人核呼吸因子2基因真核表達載體的構建與鑒定

張海洋，馮慕華，徐 彤，徐 優(yōu)，余 敏，孫寶迪，3，熊 偉*

（1.大理學院基礎醫(yī)學院，云南大理 671000；2.云南大學生命科學學院，昆明 650031；3.南開大學生命科學學院，天津 300071）

人核呼吸因子2基因真核表達載體的構建與鑒定

張海洋1，馮慕華1，徐 彤1，徐 優(yōu)1，余 敏2，孫寶迪2，3，熊 偉1*

（1.大理學院基礎醫(yī)學院，云南大理 671000；2.云南大學生命科學學院，昆明 650031；3.南開大學生命科學學院，天津 300071）

目的：構建人核呼吸因子2（NRF2-α和NRF2-β）的真核表達載體，并檢測其在瞬時轉染的人肝癌BEL-7402細胞株的表達水平。方法：根據NCBI數據庫中NRF2-α和NRF2-β的基因序列設計引物，通過RT-PCR擴增目的基因并構建帶FLAG標簽的真核表達載體，瞬時轉染BEL-7402細胞后，分別使用半定量RT-PCR技術和Western blot技術檢測其mRNA和蛋白質表達水平。結果：通過酶切鑒定和DNA序列分析，證實已成功構建了人NRF2-α和NRF2-β的真核表達載體，并能在瞬時轉染的人肝癌BEL-7402細胞中實現基因的過表達。結論：成功構建了人NRF2-α和NRF2-β的真核表達載體，為進一步研究其功能奠定了基礎。

核呼吸因子2；人肝癌BEL-7402細胞；真核表達載體

核呼吸因子（Nuclear Respiratory Factors，NRFs）是由核基因編碼，對線粒體呼吸鏈基因的表達具有重要調控作用的轉錄因子，包括核呼吸因子1（NRF-1）和核呼吸因子2（NRF-2）〔1〕。NRF-1最早作為線粒體細胞色素C（cytochrome C）基因的一種轉錄調控因子被發(fā)現。人核呼吸因子1（human Nuclear Respiratory Factor1，hNRF-1）基因定位于7q3.1，含有11個外顯子，其編碼的蛋白具有同源二聚體結構，后又在許多編碼線粒體呼吸鏈蛋白基因啟動子區(qū)發(fā)現其蛋白結合位點。在有氧運動、肌肉收縮、甲狀腺激素、內毒素脂多糖等外界因素作用下，該基因mRNA水平升高，蛋白結合DNA能力加強，從而提高其所調控的靶基因的表達，最終引起線粒體密度的增加，細胞氧化磷酸化水平的提高〔2〕。人核呼吸因子2（human Nuclear Respiratory Factor 2，hNRF-2）是一種在組織中廣泛分布的轉錄因子，能夠專一性識別富含GGAA為核心的序列，且與小鼠GABP蛋白（GA-binding protein）同源。hNRF-2蛋白由5個亞基構成，一個α亞基，兩個β亞基和兩個γ亞基。其中α亞基具有ETS（E twenty-six）結構域即DNA結合區(qū)，由85個氨基酸組成，位于肽鏈羧基末端，是一個經過修飾的螺旋-轉角-螺旋結構域，含有一個色氨酸三聯(lián)體，能結合到靶基因的特定啟動子區(qū)發(fā)揮調節(jié)線粒體呼吸鏈基因表達的作用。β亞基上有富含谷氨酰胺的結構域，通過與α亞基形成二聚體后能加強NRF-2識別DNA并與之結合的能力〔3〕。此外，Vallejo CG等人研究發(fā)現γ亞基可能與NRF-2基因轉錄調節(jié)的組織特異性有關〔4〕。

