釀酒酵母的連續(xù)復(fù)合誘變及其突變株的快速篩選

吳新世，董曉惠，李 羚

（天津理工大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，天津300384）

篩選高產(chǎn)乙醇的釀酒酵母對(duì)于人類開發(fā)新能源具有重要意義.高產(chǎn)釀酒酵母可通過自然突變、菌種誘變或遺傳改造等多種方式獲得.菌種誘變是目前相對(duì)成熟的技術(shù)手段，它不需要十分了解菌株的遺傳背景，且定向性好，突變得率較高.自從應(yīng)用微生物領(lǐng)域開展菌種誘變以來，目的突變株的誘變和篩選一直是育種工作者重點(diǎn)攻克的方向之一.關(guān)于菌種誘變特別是酵母菌的誘變選育，已有大量研究報(bào)道[1-11]，多種誘變篩選方法構(gòu)成了微生物誘變育種的方法體系.目前，酵母菌突變株的誘變方法中，大多為單因素或雙因素不連續(xù)誘變，誘變效果也不相同.雖然也有雙因素連續(xù)誘變的報(bào)道[2]，但過程相對(duì)簡(jiǎn)單，未形成完整的連續(xù)誘變方法體系.在誘變后的篩選過程中，為便于目的突變株的檢出，常規(guī)篩選中需要人為地使菌株攜帶上某種篩選標(biāo)記，但這種處理可能會(huì)對(duì)目的性狀產(chǎn)生負(fù)面影響[12].因此，在不損傷親株遺傳背景的前提下檢出目的菌株，對(duì)于突變株優(yōu)良性狀的獲得以及防止菌株性能衰退等都具有重要意義.

本課題組利用己烯雌酚（diethylstilbestrol，DES）和UV對(duì)工業(yè)用釀酒酵母進(jìn)行連續(xù)誘變，之后采用改進(jìn)的發(fā)酵小管集氣法篩選目的突變株.該連續(xù)誘變方法相對(duì)完整，篩選方法快速而且對(duì)親株遺傳背景沒有損傷.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

出發(fā)菌株為高產(chǎn)乙醇的工業(yè)用釀酒酵母QD（Saccharomyces cerevisiae），由本實(shí)驗(yàn)室保存.

菌種誘變所用培養(yǎng)基為YEPD培養(yǎng)基；高滲再生培養(yǎng)基，即YEPD固體培養(yǎng)基中加入0.6mol/L甘露醇；突變株篩選所用培養(yǎng)基為YEPD培養(yǎng)基和甘蔗汁發(fā)酵培養(yǎng)基[13].

工具酶為蝸牛酶和纖維素酶，由北京鼎國(guó)生物科技有限公司生產(chǎn).使用前用高滲穩(wěn)定液配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.5%的蝸牛酶和0.5%的纖維素酶混合酶液，現(xiàn)配現(xiàn)用，以0.22μm的微孔濾膜過濾除菌.

磷酸鹽緩沖液：將7.9mL的Na2HPO4溶液（濃度為1.0mol/L）與92.1mL的NaH2PO4溶液（濃度為1.0mol/L）混合，得到濃度為0.1mol/L、pH 5.8的磷酸鹽緩沖液.115℃滅菌20min.

高滲穩(wěn)定液：上述磷酸鹽緩沖液中加入甘露醇，使其最終濃度為0.6mol/L.115℃滅菌20min.

預(yù)處理劑：含0.05mol/L的EDTA和0.5mol/L的β-巰基乙醇的溶液，以0.22μm微孔濾膜過濾除菌.

