分光光度法測定酶轉(zhuǎn)化液中L-絲氨酸含量

馮志彬，陳國忠，張娟，察亞平，曹薇（魯東大學生命科學學院，山東煙臺264025）

分光光度法測定酶轉(zhuǎn)化液中L-絲氨酸含量

馮志彬，陳國忠，張娟，察亞平，曹薇
（魯東大學生命科學學院，山東煙臺264025）

利用分光光度法測定酶轉(zhuǎn)化液中L-絲氨酸含量。研究表明L-絲氨酸茚三酮縮合產(chǎn)物的最大吸收波長為510 nm，正丁醇、丙酮、水、氨水展開體系有利于分離前體物甘氨酸和產(chǎn)物L-絲氨酸，在此條件下得到吸光度與L-絲氨酸含量的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 1，方法檢出限為0.061 2 g/L，平均回收率為100.9%，平均相對標準偏差為3.341%。與氨基酸分析儀相比，該法具有良好的相關(guān)性和準確的精密度，是一種簡單、有效、快速的測定方法。

L-絲氨酸；甘氨酸；分光光度法；含量測定

L-絲氨酸是一種重要的藥物，在氨基酸輸液及多肽合成方面具有重要用途，同時作為中間物直接用于合成L-多巴、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-半胱氨酸等其他氨基酸，市場需求量日益提高[1-2]。目前L-絲氨酸主要以甘氨酸為前體通過生物酶法進行轉(zhuǎn)化生產(chǎn)，建立一種適合L-絲氨酸和甘氨酸分離和定量測定的簡便、快速的方法尤為重要[3-7]。目前較為常用的高效液相色譜法和氨基酸分析儀法因操作步驟復(fù)雜、儀器維護繁瑣、價格昂貴，較難適應(yīng)L-絲氨酸生產(chǎn)過程中的多樣品、多頻次的測定[8-11]。紙層析法分離氨基酸是一種微量而快速分離分析鑒定化合物的一種方法[12]。它是近代生化領(lǐng)域最為常用的快速、高效、靈敏的分離技術(shù)。該法操作簡單、易于掌握、費用低、易于普及、分離效率高，能把各種性質(zhì)極相類似的組分分離開來，非常適合在L-絲氨酸生產(chǎn)過程控制中應(yīng)用[13-15]。國內(nèi)學者[8，16]對紙色譜測定L-絲氨酸含量進行了研究，本實驗在借鑒以往研究的基礎(chǔ)上，采用新的展開劑進一步縮短了展開時間，并獲得更好的分離效果，有利于L-絲氨酸的快速測定，對于指導L-絲氨酸工業(yè)生產(chǎn)過程的精確控制具有參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-絲氨酸、L-甘氨酸、茚三酮、正丁醇、丙酮、氨水、二乙胺、雙圈層析三號濾紙：國藥集團化學試劑有限公司。L-絲氨酸酶轉(zhuǎn)化液：魯東大學生命科學學院應(yīng)用微生物研究室生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

7200分光光度計：優(yōu)尼科（上海）儀器有限公司；氨基酸專用色譜工作站、UV200Ⅱ紫外可見波長監(jiān)測器：美國Laballiance設(shè)備公司；SHA-B恒溫振蕩器：金壇市國旺實驗儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

L-絲氨酸標準溶液：稱取L-絲氨酸標準品1 g溶于水中，定容至100 mL容量瓶中，并置于冰箱中冷藏保存。

0.5 %茚三酮溶液：稱取茚三酮標準品0.5g溶于丙酮中，定容至100 mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

展開劑：將正丁醇、冰醋酸、水、丙酮及氨水等溶劑按不同體積比例在棕色容量瓶中混合定容。

洗脫液：量取75mL無水乙醇加雙蒸水定容至100 mL，稱取0.5 g硫酸銅溶于水中定容至100 mL，冰箱保存，用時按38∶2的比例混合。

衍生劑：稱取1 g 2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene，DNFB），溶于乙腈，定容至100 mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

衍生緩沖液：稱取碳酸氫鈉4.2 g，加雙蒸水定容至100 mL，搖勻后備用。

定容緩沖液：稱取磷酸二氫鉀3.4g，加入0.1mol/LNaOH 145.5 mL，加雙蒸水定容至500 mL。

1.3.2 分光光度法

酶轉(zhuǎn)化液8 000 r/min離心5 min，上清液過0.45 μm濾膜，將濾液點樣于層析三號濾紙，點樣量2 μL，置于層析缸內(nèi)，上行展開。待層析液上行至距濾紙頂端1.0 cm左右時，取出自然晾干后，均勻噴涂顯色劑，置于95℃烘箱中顯色10 min，將氨基酸顯色斑點剪下后于25 mL比色管中，加5 mL洗脫劑洗脫20 min，得洗脫液，在7200分光光度計上測吸光度值[8]。