人類線粒體基因組（Mitochondrial DNA，mtD?NA）和核基因組（Nuclear DNA，nDNA）存在十分密切的聯(lián)系。一方面，核基因產物表達的紊亂與mtD?NA的突變、缺失、異常密切相關；另一方面，mtDNA的正常復制與轉錄需要各種核基因產物〔5〕。人NRF-2具有非常廣泛的調控線粒體相關基因表達的作用，目前已經發(fā)現在線粒體呼吸鏈復合體II、IV、V編碼基因亞基，線粒體轉錄因子A（Mitochon?drial Transcription Factor A，mtTFA∕TFAM）、線粒體轉錄因子B（Mitochondrial Transcription Factor B，mtTFB∕TFBM）等基因中均發(fā)現有NRF-2的結合位點，且具有激活基因表達的功能〔6〕。近年，Bruni F等進一步通過體外和體內實驗證實，在諸多與呼吸鏈表達及調控有關基因上游調控序列中發(fā)現NRF-2蛋白結合位點，這其中包括線粒體轉錄終止因子1（mTERF1）、線粒體轉錄終止因子3（mTERF3）、線粒體單鏈結合蛋白（mtSSB）、解螺旋酶（TWINKLE）、線粒體DNA復制酶γ亞基等〔7〕。

我們通過RT-PCR技術獲得人核呼吸因子2（hNRF2-α and hNRF2-β）基因的開放閱讀框（ORF）序列，構建了帶FLAG標簽的真核表達載體，并通過脂質體轉染人肝癌BEL-7402細胞株后檢測其mRNA和蛋白質表達水平。利用構建的hNRF2基因真核表達載體，為進一步研究hNRF2對呼吸鏈基因和線粒體轉錄調控因子的表達調控機制，以及尋找新的腫瘤基因治療靶點的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1菌株和載體人肝癌BEL-7402細胞株購自中國科學院上海細胞庫；感受態(tài)大腸桿菌Trans-K1購自北京全式金生物技術公司；DNA克隆載體pGEMX-T Easy Vector購于Promega公司；真核表達載體p3XFLAG-CMVTM-14由云南大學生物化學實驗室余敏教授贈送。

1.2主要試劑限制性核酸內切酶、Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶購自Takara公司；Trizol RNA提取試劑盒、Lipofectamine 2000轉染試劑盒購自Invit?rogen公司；QuantScript RT Kit購自Tiangen公司；質粒提取純化試劑盒（Plasmid Extraction Mini Kit）、DNA片段回收試劑盒（DNA Gel Extraction Kit）均購自Omega公司；DNA Marker、Easysee Western Marker購自北京全式金公司；鼠抗Flag一抗和辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠二抗購自Santa Cruz公司；BCA蛋白測定試劑盒、BeyoECL Plus顯色試劑購自上海碧云天生物技術公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自杭州四季青生物公司。

1.3實驗方法

1.3.1 BEL-7402細胞總RNA提取 按Invitrogen公司的Trizol試劑盒說明書采用一步法提取細胞總RNA。BEL-7402細胞中加入1 mL Trizol試劑，室溫放置5 min以使其完全裂解。12 000 r∕min離心5 min，取上清于經焦碳酸二乙酯（DEPC）處理過的1.5 mL EP管中。加入200μL氯仿，充分震蕩15 min后室溫靜置10 min，12 000 r∕min離心15 min，吸取上層水相于另一EP管。加入0.5 mL異丙醇混勻，室溫靜置10 min，12 000 r∕min離心10 min，棄上清，75%乙醇洗滌沉淀2次，室溫干燥10 min后溶于50 μL RNase-free水待用。

1.3.2 PCR引物設計 參照NCBI數據庫中NRF2-α（NM：001197297）和NRF2-β（NM：002041）基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設計引物序列并引入Bgl II和Kpn I酶切位點及保護堿基，同時設計內參基因β-actin的引物，送上海生工生物工程有限公司合成。見表1。

表1 NRF2-α和NRF2-β引物序列

1.3.3 RT-PCR擴增目的基因 按QuantScript RT Kit試劑盒進行，配制反應體系獲得cDNA第一條鏈：總RNA 1μg，M-MLV 1μL，Oligo d（T）15（100 μM）1μL，dNTP（10 mM）4μL，M-MLV 5×buffer 5 μL，25 mmol∕L MgCl210μL，RNasin（50 U）2μL，加DEPC水將反應體系補加到50μL，混勻。25℃5 min，40℃1 h，70℃10 min，合成cDNA第一條鏈。隨后以逆轉錄產物為模板進行PCR擴增NRF2-α和NRF2-β基因，反應條件如下：94℃30 s，60℃30 s，72℃1 min，擴增30個循環(huán)，72℃延伸10 min，產物用1%瓊脂糖凝膠電泳中檢測后回收目的片段。

