乙肝病毒DNA定量水平和乙型肝炎病毒標(biāo)志物定量檢測(cè)指標(biāo)相關(guān)性研究

楊 勇，王占科，陳 鑫，鐘 瑩

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)標(biāo)志物是HBV顆粒外殼蛋白成分誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的抗體，結(jié)果異常并不意味著外周血存在HBV完整顆粒［1-4］。通過(guò)檢測(cè)HBV DNA可以了解HBV在體內(nèi)存在的數(shù)量，HBV是否復(fù)制，乙型肝炎是否具有傳染性及傳染性有多強(qiáng)，是否有必要服藥，確定肝功能改變是否是由病毒引起，判斷適合用哪類(lèi)抗病毒藥物及藥物治療的效果［5-8］。因此，HBV DNA定量檢測(cè)在臨床上意義重大。HBV標(biāo)志物定性檢測(cè)與HBV DNA定量檢測(cè)的相關(guān)性研究，國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道［9-12］，但HBV標(biāo)志物定量檢測(cè)與HBV DNA定量檢測(cè)的相關(guān)性研究，國(guó)內(nèi)報(bào)道不多，為此，我們以大三陽(yáng)和小三陽(yáng)患者作為研究對(duì)象，同時(shí)檢測(cè)其HBV標(biāo)志物定量結(jié)果和HBV DNA定量結(jié)果，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和比較，旨在探討HBV標(biāo)志物定量檢測(cè)和HBV DNA定量檢測(cè)在判斷HBV感染者傳染性中的臨床意義，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從2013年1月1日—2014年6月1日來(lái)我院檢驗(yàn)科采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)確診的在感染性疾病科門(mén)診就診和住院的大三陽(yáng)368例和小三陽(yáng)507例中，各隨機(jī)選取50例作為大三陽(yáng)組和小三陽(yáng)組。大三陽(yáng)組外周血HBV標(biāo)志物HBsAg陽(yáng)性、HBeAg陽(yáng)性和HBcAb陽(yáng)性，小三陽(yáng)組組外周血HBsAg陽(yáng)性、HBeAb陽(yáng)性和HBcAb陽(yáng)性。大三陽(yáng)組男女性別比為 1:0．45，年齡(40．32±12.36)歲;小三陽(yáng)組男女性別比為1:0．51，年齡(42．80±12．36)歲，大三陽(yáng)組和小三陽(yáng)組性別構(gòu)成比、年齡之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 材料與方法 大三陽(yáng)組和小三陽(yáng)組的血標(biāo)本同時(shí)做HBV標(biāo)志物定量和HBV DNA定量檢測(cè)。外周血HBV標(biāo)志物定量檢測(cè)采用時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定法(TRFIA)測(cè)定，ELISA定性檢測(cè)HBV標(biāo)志物試劑盒從北京萬(wàn)泰生物技術(shù)有限公司購(gòu)買(mǎi)，在上海普朗酶標(biāo)儀上進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)操作和結(jié)果判讀參考試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，陰性對(duì)照檢測(cè)結(jié)果陰性，室內(nèi)質(zhì)量控制在控。外周血HBV DNA定量檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行測(cè)定，試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀從廈門(mén)安普利生物技術(shù)有限公司購(gòu)買(mǎi)，并保證室內(nèi)質(zhì)量控制結(jié)果在控，我院檢驗(yàn)科基因擴(kuò)增PCR實(shí)驗(yàn)室通過(guò)省衛(wèi)生廳驗(yàn)收合格。

