減毒沙門菌載體在腫瘤基因治療中的研究進(jìn)展

賈慶華，惠 玲

目前基因治療發(fā)展迅速，腫瘤基因治療方法已經(jīng)逐步從實(shí)驗(yàn)及基礎(chǔ)研究過渡到臨床試用階段，理論和技術(shù)層次上日趨成熟。然而基因治療還沒達(dá)到完全安全、高效、準(zhǔn)確的目標(biāo)，其中基因治療的載體是最受關(guān)注問題之一。合適的載體應(yīng)具備最大的有效性和最小的毒性，傳統(tǒng)生物類載體主要是病毒載體和非病毒載體。目前低毒或無毒的且具有靶向性感染特點(diǎn)的細(xì)菌載體在腫瘤基因治療得到證實(shí)，充分說明了細(xì)菌載體開辟抗腫瘤治療的新途徑。本文就減毒沙門菌作為載體在腫瘤基因治療中的應(yīng)用綜述如下。

1 減毒沙門菌的抗腫瘤研究

大量研究表明沙門菌本身不僅對腫瘤有直接的溶瘤作用，而且減毒株較野生株具有更好的靶向定植性［1-2］。因而利用基因工程技術(shù)將沙門菌染色體基因組改造以實(shí)現(xiàn)毒力減弱而得到減毒菌株，如隨機(jī)插入1個轉(zhuǎn)座子或刪除1段或幾段致病基因，在降低對宿主致病力的同時，仍可保留其高度的免疫原性，從而為臨床應(yīng)用提供了安全性的前提［3-4］。利用減毒沙門菌選擇性地在腫瘤組織內(nèi)復(fù)制、增生來抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長，從而延長宿主存活時間，并能改變宿主免疫應(yīng)答［5-6］。

Zheng等［7］應(yīng)用沙門傷寒桿菌減毒株VNP20009(pur-、msd-、xyl-)做了臨床前實(shí)驗(yàn)，通過靜脈給小鼠一次注射多種荷瘤(鼠、人黑色素瘤，人結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、肺肉瘤等)，發(fā)現(xiàn)相對于正常部位，細(xì)菌聚集在腫瘤部位(包括轉(zhuǎn)移瘤)大約為200～1000倍，腫瘤組織生長得到控制，即使在小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移模型上，腫瘤生長亦延緩，動物的生存時間得以延長。由此推測沙門菌導(dǎo)致腫瘤生長減慢可能因?yàn)槟[瘤生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)為細(xì)菌所消耗［8-9］。細(xì)菌所產(chǎn)生的酶，如天冬酰胺酶，可耗竭腫瘤生長必需氨基酸，細(xì)菌向胞外微環(huán)境分泌的局部毒素或者產(chǎn)生的腫瘤壞死因子α(TNF-α)，都可影響腫瘤血管形成，此外，在細(xì)菌生長部位的非特異性炎癥反應(yīng)可激活潛在抗腫瘤T細(xì)胞［10］。

Niethammer等［11］發(fā)現(xiàn)以減毒沙門菌SL7207為載體，將flk-1全長cDNA構(gòu)建到真核表達(dá)質(zhì)粒，制成口服疫苗后免疫小鼠Lewis肺腺癌等腫瘤模型，這種口服疫苗能打破免疫耐受，誘導(dǎo)很強(qiáng)的特異性CTL反應(yīng)，從而摧毀腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，既可對小鼠起到免疫保護(hù)作用，同時對移植瘤也具有治療效果，能抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。馮珂珂等［12］將攜帶flk1的重組減毒沙門菌經(jīng)口服免疫，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗flk1的特異性免疫反應(yīng)，且能明顯產(chǎn)生抗腫瘤血管生成作用。

