馬鈴薯體細(xì)胞雜種后代青枯病抗性鑒定及分子標(biāo)記檢測(cè)

李朋，蔡興奎，陳琳，柳俊

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家蔬菜改良中心華中分中心，湖北武漢430070)

遺傳育種

馬鈴薯體細(xì)胞雜種后代青枯病抗性鑒定及分子標(biāo)記檢測(cè)

李朋，蔡興奎，陳琳，柳俊*

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家蔬菜改良中心華中分中心，湖北武漢430070)

馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)青枯病是由茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一種毀滅性的細(xì)菌性土傳病害。馬鈴薯青枯病抗性資源主要存在于一些野生種中，體細(xì)胞雜交是創(chuàng)制馬鈴薯青枯病抗性資源的一種有效途徑。本研究以具有對(duì)青枯病抗性的體細(xì)胞雜種與栽培種雜交產(chǎn)生的100個(gè)后代為材料，對(duì)其進(jìn)行青枯病抗性評(píng)價(jià)，旨在篩選可供育種利用的青枯病抗性資源。青枯病抗性鑒定結(jié)果表明，在試管苗組培鑒定中100個(gè)雜交后代共有6個(gè)基因型表型抗青枯病，溫室缽栽接種鑒定有8個(gè)基因型表現(xiàn)為抗病，在兩種接種鑒定中均表現(xiàn)為抗病的有3個(gè)基因型(07SF.3-79、07SF.6-8和07SF.6-5)。選用本實(shí)驗(yàn)室前期篩選的與青枯病抗性相關(guān)的4對(duì)SSR標(biāo)記引物（STI0051、STI0054、STI0056、STI0057），對(duì)100個(gè)基因型進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)，結(jié)果顯示，有3個(gè)標(biāo)記（STI0051.180、STI0054.180、STI0056.205）可以明確鑒定抗感基因型，它們表現(xiàn)為抗病穩(wěn)定的3個(gè)基因型的標(biāo)記位點(diǎn)與抗病對(duì)照的帶型一致，而在感病對(duì)照中缺失，與表型鑒定結(jié)果吻合，表明篩選的SSR標(biāo)記可以用于具有S.chacoense遺傳背景材料的青枯病抗性輔助選擇。

馬鈴薯；體細(xì)胞雜種；青枯?。豢剐澡b定；分子標(biāo)記

馬鈴薯（SolanumtuberosumL.）青枯病是由茄科雷爾氏菌（Ralstoniasolanacearum）引起的細(xì)菌性病害，由于細(xì)菌性病害的系統(tǒng)感染特性，導(dǎo)致其藥物防治十分困難[1]。而且，馬鈴薯栽培種又缺乏抗性資源，因此導(dǎo)致馬鈴薯青枯病抗病育種十分困難。20世紀(jì)30～60年代期間，美國(guó)測(cè)試了普通栽培種的上萬(wàn)份品種和無(wú)性系，并未發(fā)現(xiàn)高抗青枯病的品種，只有少部分材料發(fā)病期比感病對(duì)照稍晚[2]。中國(guó)的研究人員也曾鑒定了育種單位選育的品種、高代無(wú)性系栽培種資源等400多份，結(jié)果顯示幾乎所有材料都表現(xiàn)中感或高感青枯病。因此，利用體細(xì)胞雜交獲得攜帶野生種的青枯病抗性的種質(zhì)資源是目前創(chuàng)制青枯病抗性資源的主要途徑。20世紀(jì)末至21世紀(jì)初，國(guó)內(nèi)外研究人員利用具有青枯病抗性的野生種與馬鈴薯栽培種進(jìn)行體細(xì)胞雜交，獲得了大批具有青枯病抗性的體細(xì)胞雜種。Laferriere等[3]利用野生種S.commersonii與栽培種雙單倍體融合，再生的雜種植株其抗性水平顯著高于感病對(duì)照品種‘Atlantic’和‘Superior’。Fock等[4]利用原始栽培種S.phureja與栽培種雙單倍體進(jìn)行融合，再生的體細(xì)胞雜種及其親本植株進(jìn)行室內(nèi)青枯菌接種鑒定，結(jié)果表明，體細(xì)胞雜種植株對(duì)青枯菌生理小種1號(hào)和3號(hào)菌株均具有明顯的抗性，其中雜種株系BP9的抗性水平顯著高于抗性親本S.phureja。他們又利用S.stenotomum與栽培種融合也得到了類似的結(jié)果[5]。本實(shí)驗(yàn)室蔡興奎等[6]利用來(lái)自S.chacoense的一個(gè)抗青枯病的無(wú)性系與栽培種進(jìn)行體細(xì)胞雜交，也獲得了一批抗青枯病的體細(xì)胞雜種。然而，由于一些野生不良性狀的累贅，這些雜種還不能直接用于育種。在前期的研究中，郭鮮蒲[7]利用一個(gè)抗青枯病且可以正常開(kāi)花的體細(xì)胞雜種3c28-1為親本，與栽培品種進(jìn)行雜交成功并獲得雜種后代，但這些雜種后代是否仍然具有青枯病抗性還不清楚。本研究對(duì)這些雜種后代進(jìn)行了系統(tǒng)的青枯病抗性評(píng)價(jià)，以期篩選出可用于青枯病抗性育種的親本材料。

