藥用植物細胞懸浮培養(yǎng)產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的研究進展*

劉 群，李天祥，李慶和，張伯禮

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

·綜述·

藥用植物細胞懸浮培養(yǎng)產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的研究進展*

劉 群，李天祥，李慶和，張伯禮

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

細胞懸浮培養(yǎng)；次生代謝產(chǎn)物；研究進展

自20世紀50年代至今，植物細胞培養(yǎng)技術(shù)取得了重大的發(fā)展。目前被研究的植物有1 000多種，獲得天然活性產(chǎn)物達500多種[1]。細胞懸浮培養(yǎng)是植物細胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展，中國已建立了人參、西洋參、紫草等藥用植物細胞懸浮培養(yǎng)體系，有效成分含量已達到或超過原植株[2]。

1 影響次生代謝產(chǎn)物積累的培養(yǎng)條件

1.1 愈傷組織及其接種量 生長力旺盛、表面顆粒突起、質(zhì)地疏松、淡黃色的胚性愈傷組織是建立細胞懸浮系和提高次生代謝產(chǎn)物積累量的基礎(chǔ)[3]。

懸浮細胞的生長具有群聚效應(yīng)，細胞密度低，生長緩慢；細胞密度高，生長迅速，液泡變大，易積累有害物質(zhì)，不利于懸浮細胞系的建立[4]。一般藥用植物細胞懸浮培養(yǎng)的接種量在20.0～100.0 g/L。接種量的大小不僅影響細胞的生長量，也影響次生代謝的積累。王關(guān)林等[5]發(fā)現(xiàn)，在同一培養(yǎng)天數(shù)不同接種量的梔子懸浮細胞的收獲量不同，而且在指數(shù)后期和靜止期多糖含量顯著下降。

1.2 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基中的碳源、氮源、維生素、氨基酸以及植物生長激素等組成成分也影響了植物細胞的生長和代謝。

1.2.1 碳源 在藥用植物細胞懸浮培養(yǎng)過程中最常用為蔗糖，濃度為2%～5%。提高藥用植物細胞生長的碳源濃度，并不一定相應(yīng)促進其次生代謝產(chǎn)物的積累。郭肖紅等[6]發(fā)現(xiàn)，30 g/L蔗糖可使丹參不定根增殖倍數(shù)最高，60 g/L蔗糖最適合丹參酮ⅡA合成，低質(zhì)量濃度蔗糖更利于原兒茶醛合成。

不同種類的碳源對植物細胞代謝有不同的影響。彭昕等[7]研究三葉青細胞懸浮培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)以5%麥芽糖為碳源時細胞增殖倍數(shù)最高；以5%蔗糖為碳源時總黃酮含量最高。因此，應(yīng)根據(jù)不同研究目的來篩選碳源的種類和濃度。

1.2.2 氮源 一般情況下，硝態(tài)氮水平高利于細胞增殖和胚性愈傷組織的誘導(dǎo)，銨態(tài)氮水平高促進組織的器官分化和體細胞胚胎形成[8]。高艷麗等[9]發(fā)現(xiàn)，硝態(tài)氮和銨態(tài)氮比例為5∶1時，甘草細胞獲最大生物量，以銨態(tài)氮為氮源，黃酮類含量最高。

1.2.3 植物生長激素 生長素與細胞分裂素比值適中時,促進愈傷組織生長[10]。激素種類和配比對植物細胞的生長和次生代謝產(chǎn)物的積累有著顯著的影響。Zhao J等[11]在玫瑰紅細胞懸浮培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，吲哚-3-乙酸（IAA）與激動素（KT）或6-芐胺基腺嘌呤（6-BA）的組合更利于提高生物堿含量。李蕤等[12]研究發(fā)現(xiàn)當6-芐胺基腺嘌呤（6-BA）與吲哚-3-乙酸（IAA）為1.0∶0.4時細胞收獲量最大。