儀器：SBA-40C型生物傳感分析儀，由山東省科學(xué)院生產(chǎn)；DES，分析純級(jí)，由天津市光復(fù)試劑公司生產(chǎn)；葡萄糖，由天津市江天化工科技有限公司生產(chǎn).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 連續(xù)復(fù)合誘變

原生質(zhì)體的制備與再生參照文獻(xiàn) [14-15].預(yù)處理前，為了減少細(xì)胞已吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)預(yù)處理及誘變效果的干擾，將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的新鮮菌液離心后加入同體積無菌水，饑餓培養(yǎng)2h，再以生理鹽水洗滌[16].之后進(jìn)行預(yù)處理及原生質(zhì)體的制備.

原生質(zhì)體的連續(xù)復(fù)合誘變包括2個(gè)步驟：（1）單因素誘變；（2）雙因素連續(xù)復(fù)合誘變.

（1）單因素誘變：將上述制得的原生質(zhì)體進(jìn)行DES誘變，方法參照文獻(xiàn)[7-8].按常規(guī)方法繪制誘變曲線，判定本實(shí)驗(yàn)體系下DES誘變的致死率、最大正向突變率及其對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn).

（2）雙因素連續(xù)復(fù)合誘變：上述誘變條件不變，選取DES誘變最大正向突變率對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)，對(duì)釀酒酵母進(jìn)行DES誘變.之后不進(jìn)行任何處理，立即對(duì)上述DES誘變后的酵母菌培養(yǎng)物再次進(jìn)行UV誘變，UV 誘變的時(shí)間分別設(shè)定為 0、10、20、30、40、50、60、70、80、90s.誘變后的培養(yǎng)物以高滲穩(wěn)定液稀釋到細(xì)胞濃度為1×10-3/L，涂高滲再生培養(yǎng)基平板，黑暗處培養(yǎng)48h.計(jì)算原生質(zhì)體的致死率.挑取單菌落按以下方式進(jìn)行高產(chǎn)菌株的篩選及正向突變率的計(jì)算.

繪制酵母菌突變株的生長(zhǎng)曲線：將連續(xù)誘變獲得的單菌突變株在最佳培養(yǎng)條件下（培養(yǎng)溫度為30℃，pH值自然，轉(zhuǎn)速為120r/min，YEPD培養(yǎng)基）轉(zhuǎn)液體培養(yǎng).以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、以菌液的吸光度值A(chǔ)600為縱坐標(biāo)，每隔2h取樣一次，測(cè)定溶液的吸光度值，繪制突變株培養(yǎng)液的吸光度值隨培養(yǎng)時(shí)間變化的生長(zhǎng)曲線.

試管液體培養(yǎng)基的配制及滅菌：配制YEPD培養(yǎng)基1000mL，分裝入100個(gè)試管.取其中的50個(gè)試管，倒置放入充滿YEPD液體培養(yǎng)基的發(fā)酵小管，將裝有發(fā)酵小管的試管液體培養(yǎng)基（用a表示）和另外50個(gè)未裝發(fā)酵小管的試管液體培養(yǎng)基（用b表示）共同在115℃、0.75MPa的濕熱蒸汽下滅菌20min.

接種與培養(yǎng)：向未裝發(fā)酵小管的試管液體培養(yǎng)基b中接入酵母菌突變株菌液，通入無菌空氣條件下，30℃、150r/min振蕩培養(yǎng)9h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，取出待用，記為c.

乙醇發(fā)酵：無菌操作.將a中的發(fā)酵小管從液體中取出，迅速倒置放入培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期的培養(yǎng)液c中，立即向試管液體中通入無菌氮?dú)?，小心避免氣體進(jìn)入發(fā)酵小管，待完全排出液體中的氧氣后密封試管口.將裝有發(fā)酵小管的試管培養(yǎng)物c繼續(xù)于30℃下靜置培養(yǎng)至一個(gè)培養(yǎng)周期（包括不放發(fā)酵小管的菌體生長(zhǎng)階段、放入發(fā)酵小管后菌體發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)乙醇和CO2的階段）.