邵月婷等［13］建立裸鼠前列腺癌皮下移植瘤模型，分別將已構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒siRNA-scramble、p53、siRNA-survivin及共表達(dá)質(zhì)粒 p53/siRNA-survivin轉(zhuǎn)化到減毒人傷寒沙門菌Ty21a，制備成對應(yīng)重組減毒沙門菌，通過灌胃及瘤內(nèi)注射到前列腺癌荷瘤裸鼠體內(nèi)，觀察到腫瘤體積明顯縮小，對前列腺癌移植瘤有明顯的靶向性。陳英利等［14］將攜帶Survivin-△3(T34A)基因的減毒鼠傷寒沙門菌口服疫苗用于乳腺瘤MCF-7注射細(xì)胞小鼠并觀察其保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)小鼠口服攜帶Survivin-△3(T34A)真核質(zhì)粒的沙門菌后，能夠抑制MCF-7乳腺瘤細(xì)胞的增殖和擴(kuò)散，而且能夠?qū)π∈笃鸬奖Ｗo(hù)的作用。

Hong等［15］發(fā)現(xiàn)注射減毒沙門菌疫苗提供了新型的抗癌治療途徑，該疫苗誘導(dǎo)具有免疫抑制的骨髓細(xì)胞轉(zhuǎn)化成TNF-α分泌的中性粒細(xì)胞，并減少Treg細(xì)胞的產(chǎn)生，特別是在腫瘤特異性細(xì)胞毒素T淋巴細(xì)胞的表達(dá)中，同時也說明該疫苗誘導(dǎo)了腫瘤微環(huán)境從免疫抑制到免疫原性的改變，減少抑制的阻力，最終產(chǎn)生成功的抗腫瘤應(yīng)答。

2 減毒沙門菌作為腫瘤基因治療載體的研究進(jìn)展

2.1 減毒沙門菌具有抗腫瘤理想基因傳遞載體的特征 減毒的沙門菌仍保持侵入巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞的能力，因此可作為疫苗載體將其攜帶的抗原蛋白或DNA疫苗靶向性的傳遞給抗原遞呈細(xì)胞從而更為有效地激發(fā)免疫應(yīng)答。減毒沙門菌作為疫苗載體不僅具有運(yùn)送效率高，而且免疫方法簡單和效果好，并能同時激發(fā)全身免疫和局部黏膜免疫等優(yōu)點(diǎn)，有著良好的應(yīng)用前景。目前重組減毒沙門菌攜帶的DNA疫苗激發(fā)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫的機(jī)制可能是樹突狀細(xì)胞(DC)吞噬侵入腸黏膜屏障的重組沙門菌后被激活，活化的DC遷移至脾臟等淋巴組織，此時載體菌裂解，DNA疫苗以某種途徑進(jìn)入胞液，然后進(jìn)入抗原遞呈細(xì)胞(APC)細(xì)胞核，表達(dá)目的抗原。進(jìn)而特異的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)被激活，裂解表達(dá)抗原的APC，APC內(nèi)的抗原被釋放激活輔助T細(xì)胞和誘導(dǎo)抗體反應(yīng)，至此細(xì)胞免疫和體液免疫均被激活［16］。此外，載體菌的成分如脂多糖和DNA疫苗上的單鏈免疫刺激序列還可作為佐劑加強(qiáng)免疫應(yīng)答。另一種可能的機(jī)制是重組沙門菌引起吞噬它的APC的凋亡，凋亡產(chǎn)物(可含目的抗原/DNA免疫缺陷)被鄰近的APC吞噬，進(jìn)而激活特異的 CTL［17］。

以減毒沙門菌作為外源DNA的載體，采用重組減毒胞內(nèi)菌運(yùn)送DNA疫苗可以將DNA疫苗直接呈送給APCs，因減毒沙門菌侵入淋巴系統(tǒng)，能更有效地激發(fā)宿主的細(xì)胞免疫應(yīng)答，并同時激活體液免疫，并可獲得對載體菌的免疫等優(yōu)點(diǎn)。用減毒沙門菌作為疫苗載體其他優(yōu)點(diǎn)包括［18-19］:①減毒沙門菌可攜帶原核表達(dá)質(zhì)粒也可以攜帶真核表達(dá)質(zhì)粒;②細(xì)菌易于擴(kuò)增，抗原不需純化，也不需要純化DNA，節(jié)省費(fèi)用;③重組減毒菌疫苗可經(jīng)口服、鼻內(nèi)、直腸免疫等多種途徑，方便高效;④免疫具有持續(xù)性，減毒沙門菌為載體表達(dá)的外源蛋白對宿主具有持續(xù)刺激的作用，不需要反復(fù)加強(qiáng)免疫。

