 LAMP反應(yīng)

LAMP反應(yīng)使用OptiGene Isothermal Master Mix反應(yīng)試劑，25 μL反應(yīng)體系中包含：F3和B3引物各0.2 μmol/L，F(xiàn)IP和BIP引物各1.6 μmol/ L，LoopF和LoopB引 物 各0.8 μmol/L，1X的Isothermal Master Mix（包含BstTaq酶、dNTP、Mg2+及優(yōu)化LAMP反應(yīng)成分），AMV逆轉(zhuǎn)錄酶2.5 U，2.5μL待測(cè)RNA模板。設(shè)置反應(yīng)梯度溫度61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃等8組溫度，放置預(yù)定時(shí)間（60min）。最后升高至98℃，以0.05℃/S的速度降溫至80℃做溶解曲線，反應(yīng)約6min終止反應(yīng)。實(shí)時(shí)觀察熒光信號(hào)的收集情況，通過(guò)熒光擴(kuò)增曲線分析以確定最佳反應(yīng)條件，同時(shí)觀察溶解曲線峰值圖，確認(rèn)其特異性。最后將LAMP產(chǎn)物（5μL）用1.5%瓊脂糖凝膠電泳或加入核酸染料進(jìn)一步確認(rèn)。

1.6 RT-PCR反應(yīng)

使用1對(duì)IHNV特異性引物（正向引物5’-AGA-GAT-CCC-TAC-ACC-AGA-GAC-3’；反 向 引 物5’-GGT-GGT-GTT-GTT-TCC-GTGCAA-3’）[10]進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。RT-PCR使用Takara One Step RNA PCR Kit（AMV）反應(yīng)試劑盒，50μL反應(yīng)體系中包含：1×buffer，0.5mmol/ L MgCl2，0.2 mmol/L dNTP，40 μmol/L正向引物，40 μmol/L反向引物，Taq酶5 U，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶5 U，RNA酶抑制劑40 U，2.5 μL待測(cè)RNA模板，DEPC水補(bǔ)足25μL。設(shè)置反應(yīng)程序：50℃30min； 95℃ 2min；之后95℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 1min進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；再72℃ 7min ；4℃保存。最后將RT-PCR產(chǎn)物（5 μL）用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行判斷，擴(kuò)展693 bp大小為陽(yáng)性。

1.7 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)

使用1對(duì)IHNV特異性引物（正向引物5’-GGT-CGC-CGA-ACT-TCT-GGA-A-3’；反向引物5’-GTG-CCC-CAG-TGT-CCA-AAG-A-3’），及1條IHNV特異性探針（探針5’-FAM-CCCTGG-GCT- TCT-TGC-TGG-A-TAMRA-3’）[11]進(jìn)行熒光RT-PCR反應(yīng)。熒光RT-PCR使用Takara One Step PrimeScript RT-PCR Kit反應(yīng)試劑盒，25 μL反應(yīng)體系中包含：1X One Step RT-PCR BufferⅢ（包含dNTP Mixture，Mg2+以及優(yōu)化的PCR反應(yīng)成分），1X Rox Reference DyeⅡ，1X PrimeScript RT Enzyme MixⅡ，EX Taq HS（2.5 U），0.2 μmol/L正向引物，0.2 μmol/L反向引物，0.1 μmol/L探針， 2.5μL待測(cè)RNA模板，DEPC水補(bǔ)足25μL。設(shè)置反應(yīng)程序：50℃ 2min；95℃10min；之后95℃ 15s，60℃ 1min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；通過(guò)熒光PCR儀收集熒光信號(hào)后判斷。

1.8 IHNV LAMP靈敏度測(cè)定實(shí)驗(yàn)

將IHNV-20130238核酸（36.4 μg/μL）10倍系列稀釋的每個(gè)稀釋度作為反應(yīng)模板。使用優(yōu)化后的LAMP方法來(lái)測(cè)定其檢測(cè)下限。同時(shí)使用相同稀釋度的模板（2.5 μL）進(jìn)行RT-PCR和熒光RTPCR檢測(cè)，對(duì)比三種方法的檢測(cè)靈敏度。

1.9 IHNV LAMP特異性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

使用優(yōu)化后的LAMP方法，對(duì)4株不同來(lái)源的IHNV和8種其他水生動(dòng)物病毒（SVCV、HRV、VHSV、PFRV、VNNV、YAV、IPNV、ISAV）模板進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 LAMP反應(yīng)優(yōu)化

使用IHNV-32-87（0.5 μg/μL）作為模板進(jìn)行LAMP反應(yīng)，以確定最佳的反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間。于61℃- 68℃進(jìn)行梯度擴(kuò)增，其中62℃～67℃LAMP擴(kuò)增的峰值強(qiáng)度和峰值時(shí)間均比較穩(wěn)定，以最早的峰值時(shí)間（PeaksPositor）作為判斷依據(jù)，66℃時(shí)峰值時(shí)間最早為15：36（圖1a-b）。因此，選擇66℃作為最佳溫度。為保證反應(yīng)體系中低濃度模板也能檢出陽(yáng)性，故選擇60min作為優(yōu)化后的反應(yīng)時(shí)間。