乙醇高產(chǎn)菌株初篩：將上述完成一個(gè)培養(yǎng)周期的培養(yǎng)液取出，觀察試管液體中發(fā)酵小管內(nèi)的氣泡產(chǎn)生及排出液體情況，根據(jù)發(fā)酵小管內(nèi)氣柱大小初步判斷酵母菌產(chǎn)乙醇能力.氣柱越大，產(chǎn)乙醇越多，從而快速篩選出高產(chǎn)乙醇的突變株.

產(chǎn)乙醇能力測(cè)定：將上述初篩得到的高產(chǎn)菌株接種甘蔗汁發(fā)酵培養(yǎng)基[13]進(jìn)行產(chǎn)乙醇發(fā)酵.取樣，適當(dāng)稀釋，使用SBA-40C型生物傳感分析儀測(cè)定乙醇產(chǎn)量.

正向突變率計(jì)算：根據(jù)突變株的乙醇產(chǎn)量結(jié)果，計(jì)算連續(xù)誘變的正向突變率，公式如下：

1.2.2 常規(guī)復(fù)合誘變及篩選過程

原生質(zhì)體的制備及再生參照文獻(xiàn)[9-10].

原生質(zhì)體的常規(guī)復(fù)合誘變及篩選：方法參照文獻(xiàn)[2]和[8].誘變因子分別為DES和UV.

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母原生質(zhì)體的選擇

釀酒酵母原生質(zhì)體的生長(zhǎng)情況如表1所示.

表1 原生質(zhì)體的生長(zhǎng)及再生率Tab.1 Forming rate and regeneration rate of protoplast

由表1可以看出，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中期，原生質(zhì)體的形成率和再生率都比穩(wěn)定期時(shí)的高，所以制備原生質(zhì)體應(yīng)選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的新鮮培養(yǎng)物.

2.2 釀酒酵母連續(xù)誘變

2.2.1 DES誘變

對(duì)DES誘變應(yīng)用常規(guī)方法計(jì)算致死率和正向突變率，繪制誘變曲線，結(jié)果如圖1所示.

圖1 DES誘變曲線Fig.1 Curve of DES mutagenesis

DES誘變結(jié)果表明，當(dāng)誘變時(shí)間為100min時(shí)，釀酒酵母的致死率接近100%；當(dāng)誘變時(shí)間為60min時(shí)，正向突變率達(dá)到最大值17.4%，此時(shí)致死率低于80%.

DES誘變的目的是求得最大正向突變率對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)，為連續(xù)復(fù)合誘變提供參數(shù)依據(jù).

2.2.2 連續(xù)復(fù)合誘變

連續(xù)復(fù)合誘變中，依據(jù)以上的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，首先對(duì)釀酒酵母進(jìn)行DES誘變，誘變時(shí)間選為60min.之后立即對(duì)DES誘變后的菌液進(jìn)行UV誘變，誘變時(shí)間分別設(shè)定為 0、10、20、30、40、50、60、70、80、90s.

連續(xù)誘變后的菌液進(jìn)行高產(chǎn)突變株的篩選，以誘變時(shí)間50s為例.

實(shí)驗(yàn)中需要繪制出每一個(gè)酵母菌突變株的生長(zhǎng)曲線，這里僅繪出一個(gè)突變株mut112的生長(zhǎng)曲線，如圖2所示.由圖2可知，菌株在既定培養(yǎng)條件下的延遲期為0～2h，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為2～10h，培養(yǎng)10h以后菌株進(jìn)入穩(wěn)定期.實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，其他突變株的生長(zhǎng)曲線與mut112相同.