2.2 攜帶細(xì)胞因子治療腫瘤的研究 細(xì)胞因子是一類由活化的免疫細(xì)胞(單核/巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等)或間質(zhì)細(xì)胞(血管內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等)所合成、分泌，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化成熟、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、參與炎癥反應(yīng)、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合和參與腫瘤消長等功能的小分子多肽類活性分子。目前已有多種細(xì)胞因子應(yīng)用于抗腫瘤治療研究，經(jīng)大量動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，IFN、IL-2、TNF、GM-CSF和G-CSF等細(xì)胞因子都能增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤的免疫能力。

江中明等［20］等將攜帶HIV tip30與人IFN-γ基因減毒沙門菌(SL7207)基因口服治療舌癌荷瘤裸鼠，發(fā)現(xiàn)口服重組減毒沙門菌具有體內(nèi)瘤體轉(zhuǎn)基因的能力，而且可使同時攜帶的HIV tip30與人IFN-γ 2個目的基因同時達(dá)到瘤體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，發(fā)揮協(xié)同抗瘤作用，為舌癌的基因治療提供了新的方法。

齊桓等［21］通過電轉(zhuǎn)化法將真核表達(dá)載體pCMVhIL-12、EGFPN1導(dǎo)入減毒鼠傷寒沙門菌SL3261中，經(jīng)由胃管喂給BALB/c和C57BL/6小鼠。小鼠血清中mIL-12含量在相應(yīng)的處理組中均有顯著升高，進(jìn)一步說明減毒沙門菌可將外源基因攜帶入小鼠組織細(xì)胞內(nèi)，并進(jìn)行有效表達(dá)。Jarosz等［22］構(gòu)建攜帶IL-12基因的DNA疫苗口服于接種前后有免疫活性的小鼠，激活的細(xì)胞毒性的T淋巴細(xì)胞特異性的抑制上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞過表達(dá)的Endoglin。疫苗減少腫瘤中微血管密度并降低Treg淋巴細(xì)胞水平，因而有效地抑制腫瘤生長和延長了具有腫瘤細(xì)胞小鼠的存活。Ha等［23］將構(gòu)建成功的攜帶IL-2的減毒沙門菌轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，并予具有肝癌組織的小鼠口服，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該減毒沙門菌有效地轉(zhuǎn)染癌細(xì)胞，IL-2也有效地表達(dá)，與此同時延長了小鼠的存活時間。

Bai等［24］構(gòu)建攜帶生長抑素激素的口服減毒沙門菌疫苗(pGM-CSF/SS)，免疫于 5、7、11周雌鼠，發(fā)現(xiàn)GM-CSF和減毒沙門菌分別作為佐劑和減毒活性載體，通過與生長抑素DNA疫苗結(jié)合有效地口服傳遞并誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和提高雌鼠的重量。此外，該DNA疫苗影響雌激素濃度和求偶期，以及提高雌鼠哺乳期行為。

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是目前所知的促腫瘤血管生成活性最強(qiáng)、特性最高的血管生長因子，與其功能受體VEGF-2構(gòu)成VEGF/VEGFF-2信號傳導(dǎo)通路，如果阻斷該信號通路，可以抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。VEGFR-2在鼠中為 flk-1，陳明清等［25］構(gòu)建減毒沙門菌SL3261為載體的抗腫瘤血管生成口服DNA疫苗pcDNA3．1+/flk-1(nl-7)，發(fā)現(xiàn)該疫苗具有抑制小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的作用。