1.3 結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn) HBV標(biāo)志物定量檢測(cè)結(jié)果≥正常參考范圍上限為陽(yáng)性，用實(shí)際數(shù)值表示;HBsAg結(jié)果超過(guò)240 ng/ml，需對(duì)檢測(cè)標(biāo)本進(jìn)行倍比稀釋后進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，檢測(cè)結(jié)果低于正常參考范圍下限為陰性。HBV DNA定量檢測(cè)結(jié)果用每毫升樣本的DNA拷貝數(shù)(copies/ml)表示，≤500為陰性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR以起始HBV DNA標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)，根據(jù)待測(cè)樣品的Ct值計(jì)算待測(cè)樣品的HBV DNA的拷貝數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 檢測(cè)到的陰性或陽(yáng)性結(jié)果用百分率表示，采用卡方檢驗(yàn)。檢測(cè)到的計(jì)量數(shù)據(jù)，先通過(guò)正態(tài)分布性檢驗(yàn)，如果數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，如果數(shù)據(jù)不呈正態(tài)分布需進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后呈正態(tài)分布，再用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，HBV DNA定量檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)需要進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，采用t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析應(yīng)用相關(guān)系數(shù)顯著性分析。α=0．05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 大三陽(yáng)組和小三陽(yáng)組HBV標(biāo)志物定量和HBV DNA定量檢測(cè)結(jié)果分析 大三陽(yáng)組定量檢測(cè)HBsAb和 HBeAb均為陰性;小三陽(yáng)組定量檢測(cè)HbeAg均為陰性;大三陽(yáng)組 HBsAg含量和 HBV DNA定量檢測(cè)結(jié)果均明顯高于小三陽(yáng)組(P＜0.01)，HBcAb與小三陽(yáng)組比較，無(wú)顯著性差異(P＞0．05)，見(jiàn)表1。

表1 2組乙型肝炎患者乙型肝炎病毒標(biāo)志物和乙肝病毒DNA定量檢測(cè)結(jié)果比較(±s)

表1 2組乙型肝炎患者乙型肝炎病毒標(biāo)志物和乙肝病毒DNA定量檢測(cè)結(jié)果比較(±s)

注:b P＜0.01

項(xiàng)目 單位 大三陽(yáng)組(n=50)小三陽(yáng)組(n=50)HBsAg ng/ml 165．23 ±86．14 42．18 ±16．77b HBsAb mIU/ml 陰性(＜10．0) 陰性(＜10．0)HBeAg PEIU/ml 26．56 ±12．14 陰性(＜0．5)HBeAb PEIU/ml 陰性(＜0．2) 3．02 ±0．81 HBcAb PEIU/ml 3．36 ±0．60 3．17 ±0．82 HBV DNA Lg(copies/ml) 7．32 ±1．30 4．35 ±2．11b

2.2 大三陽(yáng)組和小三陽(yáng)組HBV DNA定量陽(yáng)性率比較 大三陽(yáng)組HBV DNA定量陽(yáng)性率為96．00%(48/50)，小三陽(yáng)組陽(yáng)性率為 16．00%(8/50)，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.3 HBV DNA陽(yáng)性的大三陽(yáng)患者HBV DNA含量與HBeAg含量相關(guān)性研究 48例HBV DNA陽(yáng)性的大三陽(yáng)患者HBV DNA含量與HBsAg相關(guān)系數(shù)為0．6832，與 HBeAg 含量相關(guān)系數(shù)為 0．8563，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

3 討論

HBV感染呈世界性流行，但不同地區(qū)HBV感染的流行強(qiáng)度差異很大，傳播途徑不確定［13-16］。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球約20億人曾感染過(guò)HBV，其中3．5億人為慢性HBV感染者，每年約有100萬(wàn)人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌［17-20］。HBV感染者部分發(fā)展成肝炎，部分為正常攜帶者，也有部分發(fā)展成肝硬化和肝癌［21-23］。HBV感染率高，不僅危害社會(huì)公共健康，也是醫(yī)務(wù)人員職業(yè)暴露時(shí)容易感染的病毒［24-25］，HBV感染者一部分人群為正常人群，無(wú)傳染性，也有部分人群具有傳染性，判斷HBV感染者是否具有傳染性，對(duì)做好HBV感染控制和預(yù)防工作，具有重要意義［26-29］。