圖2 突變株mut112的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of mutant mut112

待各突變株培養(yǎng)至一個(gè)周期后，取出試管液體培養(yǎng)物，觀察發(fā)酵小管內(nèi)液體的排空情況.以原始菌株的發(fā)酵小管內(nèi)氣柱大小為參考，比較各突變株發(fā)酵小管中產(chǎn)氣量大小，初篩得到30株產(chǎn)氣量大于原始菌株的突變株，包括 mut3、mut24、mut37、mut56、mut89、mut105、mut112等.發(fā)酵小管內(nèi)空氣柱體積越大，里面的液體被排出越多，酵母菌產(chǎn)CO2越多，對(duì)應(yīng)的乙醇產(chǎn)量就越高.表2列出了產(chǎn)氣明顯大于原始菌株的7株突變株.在篩到的159個(gè)突變株中，僅有30個(gè)菌株產(chǎn)氣量大于原始菌株，其余均小于原始菌株或不產(chǎn)氣.根據(jù)酵母菌的代謝特性，可利用發(fā)酵小管集氣法初步定性表征酵母菌產(chǎn)CO2的能力，進(jìn)而間接表征酵母菌產(chǎn)乙醇的能力.但是在利用這種方式考察酵母菌產(chǎn)乙醇能力時(shí)，不能在接入菌種后立即放入發(fā)酵小管，因?yàn)榻湍妇谂囵B(yǎng)前期的生長(zhǎng)繁殖時(shí)期進(jìn)行有氧代謝，將葡萄糖徹底氧化獲得能量的同時(shí)產(chǎn)生CO2，而且產(chǎn)CO2的效率較高.如果過早放入發(fā)酵小管，不容易區(qū)分小管內(nèi)的CO2究竟通過有氧代謝還是無氧代謝產(chǎn)生，或前者與后者的比例有多大.如果把這些CO2不加區(qū)分都當(dāng)成葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)生的，很容易得到假的高產(chǎn)菌株.本實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵小管集氣法進(jìn)行改進(jìn)，可將目的突變株初步迅速地篩選出來.為防止酵母菌利用YEPD培養(yǎng)基中的酵母粉或蛋白胨作碳源進(jìn)行產(chǎn)乙醇發(fā)酵而產(chǎn)生干擾，將上述初篩得到的30株正向突變株重新接種甘蔗汁發(fā)酵培養(yǎng)基[13]進(jìn)行產(chǎn)乙醇發(fā)酵分析.乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為40mg/100mL，發(fā)酵原液稀釋400倍后，各個(gè)菌株的乙醇含量測(cè)得值如表2所示.

表2 突變株的產(chǎn)氣能力Tab.2 Respective aerogenesis capacity of some mutants

由表2可以看出，mut3、mut56和mut112的乙醇產(chǎn)量相對(duì)較高，其中mut112的乙醇產(chǎn)量為9720mg/100mL（400×24.3 mg/100mL），比原始菌株的乙醇產(chǎn)量 7880mg/100mL（400×19.7mg/100mL）高出約23.4%.該突變株經(jīng)傳代16次以上，實(shí)驗(yàn)證明無菌種性能衰退現(xiàn)象.實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，表明應(yīng)用本方案可以快速檢測(cè)出乙醇產(chǎn)量高的突變株.

據(jù)此可計(jì)算出經(jīng)50s誘變后的正向突變率為18.9%.

連續(xù)復(fù)合誘變中其他時(shí)間點(diǎn)的突變株篩選及其正向突變率計(jì)算與50s時(shí)的相同.得到各個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的正向突變率，如表3所示.

表3 不同誘變時(shí)間下連續(xù)復(fù)合誘變的正向突變率Tab.3 Positive mutation rates of consecutively combined mutagenesis in different mutation periods

根據(jù)以上計(jì)算結(jié)果，結(jié)合致死率繪制酵母菌的連續(xù)復(fù)合誘變曲線，如圖3所示.

圖3 連續(xù)復(fù)合誘變曲線Fig.3 Curve of consecutively combined mutagenesis

由圖3可知，本實(shí)驗(yàn)采用雙因素連續(xù)復(fù)合誘變的正向突變率最大值為18.9%，出現(xiàn)在50s，顯示出該誘變方法具有較高的正誘變趨勢(shì).然而在連續(xù)誘變中，酵母菌的死亡速率大大加快，到90s時(shí)死亡率已接近100%，說明在DES和UV的連續(xù)作用下，大部分菌株的細(xì)胞物質(zhì)被嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致細(xì)胞無法正常代謝而死亡.