2.3 攜帶效應(yīng)蛋白治療腫瘤的研究 減毒沙門菌可以有效地傳遞多種效應(yīng)基因并表達(dá)治療性蛋白。Fu等［26］構(gòu)建重組減毒沙門菌作為真核表達(dá)載體攜帶Smac和TRAIL基因(pSNhTS)，并受控于hTERT啟動子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沙門菌介導(dǎo)的外源基因表達(dá)在腫瘤組織中可以持續(xù)14 d，小鼠口服pSNhTS后明顯抑制腫瘤增長的70%～90%并延長小鼠存活時間。pSNhTS所具有的超強(qiáng)抗腫瘤活性主要原因是Smac和TRAIL重組蛋白的相互協(xié)作特性。Jiang等［27］構(gòu)建表達(dá)治療基因ClyA和Rluc8的減毒沙門菌靜脈注射于腫瘤小鼠，該菌定位于腫瘤組織，基因表達(dá)主要依賴啟動子的濃度，說明體外控制細(xì)菌基因表達(dá)的可能性，而且明顯地抑制原位癌和轉(zhuǎn)移癌的生長并延長小鼠壽命。

林勇等［28］成功構(gòu)建含有 pEGFP-C1-PNP質(zhì)粒的減毒鼠傷寒沙門菌SL3261菌株，檢測其在胰腺癌細(xì)胞BxPc-3中正確表達(dá)，表明減毒鼠傷寒沙門菌具有呈遞該基因至胰腺癌細(xì)胞中的能力。王川等［29］將真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-AQP9及干擾質(zhì)粒pshRNA-AQP9成功地電穿孔轉(zhuǎn)化減毒沙門菌株SL7207，為進(jìn)一步研究 AQP對非酒精性脂肪肝(NFLD)的基因治療奠定基礎(chǔ)。

曾曙光等［30］研究攜帶結(jié)核桿菌熱休克蛋白70(mtHSP70)、人單純皰疹病毒－胸苷激酶(HSV-TK)雙基因的重組沙門菌瘤內(nèi)注射抗小鼠黑色素瘤的抑瘤效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)減毒沙門菌攜帶的mtHSP70/HSV-TK雙基因真核共表達(dá)質(zhì)粒瘤內(nèi)注射對B16腫瘤細(xì)胞具有顯著抑制作用。陳麗華等［31］發(fā)現(xiàn)survivin特異性siRNA體外可明顯抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其凋亡，將攜帶survivin siRNA質(zhì)粒減毒沙門菌腹腔注射后可明顯抑制肝癌皮下移植瘤的生長，其機(jī)制可能與細(xì)胞凋亡有關(guān)。

Guan等［32］將攜帶凋亡素(Apoptin)表達(dá)質(zhì)粒的減毒沙門菌轉(zhuǎn)染于喉癌細(xì)胞，該菌減少了細(xì)胞毒性，通過激活Caspase-3明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡，重組菌系統(tǒng)地注射引起腫瘤生長延遲和減少腫瘤微血管密度，因而延長宿主存活，此研究說明重組減毒沙門菌作為Apoptin表達(dá)載體有潛在的抗癌治療作用。

3 展望

減毒沙門菌是一種良好的基因傳遞載體，動物實(shí)驗(yàn)及臨床初期實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了該菌具有一定抗腫瘤作用，然而腫瘤基因治療目前還處于發(fā)展階段，動物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果尚不能在臨床中得到廣泛應(yīng)用。因?yàn)槠淙匀淮嬖谝恍﹩栴}，如沙門菌內(nèi)毒素的致病作用，在血中大量繁殖引發(fā)菌血癥的危險，沙門菌對乏氧組織的靶向定植特異性還不足，以及外源基因插入是否會導(dǎo)致毒力返強(qiáng)、外源基因表達(dá)量是否穩(wěn)定、誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)不足。此外如何提高沙門菌載體轉(zhuǎn)移到人體腫瘤細(xì)胞和組織內(nèi)部，如何有效地減輕人體對重組載體的免疫作用及將基因治療與其他治療方法聯(lián)合應(yīng)用等，都是腫瘤基因治療中需要攻克的難題。

這些關(guān)鍵問題是今后研究主要方向，如何通過提高治療基因的表達(dá)效率，篩選出靶向性更強(qiáng)、安全性更高的減毒沙門菌菌株是減毒沙門菌抗腫瘤治療研究的重中之重。減毒沙門菌載體在腫瘤基因治療上的應(yīng)用目前擁有廣闊發(fā)展前景，其具有運(yùn)送效率高，免疫方法簡單，效果好等特點(diǎn)，必定在腫瘤治療中發(fā)揮舉足輕重的作用。

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