2.2 IHNV-LAMP靈敏度對(duì)比實(shí)驗(yàn)

圖1 IHNV反應(yīng)溫度梯度實(shí)驗(yàn)

IHNV-LAMP檢測(cè)方法使用6條引物，在66℃下反應(yīng)60min，測(cè)定其檢測(cè)下限。LAMP反應(yīng)、RT-PCR和熒光RT-PCR使用2.5μL相同稀釋倍數(shù)的IHNV-20130238核酸（36.4μg/μL）作為模板。LAMP檢查IHNV-20130238的極限為10-6（約3.64×10-7μg/μL）（圖2a-b），熒光RT-PCR檢測(cè)極限為10-6（約3.64×10-7μg/μL）（圖2c），RT-PCR檢測(cè)極限為10-3（約3.64×10-4μg/μL）（圖2d）。結(jié)果表明，LAMP檢測(cè)靈敏度是與熒光RT-PCR的靈敏度相當(dāng)，是普通RT-PCR靈敏度的1000倍。

2.3 IHNV-LAMP的特異性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

使用LAMP方法對(duì)4株不同來(lái)源的IHNV，4種同屬水生動(dòng)物彈狀病毒SVCV、HRV、VHSV、PFRV，和4種無(wú)關(guān)魚(yú)病VNNV、YAV、IPNV、ISAV提取的核酸進(jìn)行特異性反應(yīng)。其中4株不同來(lái)源的IHNV均能擴(kuò)增。4株IHNV的峰值時(shí)間（PeaksPositor） 分別為13∶33、10∶33、9∶18、14∶48。其他8種病毒均無(wú)擴(kuò)增（圖3a-b）。結(jié)果表明，LAMP檢測(cè)IHNV的方法具有很好的特異性。

3 討論

IHNV是海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中最嚴(yán)重的病毒性病原之一。20世紀(jì)四、五十年代， IHN在美國(guó)首次暴發(fā)。最初主要對(duì)北美太平洋沿岸養(yǎng)殖的鮭科魚(yú)類造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[12]。但隨著各國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和水產(chǎn)品貿(mào)易的開(kāi)展，IHNV不斷蔓延，給各國(guó)淡海水養(yǎng)殖業(yè)造成巨大危害。目前，IHNV已經(jīng)蔓延至臺(tái)灣、日本、意大利、英國(guó)、法國(guó)、中國(guó)和韓國(guó)等國(guó)家和地區(qū)，感染魚(yú)類包括虹鱒（Oncorhynchusmykiss）、紅大麻哈魚(yú)（O.nerka）、大麻哈魚(yú)（O. keta）、大鱗大麻哈魚(yú)（O. tshawytscha）、細(xì)鱗大麻哈魚(yú)（O.gorbuscha）、銀大麻哈魚(yú)（O.kisutch）、馬蘇大麻哈魚(yú)（O.masou）、玫 瑰 大 麻哈 魚(yú)（O. rhodurus）、 大西 洋 鮭（Salmosalar）、 河 鱒（S.trutta）、 太 平 洋 鯡（Clupeapallasi）和管吻刺魚(yú)（AuLorhynchusfavidus）等[13-16]。目前一些用于檢測(cè)感染和非感染狀態(tài)的方法主要包括原位雜交、免疫組織化學(xué)、在體內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的免疫金標(biāo)記方法、ELISA以及RT-PCR、熒光RT-PCR等分子生物學(xué)方法。

圖2 IHNV靈敏度測(cè)定對(duì)比實(shí)驗(yàn)

圖3 IHNV特異性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

近年來(lái)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）已被開(kāi)發(fā)應(yīng)用[17]，國(guó)內(nèi)外已建立多種重要經(jīng)濟(jì)水生動(dòng)物病毒感染的LAMP檢測(cè)方法[18-21]。其采用特異性識(shí)別靶序列上的6個(gè)位點(diǎn)的4條引物，及一種具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶在恒溫條件進(jìn)行核酸指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，在擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生莖環(huán)結(jié)構(gòu)，引物與其雜交啟動(dòng)新的一輪核酸合成[22]。最后利用熒光染料直接染色，并通過(guò)核酸染料顏色的變化來(lái)判定[23]，或使用溴化乙錠凝膠電泳方法觀察。還有一種方法是通過(guò)濁度分析儀來(lái)檢測(cè)LAMP的焦磷酸鹽沉淀來(lái)判定LAMP檢測(cè)結(jié)果[24]。但在實(shí)際中使用該方法的檢測(cè)靈敏度不如熒光染料法和電泳法，靈敏度相差達(dá)100倍以上[25]。

LAMP具有等溫?cái)U(kuò)增、高效靈敏、特異性高、檢測(cè)快速、對(duì)儀器要求低、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，十分適合在野外漁場(chǎng)開(kāi)展檢測(cè)。但對(duì)于相對(duì)封閉的環(huán)境中如檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室等檢測(cè)時(shí)，其需要在LAMP反應(yīng)后開(kāi)蓋加入核酸染料來(lái)進(jìn)行判定，由于LAMP方法的高效擴(kuò)增性，使得在封閉環(huán)境中很容易形成帶有相關(guān)核酸片段的氣溶膠，造成長(zhǎng)期檢測(cè)相同項(xiàng)目時(shí)容易出現(xiàn)假陽(yáng)性率偏高的情況。這也是目前阻礙LAMP檢測(cè)技術(shù)全面推行的主要瓶頸。