HBV是一種具有嗜肝細(xì)胞生物學(xué)特征的雙鏈DNA病毒，為部分雙鏈環(huán)狀DNA。HBV含4個(gè)部分重疊的開(kāi)放讀碼框(ORF)，即前S/S區(qū)、前C/C區(qū)、P區(qū)和X區(qū)。前S/S區(qū)編碼大(前S1、前S2及S)、中(前S2及S)、小(S)3種包膜蛋白;前C/C區(qū)編碼HBeAg及HBcAg;P區(qū)編碼聚合酶;X區(qū)編碼X蛋白。HBV基因組長(zhǎng)度為3．2 kb，病毒完整顆粒為42 nm，包括病毒顆粒外殼和內(nèi)核兩部分，1965年由Dane發(fā)現(xiàn)，又稱(chēng)丹妮顆粒［30］。HBV主要存在于患者肝細(xì)胞內(nèi)，如果HBV不復(fù)制或不活動(dòng)，完整的病毒顆粒一般不會(huì)通過(guò)肝細(xì)胞膜釋放或分泌到肝細(xì)胞外，只分泌一些HBV外殼中的部分抗原物質(zhì)，如HBV表面抗原等。肝臟是一個(gè)血供極其豐富的器官，一旦HBV從肝細(xì)胞內(nèi)溢出，完整的含有病毒DNA的 HBV顆粒就存在于血液中［31］。外周血HBV存在3種形式，一是直徑為22 nm的球形顆粒，無(wú)傳染性，一般為 HBsAg蛋白;二是直徑為22 nm，長(zhǎng)度為100 nm以上的管狀顆粒，也主要由HBsAg組成，不含核酸，無(wú)傳染性;三是大球形顆粒，也就是完整的HBV顆粒，直徑約42 nm，分為包膜和核心兩部分。包膜含HBsAg、HbeAg等抗原，核心含HBcAg抗原、環(huán)狀雙股HBV DNA和HBV DNA多聚酶，具有傳染性。因此，判斷HBV感染者是否具有傳染性主要取決于外周血有沒(méi)有完整的HBVDNA 和 HBeAg。

檢測(cè)HBV標(biāo)志物的方法有很多，ELISA是檢測(cè)HBV標(biāo)志物的經(jīng)典方法，但只能定性，定量比較困難，不能確定患者血液中HBV相關(guān)抗原和抗體的含量，這對(duì)觀(guān)察HBsAg的含量變化、判斷臨床治療效果造成困難。TRFIA是一種繼放射免疫、酶免疫和發(fā)光免疫后的一種非放射性標(biāo)記免疫分析技術(shù)。鑭系元素的螯合物為T(mén)RFIA所使用標(biāo)記物，具有發(fā)出的熒光時(shí)間長(zhǎng)、強(qiáng)度高等特點(diǎn)，因?yàn)榇蟛糠直尘胺翘禺悷晒舛际嵌虝捍嬖诘亩虝r(shí)間熒光，鑭系金屬螯合物發(fā)出的熒光時(shí)間長(zhǎng)，可有效地避免本底非特異熒光的干擾，故稱(chēng)TRFIA［32］。TRFIA是一種定量檢測(cè)HBV標(biāo)志物的新方法，具有靈敏度高、特異性好等特點(diǎn)［33］。本實(shí)驗(yàn)表明:ELISA證實(shí)的大三陽(yáng)和小三陽(yáng)患者經(jīng)TRFIA方法檢測(cè)均證實(shí)為大三陽(yáng)和小三陽(yáng)患者，提示HBV定量檢測(cè)和定性檢測(cè)結(jié)果一致。定性檢測(cè)向定量檢測(cè)發(fā)展是檢驗(yàn)技術(shù)創(chuàng)新的方向，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)為準(zhǔn)確定量檢測(cè)外周血中HBV顆粒DNA水平，提供實(shí)驗(yàn)工具［34］。

本研究結(jié)果表明:大三陽(yáng)患者HBV表面抗原含量明顯高于小三陽(yáng)患者，提示大三陽(yáng)患者體內(nèi)病毒含量較多，進(jìn)一步研究證明，大三陽(yáng)患者HBV DNA含量也明顯高于小三陽(yáng)患者，為判斷大三陽(yáng)患者具有較強(qiáng)的傳染性提供直接實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。同時(shí)，研究結(jié)果也表明:大三陽(yáng)患者HBV DNA陽(yáng)性率明顯高于小三陽(yáng)患者，但并不是所有的小三陽(yáng)患者HBV DNA都是陰性，也不是全部大三陽(yáng)患者HBV DNA都是陽(yáng)性，提示并不是全部小三陽(yáng)患者都沒(méi)有傳染性，也不是全部大三陽(yáng)患者都具有傳染性。判斷HBV感染者是否具備傳染性，必須結(jié)合PCR的方法檢測(cè)HBV DNA。當(dāng)外周血存在完整的包裹DNA的病毒顆粒時(shí)，PCR才能檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果。HBV完整顆粒從肝細(xì)胞內(nèi)分泌到外周血，是HBV正在復(fù)制的標(biāo)記，HBV在復(fù)制過(guò)程中，高表達(dá)HBeAg到血液中，這可能是我們發(fā)現(xiàn)的HBV DNA含量和HBeAg明顯正相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)大于其和HBsAg相關(guān)系數(shù)的原因。

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