南疆地區(qū)豬鏈球菌流行病學調(diào)查

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（1. 塔里木大學動物科學學院，新疆阿拉爾843300；2. 新疆兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾843300；3. 塔城額敏縣畜牧獸醫(yī)局，新疆塔城 834600）

南疆地區(qū)豬鏈球菌流行病學調(diào)查

吳靜1，2，趙文勝3

（1. 塔里木大學動物科學學院，新疆阿拉爾843300；2. 新疆兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾843300；3. 塔城額敏縣畜牧獸醫(yī)局，新疆塔城 834600）

為了解豬鏈球菌在新疆南疆地區(qū)正常豬群中的流行情況，對庫爾勒地區(qū)、阿克蘇地區(qū)、喀什地區(qū)無菌采集的286頭份健康屠宰豬的扁桃體進行豬鏈球菌種的鑒定；采用豬鏈球菌谷氨酸脫氫酶（gdh）基因設(shè)計引物，建立PCR方法。結(jié)果表明，南疆地區(qū)豬鏈球菌的攜帶率達到了17.13%；對攜帶豬鏈球菌的扁桃體進行細菌的分離鑒定，獲得47株豬源性鏈球菌；采用多重PCR對分離的47株豬鏈球菌進行主要致病血清學的檢測，未見主要致病血清型。

豬鏈球菌；流行病學調(diào)查；分離鑒定

豬鏈球菌病是由豬鏈球菌（streptococeus suis，SS）引起的一種人畜共患的急性、熱性傳染病，其病原復雜，我國豬鏈球菌病的病原多以C群和D群為主，而國外多為R群的2型豬鏈球菌[1]。隨著集約化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，豬鏈球菌在我國的發(fā)病率越來越高，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。同時對公共衛(wèi)生尤其是相關(guān)從業(yè)人員的健康也構(gòu)成巨大威脅[2]。

從文獻資料可見我國很多地區(qū)對豬鏈球菌進行了生物學特性的研究，如華南地區(qū)、蘇中地區(qū)、東北地區(qū)、青島地區(qū)、上海地區(qū)及湖南省等。新疆雖有豬鏈球菌病的報道[3]，但未見新疆對豬鏈球菌進行流行病學的調(diào)查。故弄清該地區(qū)豬鏈球菌的流行病學，對于該病的防控有著十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

健康屠宰豬的扁桃體：2011年7月-2012年6月份，分別從庫爾勒地區(qū)、阿克蘇地區(qū)、喀什地區(qū)的部分屠宰場采集扁桃體286頭份，其中庫爾勒地區(qū)42頭份，阿克蘇地區(qū)206頭份，喀什地區(qū)38頭份。TaqDNA 聚合酶、dNTPs、DL2000 DNA Marker等購自寶生物工程（大連） 有限公司（ Takara）。引物：由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。培養(yǎng)基：腦心浸液（Brian Heart Infusion；BHI），購自京賽百奧科技有限公司；5%綿羊血平板實驗室自制[4]。革蘭氏染液由塔里木大學獸醫(yī)微生物實驗室提供。

1.2 樣品采集及處理

對來源明確的生豬屠宰后，以消毒過的鑷子、剪刀采集咽部扁桃體，投入一次性樣品袋內(nèi)，低溫保存送往實驗室。

先將檢樣無菌操作，絞碎接種到5mLBHI培養(yǎng)基（另加有10μg /mL多粘菌素B，15μg/mL萘啶酮酸及0.2μg/mL結(jié)晶紫）中，37℃靜置恒溫箱培養(yǎng)18～24h，挑取細菌培養(yǎng)物，均勻涂在載玻片上，晾干后，革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察細菌染色情況及細菌形態(tài)。

1.3 模板制備

將鏡檢為革蘭氏陽性的鏈球菌的培養(yǎng)液，取1mL菌液到無菌的1.5mL離心管中，2000r/min離心5min，去掉上清，用200uL雙蒸水懸浮混勻，100℃水浴中煮10min，然后迅速置于冰上冷卻5min，12000r/min離心2min，上清即為PCR模板。