1 材料與方法

1.1 材料

2007和2008年，3c28-1、3c35-3以及8c6-2與7個(gè)馬鈴薯四倍體栽培種優(yōu)良品系進(jìn)行有性雜交。3c28-1、3c35-3選自S.chacoense和3#的體細(xì)胞雜種后代，8c6-2選自S.chacoense和8#的體細(xì)胞雜種后代，它們均具有對(duì)青枯病的抗性，3#和8#是馬鈴薯品種‘中薯2號(hào)’經(jīng)授粉誘導(dǎo)孤雌生殖產(chǎn)生的雙單倍體。實(shí)生種子在無(wú)菌條件下發(fā)芽獲得試管苗，獲得8個(gè)組合的后代共100個(gè)基因型，雜交組合及后代數(shù)量列于表1。

1.2 方法

1.2.1 試管苗組培條件下接種鑒定

青枯菌選用生理小種1號(hào)、生理小種3號(hào)。青枯菌培養(yǎng)基配制方法按照本實(shí)驗(yàn)室青枯病菌培養(yǎng)操作指南進(jìn)行（實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部資料未發(fā)表），涂皿后在37℃條件下培養(yǎng)48 h，用無(wú)菌水沖洗下菌株，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)菌液濃度，稀釋至0.1 OD，即1×108個(gè)/mL的濃度用于接種。

表1 雜交組合及后代數(shù)Table 1Cross combinations and progenies

每個(gè)基因型按照馬鈴薯切段培養(yǎng)方法每盒接入9個(gè)節(jié)段，在每天光照16 h、溫度20℃的條件下培養(yǎng)3周，選用生長(zhǎng)一致的試管苗4盒用于青枯病接種。接種使用手術(shù)刀片劃“#”傷根后3盒注入菌液5 mL，1盒注入等量無(wú)菌水作為對(duì)照。置于25± 1℃，光照16 h/d的培養(yǎng)室培養(yǎng)。接種后每天觀察發(fā)病情況，以抗病和感病對(duì)照差異最大（15 d左右）的時(shí)間點(diǎn)作為記錄發(fā)病表型判別的記錄時(shí)間。

1.2.2 試驗(yàn)材料的缽栽接種鑒定

選取生長(zhǎng)狀況良好的植株栽種于營(yíng)養(yǎng)缽中，每個(gè)基因型栽種4缽，25℃溫室培養(yǎng)3周，3缽使用手術(shù)刀片傷根后加入10 mL稀釋后的菌液，1缽傷根后加入10 mL蒸餾水作為對(duì)照，白天氣溫控制在28℃左右，晚上保持在20℃以上，接種后每天觀察發(fā)病情況。當(dāng)抗病對(duì)照與感病對(duì)照出現(xiàn)差異時(shí)開(kāi)始統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)方法及抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)同室內(nèi)接種鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 青枯病抗性評(píng)價(jià)

青枯病抗性評(píng)價(jià)參照本實(shí)驗(yàn)室前期建立的方法進(jìn)行，根據(jù)發(fā)病情況分為0～4級(jí)：

0級(jí)為無(wú)葉片萎蔫；

1級(jí)為＜25%葉片萎蔫；

2級(jí)為25%～50%葉片萎蔫；

3級(jí)為50%～75%葉片萎蔫；

4級(jí)為75%以上葉片萎蔫。

基因型抗（感）病確定：

0.0～1.0為抗病（R）；

1.0～2.0為中抗（MR）；

2.0～3.0為中感（MS）；

3.0～4.0為感?。⊿）。

基因型病情指數(shù)計(jì)算：

病情指數(shù)=Σ（每個(gè)病級(jí)的植株數(shù)×級(jí)別數(shù)）/總植株數(shù)×最高級(jí)別數(shù)。

1.2.4 分子標(biāo)記檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)采用前期實(shí)驗(yàn)室已篩選的與青枯病抗性相關(guān)SSR標(biāo)記引物4對(duì)[7]，引物信息與擴(kuò)增條件見(jiàn)表2。