1.3.4 真核表達載體的構建與鑒定 將RT-PCR擴增所得目的外源片回收純化后進行TA克隆，重組質粒及真核表達載體p3XFLAG-CMV分別用Bgl II和Kpn I進行雙酶切反應?；厥胀庠雌魏筮M行連接反應，連接產物轉化Trans-K1感受態(tài)細胞，挑選單克隆，擴大培養(yǎng)，提取質粒，進行菌落PCR和酶切鑒定，送上海生工生物工程有限公司測序。測序正確后擴大培養(yǎng)，抽提重組質粒DNA待用。

1.3.5 BEL-7402細胞的瞬時轉染 待預先培養(yǎng)的BEL-7402細胞密度達80%～90%，用脂質體Lipo?fectamine 2000介導空質粒和重組質粒轉染細胞。于無菌EP管將10μL脂質體溶于200μL無血清RPMI 1640培養(yǎng)基，混勻后靜置5 min后加入5μg重組質粒，室溫靜置30 min。與此同時除去細胞培養(yǎng)板中的含血清培養(yǎng)基，用不含血清的培養(yǎng)基輕輕潤洗2次后每孔加入1 mL無血清培養(yǎng)基。將之前混合的重組質粒和脂質體的混合物加入孔中，于5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱靜置4～6 h后補加含10%FBS的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48～72 h待用。同時設置未轉染的細胞作為對照組。

1.3.6 半定量RT-PCR檢測瞬時轉染BEL-7402細胞NRF2基因mRNA的表達變化 使用Trizol RNA提取試劑盒抽提瞬時轉染后的BEL-7402細胞總RNA，以未轉染細胞為陰性對照。所得RNA分別按QuantScript RT Kit試劑合成cDNA第一條鏈，利用相關基因引物進行PCR擴增，反應體系如下：模板（cDNA）1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，dNTP1 μL，10×Reaction Buffer 2.5 μL，MgCl2（25 μM）2 μL，Taq酶0.2 μL，ddH2O 16.3 μL。以56℃為退火溫度，20～23個循環(huán)。同時擴增β-actin內參基因作為對照，所得PCR產物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用Gel-pro Analyzer 4.5軟件分析灰度值，分析實驗結果，每個基因均做4次重復實驗。

1.3.7 Western-blot檢測瞬時轉染BEL-7402細胞NRF2蛋白的表達變化 用胰酶分別消化未轉染的BEL-7402細胞和轉染p3XFLAG空質粒、p3XFLAGNRF2-α和p3XFLAG-NRF2-β的BEL-7402細胞，使用Western IP細胞裂解液裂解細胞，將裂解液分別轉移到EP管中，10 000 r∕min離心2 min，取上清于另一EP管中待用。使用BCA蛋白定量試劑盒測量每管總蛋白濃度。配制聚丙烯酰胺凝膠，每泳道上樣約30μg蛋白裂解液，120 V恒壓電泳2 h，采用半干轉膜法將凝膠上的蛋白轉至PVDF膜上。用TBST配制的5%脫脂牛奶封閉PVDF膜2 h，TBST水洗3次，每次10 min，按1：1 000分別加入Flag一抗，4℃孵育過夜后用TBST水洗3次，每次10 min，再按1：5 000分別加入相應的二抗，室溫孵育1～2 h，TBST水洗3次，每次10 min，暗室內用BeyoECL Plus試劑顯色，用X線膠片壓片顯影。

2 結果

2.1 BEL-7402細胞總RNA提取采用Trizol法提取BEL-7402細胞總RNA，紫外分光光度計下檢測OD260∕OD280為1.930，表明RNA純度較好，基本無DNA和蛋白質污染。甲醛-瓊脂糖凝膠電泳結果顯示28 S rRNA和18 S rRNA條帶清晰，亮度比約為2：1，表明提取的細胞總RNA質量良好且沒有降解。見圖1。