1.4 PCR方法檢測豬鏈球菌

1.4.1 PCR引物設(shè)計

豬鏈球菌種的特異性引物是谷氨酸脫氫酶（gdh）基因，參考文獻[5]，引物序列、退火溫度及擴增片段大小見表1。

表1 PCR反應引物及目的片段大小

1.4.2 PCR反應體系（25uL）

10×Taq Buffer2.5uL，2uM dNTPs 1.5uL，20uM上、下游引物各0.3uL，Taq DNA聚合酶0.3uL，無菌水4uL，模板1.5uL。

反應條件：95℃預變性5min，再進行30個循環(huán)：95℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min，放入4℃保存。

1.5 豬鏈球菌的分離鑒定

1.5.1 細菌的分離及純培養(yǎng)

通過PCR檢測為陽性樣本，用接種環(huán)接種于兔鮮血瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24～48h后，觀察菌落特征。

選取鮮血瓊脂平板上微小、圓形、邊緣整齊、略帶灰白色、露滴樣、有明顯的β型溶血環(huán)的單個菌落的小部分革蘭氏染色，顯微鏡檢查呈成對或短鏈狀革蘭氏陽性球菌后，菌落的其余部分再接種到BHI培養(yǎng)基，置37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24～48h，如此獲得分離菌的純培養(yǎng)物。

1.5.2 細菌的生化鑒定

將純培養(yǎng)物分別接種到各種糖發(fā)酵管（乳糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、海藻糖、山梨醇、水楊苷、甘露醇等），接種后置37℃培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果；進行兔血漿凝固酶試驗、觸酶試驗等。

1.6 多重PCP對分離鑒定的豬鏈球菌進行血清型的鑒定

1.6.1 PCR引物設(shè)計

豬鏈球菌主要致病血清型的特異性引物是莢膜多糖（cps）基因，參考文獻[5]，引物序列、退火溫度及擴增片段大小見表2。

表2 PCR反應引物及目的片段大小

1.6.2 PCR反應體系（25uL）

10×Taq Buffer2.5uL，2uM dNTPs 1.5uL，20uM上、下游引物各0.3uL，Taq DNA聚合酶0.3uL，無菌水4uL，模板1.5uL。

反應條件：95℃預變性5min，再進行35個循環(huán)：95℃變性30s，56℃退火40s，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min，放入4℃保存。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測結(jié)果（見表3）

表3新疆南疆地區(qū)豬鏈球菌攜帶情況的PCR檢測結(jié)果

用PCR方法進行豬鏈球菌鑒定后，阿克蘇地區(qū)206頭健康豬樣本中有36頭為豬鏈球菌陽性，檢出率為17.48%；庫爾勒地區(qū)42頭健康豬樣本中有7頭為豬鏈球菌陽性，檢出率為16.67%；喀什地區(qū)38頭健康豬樣本中有6頭為豬鏈球菌陽性，檢出率為15.6%。

2.2 細菌的分離鑒定

2.2.1 培養(yǎng)特性觀察

在血平板上的菌落為灰白色、圓形、微凸、表面光滑、濕潤、邊緣整齊針尖大的露滴樣菌落，多數(shù)菌落周圍出現(xiàn)直徑約l mm的溶血環(huán)，多呈典型的α或β溶血。

2.2.2 直接涂片鏡檢

特征性菌落涂片革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陽性球菌以雙球菌為主，少數(shù)呈3～5個排列的短鏈；液體培養(yǎng)物以5～10個排列的長鏈為主。

2.2.3 細菌的生化鑒定結(jié)果

根據(jù)在血平板中的溶血性現(xiàn)象把分離的鏈球菌分成兩類進行生化鑒定，第一類為β溶血，第二類為α溶血。生化鑒定結(jié)果見表4。

表4鏈球菌的生化鑒定結(jié)果

通過細菌的分離培養(yǎng)，染色鏡檢及生化鑒定，PCR檢測為陽性49頭份扁桃體中，分離鑒定出47株豬鏈球菌。

2.3 血清型鑒定結(jié)果

采用多重PCR對分離的47株豬鏈球菌進行主要致病血清學的檢測，未見主要致病血清型。

3 討論

通過對屠宰豬采樣檢測，結(jié)果表明豬鏈球菌總的攜帶率為17.17%（49/ 286），PCR檢測為陽性49頭份扁桃體中，分離鑒定出47株豬鏈球菌。采用多重PCR對分離的47株豬鏈球菌進行主要致病血清學的檢測，未見主要致病血清型。由于試驗條件所限，試驗過程中缺少標準菌株，未檢測出主要致病血清型，原因不好確定，不能說明本地區(qū)沒有該致病血清型的菌株。本地區(qū)豬鏈球菌主要致病血清型有待進一步的研究，弄清本地區(qū)豬鏈球菌的主要致病血清型是防治本病的關(guān)鍵。