DNA的抽提、PCR擴(kuò)增、PAGE膠檢測(cè)等按照本實(shí)驗(yàn)室分子操作指南進(jìn)行。

表2 研究涉及的SSR引物信息Table 2SSR primers used in experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 體細(xì)胞雜種與栽培種雜交后代的青枯病抗性評(píng)價(jià)

2.1.1 組織培養(yǎng)條件下試管苗接種鑒定

接種采用前述的傷根法進(jìn)行。對(duì)照基因型為體細(xì)胞雜種親本、體細(xì)胞雜種融合親本以及四倍體雜交親本共13個(gè)，其中體細(xì)胞雜種親本3c28-1、3c35-3、8c6-2以及野生種融合親本S.chacoence（cha）為抗病對(duì)照，395049.62、51-5、59-5-86、44-4、22-2、393160-4、03HE66-2以及體細(xì)胞融合親本3#和8#為感病對(duì)照。以抗病對(duì)

照與感病對(duì)照表現(xiàn)出最大差異時(shí)的發(fā)病情況作為評(píng)價(jià)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行群體材料的抗病表型評(píng)價(jià)，試驗(yàn)結(jié)果分析以三次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)。

表3 體細(xì)胞雜種融合親本，抗青枯病體細(xì)胞雜種及其與四倍體馬鈴薯品系雜交后代的青枯病抗性評(píng)價(jià)Table 3Evaluation for resistance toR.solanacearumof somatic hybrid parents,resistant somatic hybrids and progenies derived from crosses between resistant somatic hybrids and tetraploid potato breeding lines

續(xù)表3

接種青枯病菌后觀察顯示，接種7 d后抗病對(duì)照與感病對(duì)照就開(kāi)始出現(xiàn)表型的分化，感病材料出現(xiàn)下部葉片萎蔫，14 d后莖稈開(kāi)始變黃脫水甚至整個(gè)植株死亡，而抗病對(duì)照萎蔫脫水現(xiàn)象都不明顯。從表3可以看出，9個(gè)感病對(duì)照在本研究接種條件下均表現(xiàn)為感病，其中以融合親本8#感病最嚴(yán)重，病情指數(shù)達(dá)到1。4個(gè)抗病對(duì)照均表現(xiàn)為抗病。來(lái)自8個(gè)組合的100個(gè)后代基因型的接種表型顯示，只有6個(gè)基因型表現(xiàn)出抗病，其中07SF.3-79和07SF.6-8表型為抗?。≧），07SF.6-5、07SF.13-29、07SF.13-40和07SF.3-75表現(xiàn)為中抗（MR），其余94個(gè)基因型均表現(xiàn)感?。ū?）。

2.1.2 溫室條件下缽載接種鑒定

體細(xì)胞雜種缽栽后，7～8葉時(shí)進(jìn)行青枯病接種。接種青枯病菌后每天觀察發(fā)病情況，接種4 d后抗病對(duì)照與感病對(duì)照就開(kāi)始出現(xiàn)表型的分化，感病基因型出現(xiàn)下部葉片萎蔫，植株有倒伏趨勢(shì)，7 d后植株開(kāi)始變黃脫水萎蔫甚至整個(gè)植株死亡倒伏，而抗病對(duì)照萎蔫脫水現(xiàn)象并不明顯。從表3可以看出，9個(gè)感病對(duì)照在本研究中均表現(xiàn)為感病，4個(gè)抗病對(duì)照表現(xiàn)為抗病或中抗，其中野生種融合親本S.chacoence（cha）抗病性最強(qiáng)。雜種后代鑒定結(jié)果顯示，92個(gè)基因型表現(xiàn)為感病，只有8個(gè)基因型表現(xiàn)為抗病，它們是：表現(xiàn)抗病的07SF.3-76、07SF.3-79、07SF.6-5、07SF.6-8和07SF.3-9；表現(xiàn)中抗的07SF.1-55、07SF.2-47和07SF.6-6。

2.2 青枯病抗性分子標(biāo)記檢測(cè)