本研究采用熒光檢測(cè)技術(shù)對(duì)LAMP的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光收集，使用488nM激發(fā)光源，520nM發(fā)射熱循環(huán)熒光監(jiān)測(cè)，實(shí)時(shí)收集記錄LAMP反應(yīng)擴(kuò)增的熒光信號(hào)，得到類似于熒光PCR的“S”型擴(kuò)增曲線，能直觀的觀察到待測(cè)樣品的檢測(cè)結(jié)果。通過(guò)溶解曲線分析，還可進(jìn)一步確認(rèn)其擴(kuò)增的特異性。在特異性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)中，我們利用了4株不同來(lái)源的IHNV與4種同屬水生動(dòng)物彈狀病毒（SVCV、HRV、VHSV、PFRV）提取的核酸，以及4種無(wú)關(guān)魚(yú)?。╒NNV、YAV、IPNV、ISAV）提取的核酸進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)。同屬水生動(dòng)物彈狀病毒以及其他無(wú)關(guān)的魚(yú)類病毒均無(wú)擴(kuò)增，4株IHNV均能在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出來(lái)，峰值時(shí)間（PeaksPositor）分別為13∶33、10∶33、9∶18、14∶48?？梢?jiàn)一般在10～20分鐘內(nèi)可完成檢測(cè)，相對(duì)普通RT-PCR和熒光RTPCR方法至少需要2～3小時(shí)，和傳統(tǒng)LAMP檢測(cè)需要45～60分鐘來(lái)說(shuō)，本研究能在更短的時(shí)間完成IHNV的LAMP檢測(cè)。這主要得益于我們采用了更為靈敏的熒光檢測(cè)技術(shù)作為數(shù)據(jù)讀取的手段，通過(guò)熒光的疊加收集，能更快、更及時(shí)的反映樣品檢測(cè)情況，故能更早的發(fā)現(xiàn)其擴(kuò)增產(chǎn)物。

在做靈敏度測(cè)試實(shí)驗(yàn)時(shí)，我們使用相同稀釋倍數(shù)的IHNV-20130238核酸（36.4μg/μL）作為模板，分別與普通RT-PCR和熒光RT-PCR作對(duì)比實(shí)驗(yàn)，通過(guò)軟件分析我們得出等同于熒光PCR“CT值”的出峰值時(shí)間（PeaksPositor），結(jié)果表明本研究LAMP檢測(cè)下限可達(dá)3.64×10-7μg/μL。檢測(cè)靈敏度與熒光RT-PCR靈敏度相當(dāng)，是普通RT-PCR靈敏度的1000倍。

最后，針對(duì)IHNV本研究建立的LAMP熒光檢測(cè)技術(shù)，是一種全新改進(jìn)的恒溫核酸擴(kuò)增方法，與其他分子生物學(xué)檢測(cè)及時(shí)相比，其操作更為簡(jiǎn)便和更為快速。同時(shí)改進(jìn)了傳統(tǒng)LAMP染料法觀察需要開(kāi)蓋加核酸染料的弊端，能杜絕假陽(yáng)性的出現(xiàn)，并能做到實(shí)時(shí)分析。是一種靈敏、特異、快速，十分有效的新型檢測(cè)方法。

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A novel loop-mediated isothermal amplifcation assay for the detection of infectious haematopoietic necrosis virus

He Junqiang，Shi Xiujie，Lu Tikang，Jia Peng，Zheng Xiaocong，Yu Li，Lan Wensheng，Wang Jinjin，Liu Hong
（Animal & Plant Inspection and QuarantineTechnology Center，Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shenzhen，Guangdong 518045）

A loop-mediated isothermal amplifcation assay（LAMP）for the detection of infectious haematopoietic necrosis viru（IHNV was established in this study. This novel method could be used in IHNV detection with high specifcity，sensitivity and rapidity both in the laboratory and feld conditions. A set of 6 LAMP primers were designed based on IHNV genome sequence. 4 IHNVstrains from different sources and 8 other viruses were involved in specifcity and sensitivity tests. The results indicated that the specifcity was high，and the detection limit was 3.64×10-7μg/μL，1000 fold higher than the conventional RT-PCR and same as real-time RT-PCR. The combination of LAMP and real-time RT-PCR could decrease the required detection time to 15-20 min and reduce the false positive rate caused by lid opening.

infectious haematopoietic necrosis virus（IHNV）；loop-mediated isothermal amplification assay（LAMP）；fuorescence detection

S851.347.34；S941.414

：A

：1005-944X（2014）06-0068-06

質(zhì)檢公益性行業(yè)專項(xiàng)（201210055和201210214）；質(zhì)檢總局科研項(xiàng)目（2012IK032）

劉葒liuhong@szciq.gov.cn