2.3 常規(guī)復(fù)合誘變

常規(guī)復(fù)合誘變中，DES誘變步驟與連續(xù)復(fù)合誘變相同，誘變曲線見圖1.對(duì)DES誘變中篩選到的突變株再次進(jìn)行UV誘變.結(jié)果如圖4所示.

圖4 UV誘變曲線Fig.4 Curve of UV mutagenesis

由圖4可知，當(dāng)UV誘變時(shí)間達(dá)到180s時(shí)，釀酒酵母的死亡率接近100%.此次誘變的正向突變率最大值為15.6%，誘變時(shí)間為120s.從UV誘變篩選到的菌株中，乙醇產(chǎn)量最高為9170mg/100mL，低于連續(xù)誘變篩選到的菌株產(chǎn)量（9720mg/100mL）.

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)釀酒酵母采用連續(xù)復(fù)合誘變方法，得到酵母菌的最大正向突變率為18.9%，較常規(guī)復(fù)合誘變提高了21.2%，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，初步證明了該誘變方法可行.同時(shí)，通過連續(xù)復(fù)合誘變篩選到一株高產(chǎn)菌株，其乙醇產(chǎn)量為9720mg/100mL，比原始菌株提高了23.4%，比常規(guī)復(fù)合誘變得到的突變株產(chǎn)量高出6.0%，菌株性能穩(wěn)定，連續(xù)傳代16代以上未出現(xiàn)菌株性能退化現(xiàn)象.

在突變株的篩選上，本實(shí)驗(yàn)在已有研究基礎(chǔ)[3，13]上加以改進(jìn)，分析酵母菌不同生理時(shí)期的生長(zhǎng)特點(diǎn)，適時(shí)放置發(fā)酵小管，并通過控制發(fā)酵液中的溶氧量，保證發(fā)酵小管內(nèi)的氣體絕大部分通過葡萄糖發(fā)酵而產(chǎn)生.根據(jù)發(fā)酵小管內(nèi)的產(chǎn)氣量，初步、快速地推斷出哪些突變株為高產(chǎn)菌株.再對(duì)這些突變株進(jìn)行產(chǎn)乙醇能力分析.該方法排除了葡萄糖有氧氧化階段生成CO2對(duì)篩選目的突變株的干擾，可一次淘汰更多的負(fù)向突變株，使目的突變株的篩選工作量大大減輕并節(jié)省了時(shí)間.應(yīng)用本篩選方法很容易排除初篩中的假高產(chǎn)菌株.

關(guān)于突變株的篩選方法，國(guó)內(nèi)外已有很多研究報(bào)道[1-12]，也提出了許多不同思路.這些思路減輕了一些研究任務(wù)，目的和方向性也更明確，但工作量仍然繁重.有研究者為減輕工作量而能夠快速篩選出目的突變株，人為地使菌株帶上某種遺傳標(biāo)記.然而這種人為的遺傳標(biāo)記常常會(huì)損傷親株的遺傳背景，使目的突變株的優(yōu)良性狀弱化[12].本篩選方法在不損傷遺傳背景的前提下對(duì)用發(fā)酵小管篩選高產(chǎn)菌株方法加以改進(jìn)，是一種科學(xué)合理、邏輯嚴(yán)密的快速篩選方法.酵母菌突變株的篩選方法不局限于某一種，以產(chǎn)量性狀為考察指標(biāo)的突變株篩選最終要以目的產(chǎn)物的產(chǎn)量為考察依據(jù)，同時(shí)可輔以其他篩選方法[16]，如底物葡萄糖的消耗量、CO2產(chǎn)量等.

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