研究選用實(shí)驗(yàn)室前期篩選的與青枯病抗性相關(guān)的4對(duì)SSR引物（STI0051、STI0054、STI0056和STI0057），對(duì)100個(gè)雜交后代及抗感親本和對(duì)照進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，其中STI0051有1個(gè)符合參考文獻(xiàn)給定的分子量范圍的目標(biāo)帶，根據(jù)相對(duì)分子量命名該標(biāo)記為STI0051.180；STI0054、STI0056和STI0057均有2個(gè)符合分子量大小的目標(biāo)帶，根據(jù)相對(duì)分子量分別為STI0054.188、STI0054.180、STI0056.173、STI0056.205、STI0057.173、STI0057.180，即4對(duì)引物共產(chǎn)生7個(gè)標(biāo)記。根據(jù)7個(gè)標(biāo)記在所有基因型中的擴(kuò)增結(jié)果分析顯示，100個(gè)雜種基因型共擴(kuò)增有316個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，平均每個(gè)基因型3.16個(gè)。進(jìn)一步分析顯示，標(biāo)記在基因型間的分布不均勻，有超過(guò)一半的基因型（57個(gè)）標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)在2～4個(gè)之間，其余43個(gè)基因型中，有13個(gè)基因型標(biāo)記數(shù)最少（3個(gè)基因型未擴(kuò)增出標(biāo)記帶，10個(gè)基因型只有一個(gè)標(biāo)記帶）。在20個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)較多的基因型中，攜帶有全部7個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)的基因型有2個(gè)（07SF.6-13、07SF.6-15），攜帶6個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)的基因型有4個(gè)（07SF.1-43、07SF.4-17、07SF.4-29、07SF.13-26），另有14個(gè)基因型攜帶有5個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)。

表43 個(gè)SSR標(biāo)記在抗感基因型中的帶型特征Table 4Band data of three SSR markers in resistant and susceptible genotypes

攜帶標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)與抗病表型相關(guān)性分析顯示，二者之間并沒(méi)有顯著相關(guān)性。單個(gè)標(biāo)記與抗青枯病相關(guān)分析也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著相關(guān)的標(biāo)記。但將表現(xiàn)抗病穩(wěn)定的3個(gè)基因型的標(biāo)記位點(diǎn)與抗感基因型標(biāo)記特征分析發(fā)現(xiàn)，有3個(gè)標(biāo)記在3個(gè)抗病基因型中的帶型與抗病對(duì)照一致，而與感病對(duì)照相反。標(biāo)記STI0051.180，在抗病基因型中表型為有帶，在感病基因型中表現(xiàn)為無(wú)帶，3個(gè)雜種基因型均表現(xiàn)有帶。STI0054.180和STI0056.205在抗病基因型中均表現(xiàn)無(wú)帶，除STI0054.180在感病基因型22-2中也表現(xiàn)無(wú)帶外，在其它感病基因型中均表現(xiàn)有帶，3個(gè)抗病雜種基因型均表現(xiàn)無(wú)帶（表4）。

3 討論

本研究同時(shí)采用試管苗組培條件下接種和溫室缽栽傷根接種方法鑒定了100個(gè)體細(xì)胞雜種與栽培種的雜交后代基因型的青枯病抗性。從整體看，體細(xì)胞雜種后代大部分基因型為感病基因型，兩種鑒定方法共有11個(gè)基因型表現(xiàn)出不同程度的抗病性，其中，組培條件下鑒定有6個(gè)基因型表現(xiàn)不同程度的抗病性，缽栽傷根接種有8個(gè)基因型表現(xiàn)為抗病，兩種鑒定方法均表現(xiàn)為抗病的只有3個(gè)基因型（07SF.3-79、07SF.6-8和07SF.6-5）。進(jìn)一步分析其余8個(gè)基因型的鑒定的結(jié)果顯示，其中有4個(gè)基因型均為中抗或者中感的差異，如07SF.1-55和07SF.6-6在組培條件下鑒定表現(xiàn)為MS，在溫室條件下表現(xiàn)為MR；07SF.3-75和07SF.13-40在組培條件下鑒定表現(xiàn)為MR，在溫室條件下表現(xiàn)為MS。另外4個(gè)基因型則至少在一個(gè)鑒定條件中表現(xiàn)為中抗或者中感，但在另一個(gè)條件下鑒定則偏向?yàn)榭够蛘吒?，?7SF.3-9和07SF.3-76，在組培條件下鑒定表現(xiàn)為MS，但在溫室條件下表現(xiàn)為R；07SF.2-47在組培條件下鑒定表現(xiàn)為S，在溫室條件下表現(xiàn)為MR；07SF.13-29在組培條件下鑒定表現(xiàn)為MR，在溫室條件下表現(xiàn)為S。上述結(jié)果表明，當(dāng)抗性級(jí)別較高時(shí)，無(wú)論采用何種方法鑒定，其表型相對(duì)穩(wěn)定，而處于中抗和中感水平時(shí)，其鑒定方法對(duì)表型影響較大。盡管如此，但從整體看，兩種接種方法的結(jié)果表型基本一致，因?yàn)檎伎倲?shù)89%的感病基因型在兩種條件下的表型是基本一致的（表3）。