氨基酸標準曲線繪制：分析天平精密稱取烘干至質(zhì)量恒定的L-絲氨酸標樣1 g，用去離子水溶解并定容至100 mL，再分別稀釋配制成2 g/L、4 g/L、6 g/L、8 g/L、10 g/L的標準溶液，點樣2 μL，層析顯色后洗脫，于波長510 nm處測定吸光度值。以吸光度值A(chǔ)為橫坐標，以L-絲氨酸質(zhì)量濃度為縱坐標，繪制標準曲線，計算得回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.3.3 氨基酸分析儀法

取經(jīng)處理后的酶轉(zhuǎn)化液1 mL，8 000 r/min離心20 min，取上清液過0.22 μm濾膜。準確量取過膜后的酶轉(zhuǎn)化液液適量（相當于L-絲氨酸0.05 mmol）于50 mL棕色容量瓶中，加入已經(jīng)配制好的衍生緩沖溶液5.0 mL，搖勻后再加入衍生試劑溶液5.0 mL，搖勻，將容量瓶置于60℃水浴中暗處恒溫加熱60 min后取出，放置待溶液冷卻至室溫后，加入定容緩沖液稀釋至刻度并搖勻，放置15 min后可以開始進行色譜分離。色譜分離條件：氨基酸專用色譜ODS柱C18，5 μm，250 mm×4.6 mm，柱溫：33℃；檢測波長：360 nm；流動相總流量：1 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 吸收波長的檢測

以雙蒸水為參比液，在分光光度計上對洗脫液進行波長掃描，在波長510 nm處，L-絲氨酸洗脫液吸光度值最大，結(jié)果如圖1所示。

2.2 展開劑的選擇

由于L-絲氨酸的生產(chǎn)主要是利用甘氨酸為前體物，通過微生物酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)[4]。所以酶轉(zhuǎn)化液中既有L-絲氨酸又有甘氨酸，為獲得L-絲氨酸和甘氨酸的最佳分離效果，需對展開劑進行選擇，結(jié)果如表1、圖2所示。

圖1 L-絲氨酸標準品吸收光譜圖Fig.1 Absorbance spectra of standard L-serine

表1 不同展開劑對L-絲氨酸和甘氨酸的分離效果Table 1 Separating effect of different developing solvent on the separation of L-serine and glycine

圖2 紙色譜顯色結(jié)果Fig.2 Paper chromatography results

由表1、圖2可知，正丁醇-冰醋酸-水及正丁醇-丙酮-水體系為展開劑時，L-絲氨酸和甘氨酸的Rf值基本一致，未出現(xiàn)明顯分離；正丁醇-丙酮（乙醇）-水-二乙胺展開體系能夠分離甘氨酸和L-絲氨酸，但展開時間較長且Rf值差距不太明顯；正丁醇-丙酮-水-氨水展開劑對L-絲氨酸和甘氨酸的分離效果最好，不僅層析斑點的Rf值較大，斑點之間的Rf值差距較大，而且兩種氨基酸色斑的收斂性較好，沒有明顯的拖尾現(xiàn)象，呈圓形斑點，其中以正丁醇-丙酮-水-氨水比例為10∶15∶5∶2時效果最好。

2.3 標準曲線的繪制

L-絲氨酸標準曲線見圖3。對空白5次測定的標準偏差SB=0.003 114，當測定信號≥3倍多次測定的空白標準偏差時（即A檢測限：3SB），可以認為樣品被檢出。通過回歸方程計算絲氨酸的最低檢測質(zhì)量濃度為0.061 2 g/L。

圖3 L-絲氨酸標準曲線Fig.3 Standard curve of L-serine

2.4 加標回收率實驗

在不同質(zhì)量濃度的轉(zhuǎn)化液中加入L-絲氨酸標準液2 g/L，測定轉(zhuǎn)化液中L-絲氨酸含量，計算回收率，結(jié)果如表2所示，平均回收率都在100%左右，總平均回收率為100.9%，平均相對標準偏差（relative standar deviation，RSD)為3.341%，該法測定L-絲氨酸準確度及精密度較高，測量結(jié)果可靠。

表2 樣品回收率測定(n=5)Table 2 Determination results of recovery rate(n=5)

2.5 紙層析萃取分光光度法和氨基酸分析儀法的比較

表3 紙色譜萃取分光光度法與氨基酸分析儀測定L-絲氨酸的比較（n=3）Table 3 Comparison of L-serine determination by paper chromatography extraction spectrophotometry and amino acid analyzer(n=3)

選取3個絲氨酸轉(zhuǎn)化液樣本分別采用紙色譜萃取分光光度法和氨基酸分析儀進行測定，與氨基酸分析儀測定相比，分光光度法檢測樣本的相對誤差分別為1.39%、0.71%、1.22%，多次檢測的相對誤差均在5%以下，和氨基酸分析儀測定結(jié)果較為接近，RSD分別為4.041%、3.055%、3.606%，精密度高，重復(fù)性好，結(jié)果見表3。