1.3 物理因素的培養(yǎng)條件 在懸浮培養(yǎng)過程中，光照、溫度、pH值、搖床轉(zhuǎn)速、細胞生長周期等也不容忽視。

1.3.1 光照 光照通過光合作用和光形態(tài)建成這兩種途徑影響黃酮類、蒽醌類等次生代謝物的積累[13]。一般所需光強在1 000～2 000 lx，光照時間為每天14 h。光照強度的大小和光質(zhì)應(yīng)根據(jù)不同植物和研究目的來選擇。李春斌等[14]發(fā)現(xiàn)，在2 000 lx光強范圍內(nèi)，銀杏細胞增長隨光強的加大而增強，光強大于2 000 lx時，有下降趨勢，但培養(yǎng)物中黃酮的含量卻隨光強的增加而增加。另外，紅光最利于銀杏細胞的生長，但黃酮含量最低，藍光下細胞生長最慢，白光下細胞的生物量和黃酮含量居中。

1.3.2 pH值 目前研究認為pH值影響培養(yǎng)細胞的質(zhì)膜透性、細胞呼吸代謝及胞內(nèi)離子競爭等[15]。細胞懸浮培養(yǎng)所需pH值為5.5～6.0。不同的pH值對細胞內(nèi)不同有效物質(zhì)的積累影響是不一樣的，王娟等[13]研究發(fā)現(xiàn)較低的pH值有利于人參皂苷Rb1的合成，較高的pH值有利于西洋參多糖的合成。

1.3.3 溫度 溫度過高或過低都不利于植物細胞的生長和次生代謝產(chǎn)物的積累。在研究主要因素對菘藍下胚軸細胞懸浮培養(yǎng)影響的過程中，發(fā)現(xiàn)溫度的影響最大，20℃為最適溫度[16]。

1.3.4 搖床轉(zhuǎn)速 搖床轉(zhuǎn)速對細胞生長也有一定的影響。研究發(fā)現(xiàn)[17]，長春花愈傷組織細胞120 r/min轉(zhuǎn)速下20 d后的平均值鮮重最大。

1.4 細胞培養(yǎng)周期 藥用植物細胞的培養(yǎng)生長周期呈“S”型曲線，培養(yǎng)周期一般為14～20 d[18]。次生代謝產(chǎn)物的合成量也會隨細胞不同生長期而改變，一般是同步的，華萍等[19]發(fā)現(xiàn)茶葉細胞生長和茶氨酸積累高峰期在第19天～第22天出現(xiàn)，以培養(yǎng)19～22d為宜。

2 提高次生代謝產(chǎn)物積累的方法

2.1 誘導(dǎo)子的加入 誘導(dǎo)子為能引起植物胞內(nèi)代謝趨向于向次生代謝產(chǎn)物合成方向轉(zhuǎn)變的脅迫因子[20]。一種誘導(dǎo)子的添加不一定對同一種植物的多種次生代謝產(chǎn)物的積累都起到促進作用。研究顯示[21]，茉莉酸甲酯的添加對葡萄的總酚和白藜蘆醇的含量的提高都有促進作用，但對花青素的含量有抑制作用。趙微等[22]發(fā)現(xiàn)高溫和低溫均顯著促進了白樺總?cè)频暮铣珊捅┑姆e累。

2.2 前體化合物的加入 在細胞懸浮培養(yǎng)中加入次生代謝產(chǎn)物的前體化合物對提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量是非常有效的[23]。加入前體物質(zhì)異戊二烯、牻牛兒醇對銀杏懸浮細胞的生長及銀杏內(nèi)酯B的積累均有一定的促進作用[24]。

2.3 培養(yǎng)方法的改進 在植物細胞培養(yǎng)過程中，還可以建立有效的培養(yǎng)方法來獲得高產(chǎn)量有效物質(zhì)。

2.3.1 發(fā)狀根培養(yǎng) 發(fā)狀根是植物受到發(fā)根農(nóng)桿菌的侵染時產(chǎn)生的呈發(fā)狀分支的不定根[25]。發(fā)狀根生長迅速，產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物的含量高[26]。研究表明[27]，發(fā)狀根中的總生物堿含量高于長春花的原植株和愈傷組織。發(fā)狀根培養(yǎng)具有生長迅速、激素自養(yǎng)、次生代謝產(chǎn)物穩(wěn)定且往往比植物自身合成的含量還要高等多方面的優(yōu)點[28]。但是大多數(shù)單子葉植物受發(fā)根農(nóng)桿菌感染后不能產(chǎn)生發(fā)狀根。