圖1 BEL-7402細胞總RNA電泳圖

2.2 RT-PCR擴增產物分析以BEL-7402細胞總RNA為模板進行RT-PCR得到擴增產物，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示NRF2-α cDNA擴增產物在約1.3 kb處有條帶，NRF2-β cDNA擴增產物在約1.1 kb處有條帶，所得片段大小均與預期相符。見圖2。

圖2 RT-PCR擴增NRF2-α和NRF2-β編碼區(qū)的電泳圖

2.3重組真核表達載體的電泳與酶切鑒定RTPCR產物TA克隆后將菌落擴增培養(yǎng)，采用菌落PCR法鑒定出陽性克隆。挑選重組子用Bgl II和Kpn I雙酶切，可得到與預期大小相符的載體片段和外源片段，從凝膠中回收外源片段，克隆到經相同限制性核酸內切酶處理的真核表達載體p3XFLAGCMV?-14中，用氨芐青霉素篩選得到陽性重組質粒，分別命名為p3XFLAG-NRF2-α和p3XFLAGNRF2-β。見圖3A。酶切鑒定結果表明，重組質粒含有與預期大小相近的DNA插入片段，而空載體中無。見圖3B。DNA測序結果證實外源插入片段序列與插入方向均正確。

圖3 NRF2基因真核表達載體的電泳與酶切圖

2.4 Western blot檢測目的蛋白在BEL-7402細胞中的表達以未轉染的BEL-7402細胞為陰性對照，將p3XFLAG-CMV空質粒，p3XFLAG-NRF2-α和p3XFLAG-NRF2-β分別瞬時轉染BEL-7402細胞。半定量RT-PCR結果顯示，各組的β-actin的mRNA表達未受到影響，轉染p3XFLAG-CMV空載體的BEL-7402細胞與未轉染的細胞中NRF2-α和NRF2-β未見差異；轉染重組質粒p3XFLAG-NRF2-α和p3XFLAG-NRF2-β的BEL-7402細胞中NRF2基因mRNA表達水平顯著增加。見圖4A。將各組細胞裂解獲得的總蛋白SDS-PAGE后使用鼠抗Flag一抗進行Western blot分析，結果顯示，各組的β-ac?tin的蛋白質表達未受到影響；未轉染及轉染空質粒的BEL-7402細胞裂解物Western blot檢測結果陰性，無條帶出現。p3XFLAG-NRF2-α和p3XFLAGNRF2-β轉染的BEL-7402細胞裂解物可見FLAG抗體反應陽性條帶，NRF2-α的分子量大小約為65 kDa，NRF2-β蛋白的分子量大小約為60 kDa，均于預期大小相符，表明外源基因在BEL-7402細胞中成功表達目的蛋白質。見圖4B。

圖4 外源NRF2基因mRNA及蛋白水平的表達

3 討論

腫瘤細胞能量代謝特點表現為有氧呼吸顯著下降，糖酵解顯著升高的現象，即著名的Warburg效應〔8〕。起初人們將這一現象理解為由于細胞轉化所帶來的副效應或是源于控制細胞攝取葡萄糖的信號轉導途徑的分子突變，或是源于糖酵解途徑基因的突變〔9〕。但是隨著研究的深入，人們發(fā)現腫瘤細胞的呼吸障礙與線粒體結構與功能的異常密切相關〔10〕。腫瘤呼吸障礙似乎不是葡萄糖攝取信號通路抑或糖酵解途徑的增強突變所致，而更像是由于有氧呼吸的線粒體基因、結構、功能的缺失或異常所致。對腫瘤細胞呼吸鏈以及其氧化磷酸化水平的研究證實了這點。由此可知，線粒體基因的缺失、基因水平的下調、呼吸鏈蛋白的異常才是腫瘤細胞呼吸障礙的更本質的原因所在。