3 結(jié)論

結(jié)果表明，展開劑中的正丁醇∶丙酮∶水∶氨水的體積比為10∶15∶5∶2時，L-絲氨酸和甘氨酸分離效果最好，不僅層析斑點不擴散且斑點之間的距離較大（即Rf值差值大），而且L-絲氨酸和甘氨酸的層析斑點沒有拖尾現(xiàn)象，呈圓形斑點。該方法的線性方程為C=12.412A-0.054 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1，最低檢測質(zhì)量濃度為0.061 2 g/L，平均回收率為100.9%，RSD 3.341%。轉(zhuǎn)化液樣品前處理后采用本法測定L-絲氨酸含量獲得了滿意的檢測結(jié)果，證明該方法符合L-絲氨酸生產(chǎn)過程中的測定要求。

[1]喻放，左振宇，楊忠華，等.一株高產(chǎn)絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶基因工程菌的構(gòu)建及發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].武漢科技大學學報，2013，36（3）：219-224.

[2]蔡宇，吳梧桐.運用現(xiàn)代生物技術(shù)生產(chǎn)L-絲氨酸的研究進展[J].藥學進展，1996，20（1）：16-20.

[3]歐倩，韋東，武波.絲氨酸生產(chǎn)菌的篩選及靜息細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中L-絲氨酸的合成[J].氨基酸和生物資源，2006，28（3）：41-44.

[4]李鑫，劉軍，趙沁沁，等.共表達SHMT和TPase載體的構(gòu)建及雙酶法合成L-色氨酸[J].生物工程學報，2010，26（9）：1302-1308.

[5]張曉娟，竇文芳，許泓瑜，等.維生素對谷氨酸棒桿菌SYPS-062直接發(fā)酵合成L-絲氨酸的影響[J].中國生物工程雜志，2007，27（5）：50-55.

[6]羅玉常.產(chǎn)L-絲氨酸谷氨酸棒桿菌SYPS-062的代謝工程[D].無錫：江南大學碩士論文，2012

[7]IZUMI Y,YOSHIDA T,MIYAZAKI S S,et al.L-serine production by a methylotroph and its related enzymes[J].Appl Microbiol Biot,1993,39 (4-5):427-432.

[8]王兢，江波，馮骉.紙色譜萃取分光光度法測定γ-氨基丁酸的研究[J].食品科學，2007，28（1）：225-227.

[9]張劍，楊新妮，高冰.分光光度法在色氨酸定量中的應(yīng)用[J].中國釀造，2012，31（6）：166-169.

[10]陳亞紅，田豐收，周盼.酶催化分光光度法測定L-酪氨酸[J].中國釀造，2012，31（2）：180-182.

[11]汪世華，白文釗，康旭，等.發(fā)酵液中L-谷氨酰胺含量的測定[J].湖北工學院學報，2001，16（1）：56-58.

[12]于泓，牟世芬.氨基酸分析方法的研究進展[J].分析化學，2005，33（3）：398-404.

[13]周圓圓，朱敏，王磊，等.變色酸-分光光度法測定絲氨酸含量[J].氨基酸與生物資源，2007，29（1）：73-76.

[14]曹瓊瑤.發(fā)酵液中L-絲氨酸的簡易測定方法的研究[J].三峽大學學報：自然科學版，2006，28（5）：469-471.

[15]范婉萍，吳婕.用分光光度法測定氨基酸類制品中的氨基酸含量[J].中國測試技術(shù)，2007，33（3）：117-119.

[16]盧發(fā)，張偉國.紙層析-分光光度法測定發(fā)酵液中L-絲氨酸和甘氨酸的含量[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（3）：119-121.

Determination of L-serine in enzyme conversion liquid by spectrophotometry

FENG Zhibin,CHEN Guozhong,ZHANG Juan,CHA Yaping,CAO Wei

(College of Life Science,Ludong University,Yantai 264025,China)

Determination of L-serine in enzyme conversion liquid was carried out by spectrophotometry.Results showed that the maximum absorbance wavelength of L-serine ninhydrin condensation products was 510 nm,and the compound of normal butanol,acetone,water and aqua ammonia developing agent is good for L-serine and glycine separation.The linear relationship between the absorption and the concentration of L-serine was obtained,and the linear correlation coefficient,detection limit,average recovery and relative standard deviation were 0.999 1,0.061 2 g/L,100.9%and 3.341%,respectively.Comparing to the amino acid analyzer,the method is simple,effective and quick,with good correlation and accurate precision.

L-serine;glycine;spectrophotometer;determination

O657.32

A

0254-5071（2014）07-0102-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.023

2014-05-17

山東省高等學校科技計劃項目（J12LD02）

馮志彬（1977-），男，講師，碩士，研究方向為發(fā)酵工程。