從本研究中還可以看出，盡管由于雜交的困難，每個(gè)組合獲得的后代數(shù)較少，但進(jìn)一步分析顯示，雜交后代抗病性基因型在組合間存在差異。本研究中至少在一種條件下表現(xiàn)抗病的11個(gè)基因型來(lái)自5個(gè)組合，且抗病親本均為抗病性中等的體細(xì)胞雜種3c28-1；抗病親本為體細(xì)胞雜種8c6-2的組合，后代均表現(xiàn)感病。這一結(jié)果表明，雖然都是抗病體細(xì)胞雜種，但這種抗性傳遞給后代的能力存在差異，造成這種差異的原因可能與不同體細(xì)胞雜種的染色體整合程度、位置等有關(guān)，但目前還缺少這一領(lǐng)域的深入研究。

以表型為評(píng)價(jià)依據(jù)的病害接種鑒定具有直觀、試驗(yàn)無(wú)需特殊復(fù)雜操作等優(yōu)點(diǎn)，但由于受環(huán)境控制難以完全一致的限制，會(huì)產(chǎn)生重復(fù)間結(jié)果不一致而影響判別。分子標(biāo)記反應(yīng)的是植物本身的遺傳基礎(chǔ)，采用分子標(biāo)記輔助進(jìn)行病害鑒定是未來(lái)抗病育種的方向。本研究利用前期篩選的4個(gè)與青枯病抗性相關(guān)的標(biāo)記，對(duì)體細(xì)胞雜種與栽培種雜交產(chǎn)生的100個(gè)后代進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示在3個(gè)抗性穩(wěn)定的基因型中，其帶型顯示與抗病對(duì)照和抗病親本一致，而與感病對(duì)照和感病親本相反。這一結(jié)果表明，利用分子標(biāo)記輔助鑒定抗病性是可能的。

[1]何禮遠(yuǎn),康耀衛(wèi).植物青枯菌(Pseudomonas solanacearum)致病機(jī)理[J].自然科學(xué)進(jìn)展,1995,5:7-15.

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Evaluation of Resistance and Associated Molecular Markers of Bacterial Wilt
of Potato Somatic Hybrid Offspring

LI Peng,CAI Xingkui,CHEN Lin,LIU Jun＊
(College of Life Sciences and Technology,Huazhong Agricultural University,Key Laboratory of Horticultural Plant Biology
(Huazhong Agricultural University),Ministry of Education,National Center for Vegetable Improvement
(Central China),Wuhan,Hubei 430070,China)

Ralstonia solanacearum,the causal pathogen of potato(Solanum tuberosum L.)bacterial wilt,is soil-borne and destructive for potato production.Somatic hybridization between S.tuberosum and wild relatives is an effective way to obtain germplasm possessing resistance to R.solanacearum.Evaluation of resistance to R.solanacearum on 100 progenies derived fromsomatichybridizationbetweenS.tuberosumandwildrelativeswereconductedinthisstudytoscreenforgermplasmsthat possessresistancetoR.solanacearumandarerelevanttobreeding.Theresultsshowedthatsixclonesexhibitedresistanceto the pathogen in vitro inoculation and eight clones performed resistance to the pathogen by the inoculation with greenhouse grownplantsamongthe100progenies.Noticeably,threeresistantclones(07SF.3-79,07SF.6-8and07SF.6-5)wereconsistent for resistance level in the two tests.Four SSRs(STI0051,STI0054,STI0056 and STI0057)previously identified were used to test all of the 100 clones mentioned above.The results demonstrated that three markers(STI0051.180,STI0054.180 and STI0056.205)could differentiate resistant genotype from susceptible ones.The three clones considered resistant in the two inoculations amplified the same bands as resistant control while they were absent in susceptible control.These were inaccordancewiththediseasephenotypingandsuggestanapplicationpotentialoftheseSSRsinmarker-assistantselectionof bacterialwiltresistanceintrogressedfromS.chacoense.

Solanum tuberosum;somatic hybrid;bacterial wilt;resistance evaluation;molecular marker

S532

A

1672－3635（2014）06-0321-07

2014-07-07

教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（IRT13065）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-10-P06）。

李朋（1989-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)轳R鈴薯生物技術(shù)育種。

柳俊，教授，研究方向?yàn)轳R鈴薯生物技術(shù)育種，E-mail:liujun@mail.hzau.edu.cn。