Krieg RC等人發(fā)現，在腫瘤細胞中核編碼呼吸鏈關鍵酶COX與線粒體編碼的COX比例顯著增高，其中核呼吸因子是調控核基因和線粒體基因的樞紐，對細胞內復雜的能量代謝作出全面的調控〔11〕。這一研究將腫瘤細胞呼吸障礙的原因向著核基因調控的方向推進了一步。關于腫瘤細胞呼吸障礙本質的研究，目前更多地聚焦于核基因組編碼基因對呼吸鏈蛋白及線粒體DNA調控這一層次，且一直是近年來國內外學者追蹤的熱點。線粒體氧化磷酸化生成ATP是正常機體代謝的主要能量來源，而由于線粒體呼吸鏈編碼基因的損傷導致線粒體氧化磷酸化功能障礙，可引起一系列線粒體相關性疾病，如腫瘤、線粒體肌病、線粒體腦肌病、阿爾茨海默病、帕金森癥、Kearns Sayre綜合征等的發(fā)生〔12〕。對參與調節(jié)線粒體呼吸鏈編碼基因表達的NRF2的深入研究，將有助于開拓線粒體相關疾病基因診斷和基因治療的新思路。

在本研究中，我們使用的p3XFLAG-CMV是一個典型的真核表達載體，能在哺乳動物細胞中高效表達外源基因，從而實現目的基因的過表達。FLAG標記物是專為標記目的蛋白設計的多肽標記物，其特點是標記物的序列不是來自任何已知的蛋白質。該標記物是由8個氨基酸組成的多肽，具有親水性，可置于蛋白的氨基或羧基末端，且有商品化的抗體可識別FLAG標記物，方便進行外源蛋白的檢測。我們將成功構建的人核呼吸因子2的真核表達載體p3XFLAG-NRF2-α和p3XFLAG-NRF2-β，分別經脂質體轉染入人肝癌BEL-7402細胞中，在mRNA和蛋白水平對hNRF2-α和hNRF2-β基因的表達均有顯著增加，且不影響β-actin內參基因的表達。本研究將為我們下一步探索hNRF2基因對人類腫瘤細胞線粒體基因表達的調控機制及其在腫瘤細胞內的其它生理功能奠定了較好的研究基礎。

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*通信作者：熊偉，講師，博士.

（責任編輯 李 楊）

Construction and Identification of Eukaryotic Expression Vector of Human Nuclear Respiratory Factor 2

ZHANG Haiyang1,FENG Muhua1,XU Tong1,XU You1,YU Min2,SUN Baodi2,3,XIONG Wei1*
（1.Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000，China;2.School of Life Sciences,Yunnan University,Kunming 650031，China;3.School of Life Sciences,Nankai University,Tianjin 300071，China）

Objective:To construct eukaryotic expression vectors with FLAG epitope highly expressed human NRF2-α and NRF2-β gene,and detect the expression levels of NRF2 in transient transfected human BEL-7402 cells.Methods:RT-PCR technique was used to amplify the cDNA of NRF2-α and NRF2-β gene from total RNA isolated from BEL-7402 cells.After nucleotide sequencing, the open reading frames（ORF）of NRF2-α and NRF2-β cDNA was respectively cloned into eukaryotic expression vector p3XFLAGCMV?-14 to form the recombinant plasmid named as p3XFLAG-NRF2-α and p3XFLAG-NRF2-β.Lipofectamine 2000 was used to transient transfect eukaryotic expression vectors into BEL-7402 cells.Finally,semi-quantity RT-PCR and western blot were applied to detect mRNA and protein expression levels of human NRF2-α and NRF2-β in BEL-7402 cells.Results:We successfully constructed the eukaryotic expression vectors of NRF2-α and NRF2-β.The results of restriction enzyme digestion and nucleotide sequencing confirmed that the recombinant plasmid was correct.By western blotting,we found that the human NRF2-α and NRF2-β proteins were expressed in BEL-7402 cells.Conclusion:The recombinant eukaryotic expression vector of human NRF2-α and NRF2-β were successfully established,which laid foundation for further study of NRF2 gene and its function.

nuclear respiratory factor 2;human hepatoma BEL-7402 cells;eukaryotic expression vector

R730.23

A

1672-2345（2014）02-0037-06

10.3969∕j.issn.1672-2345.2014.02.011

大理學院博士科研啟動基金資助項目（BSKY2012018）；大理學院大學生科研基金資助項目（KYSX2013118）

2013-11-27

張海洋，醫(yī)學檢驗專業(yè)2011級本科生.