國外研究者報道豬鏈球菌在豬場的攜帶率從20%至90%不等[6]；余煒烈[7]等對我國華南地區(qū)屠宰豬扁桃體進行檢測，總帶菌率為38.4%。本研究表明新疆南疆地區(qū)豬鏈球菌總的攜帶率為17.17%，可見新疆南疆地區(qū)正常豬群的豬鏈球菌的攜帶率明顯低于其他地區(qū)，原因可能是本地區(qū)豬鏈球菌病發(fā)病率低；有學者證明，在擁擠的飼養(yǎng)場，當SS發(fā)病率較高時，斷奶仔豬的SS攜帶率會超過50%；但當發(fā)病率較低時，攜帶率也會降低到3%[8]。

[1] 李立虎.豬鏈球菌病的研究進展[J].畜牧與飼料科學，2009，30（2）：173-174.

[2] 吳錦瑞.生態(tài)養(yǎng)殖與污染治理和廢物循環(huán)利用[J].中國牧業(yè)通訊，2007（1）：18-21.

[3] 陳玲，張耀文，王博善.豬鏈球菌病的診斷與防治[J].新疆畜牧業(yè)，2004（3）：19.

[4] 姚火春.獸醫(yī)微生物學實驗指導[M].2版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.

[5] Smith H E， Veenbergen V， Velde J V D， et al. The cps genes of Streptococcus suis serotype 1，2， and 9： development of rapid serotype-specific PCR assays[J]. Clin Microbiol，1999，37（10）：3146-3152.

[6] Dong Un Han，Changsun Choi， Hee-Jin Ham， et al. Prevalence，capsuLar type and antimicrobial susceptibility of Streptcoccus suis isolated from slaughter pigs in Korea. The Canadian Journal of Veterinary Research，2001，65：151-155.

[7] 余煒烈，李春玲，王貴平，等.豬鏈2型和9型廣東分離株的病原特性[J].中國獸醫(yī)科學，2007，37 （8） ：650-654.

[8] Clifton-Hadley F A， Alexander T J L. The carrier site and carrier rate of， Streptococcus suis type 2 in pigs [J]. Vet Rec，1980， 107（2）： 40-41.

Epidemiological investigation of Streptococcus suis of south Xinjiang region

WuJing1，2， Zho WenSheng3
（1. College of Animal Science ， Tarim university， Alar， Xinjiang 843300； 2. Key Laboratory of Tarim Animal Husbandry Science and Technology， Xinjiang Production & Construction Group， Alar， Xinjiang 843300； 3.Bureau of animal husbandry and veterinary medicine，Tacheng Emin， Tacheng， Xinjiang 834600）

To understand the streptococcus suis prevalence in normal pigs in south Xinjiang gegion， 286 tonsil samples of healthy pigs were collected from Streptococcus suis prevalence regions （Korla， Aksu， and Kashi） and detected in Streptococcus suis identif i cation. The PCR method was established using the Streptococcus suis glutamate dehydrogenase （gdh）gene primers. The resuLts showed that the Streptococcus suis carrier ratein south Xinjiang reached 17.13%. 47 pig-borne Streptococcus were gained through bacteria isolation and identif i ed as Streptococcus suis. Meanwhile， major pathogenic serotypes were not identif i ed by the major pathogenic serological muLtiplex PCR testing the 47 isolates.

Streptococcus suis； Epidemiological survey； Isolation and identif i cation

S858.28

：B

：1005-944X（2014）03-0058-03

本研究由兵團畜牧科技重點實驗室開放課題（HS201208）資助