2.3.2 兩相培養(yǎng) 兩相培養(yǎng)是通過細胞在水相中生長，合成的脂溶性次生代謝物質(zhì)可以轉(zhuǎn)移至有機相中來提高代謝物的量。目前運用較多的是兩液相培養(yǎng)[29]。吳兆亮等[30]研究表明，在懸浮培養(yǎng)過程中加入有機溶劑可使紅豆杉的紫杉醇的釋放率提高近2倍。

2.3.3 基因工程的應(yīng)用 利用基因工程技術(shù)對植物細胞體內(nèi)基因進行調(diào)控來提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量是目前一種先進的應(yīng)用方法。通過反義技術(shù)，可以將反義DNA或RNA片段導(dǎo)入植物細胞，使控制代謝的關(guān)鍵酶活性受調(diào)控，從而提高目的物的含量[31]。在薄荷中導(dǎo)入反義構(gòu)建的薄荷呋喃合成酶基因，降低了薄荷油中薄荷呋喃的含量，改善了薄荷油的品質(zhì)[32]。

3 討論

經(jīng)過近幾十年的發(fā)展，植物細胞培養(yǎng)技術(shù)日趨成熟，人參產(chǎn)生的人參皂苷、紫草產(chǎn)生的紫草寧、黃連產(chǎn)生的小檗堿等已經(jīng)通過植物細胞培養(yǎng)技術(shù)實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)[33]。但高產(chǎn)而又穩(wěn)定的細胞系難以篩選；植物細胞的生長周期過長，以及污染和褐化問題難以徹底解決；植物細胞要求的生長環(huán)境復(fù)雜，生物細胞反應(yīng)器工藝難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求；植物細胞培養(yǎng)成本高，但代謝產(chǎn)物含量不穩(wěn)定，其不一定高于原植物，某些植物細胞次生代謝信號調(diào)控十分復(fù)雜[34]，難以控制?？梢姡弥参锛毎囵B(yǎng)產(chǎn)生有效次生代謝產(chǎn)物的技術(shù)有待進一步完善。

4 展望

放眼未來，利用植物細胞培養(yǎng)技術(shù)快速生產(chǎn)有效代謝產(chǎn)物的方法將會有廣闊的發(fā)展空間。要想實現(xiàn)植物細胞培養(yǎng)的工業(yè)化，需要從以下方面努力：獲取和篩選高產(chǎn)，穩(wěn)定的細胞系；探索并掌握植物細胞次生代謝信號調(diào)控機制，合理、準確地調(diào)控其懸浮細胞生長和代謝，以提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量；改善植物生物反應(yīng)器的工藝和技術(shù)，提供植物細胞培養(yǎng)的最適環(huán)境；充分利用基因工程先進技術(shù)，對次生代謝中的關(guān)鍵酶基因進行修飾和改造，提高次生代謝物的產(chǎn)量[35]。無疑，通過上述途徑，在不久的將來，成熟的細胞培養(yǎng)工業(yè)化生產(chǎn)體系能為人類防治疾病提供豐富的物質(zhì)基礎(chǔ)。

[1]常 鈺,劉 滌,胡之璧.植物細胞和器官大規(guī)模培養(yǎng)研究的進展[J].生物技術(shù)通報,2001,16(1):31-36.

[2]李冬杰,魏景芳,劉淑清,等.藥用植物細胞懸浮培養(yǎng)研究進展[J].河北林業(yè)科技,2003,30(4):22-23.

[3]張 堅,高文遠,王 娟,等.杠柳細胞懸浮培養(yǎng)體系的建立及有效成分杠柳毒苷和4-甲氧基水楊醛含量的測定[J].天津中醫(yī)藥,2010,27(2):163-165.

[4]吳春霞.植物細胞懸浮培養(yǎng)的影響因素[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009,37(1):36-38.

[5]王關(guān)林,石若夫,方宏筠.培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對梔子懸浮細胞合成多糖的影響[J].生物工程學(xué)報,2001,17(6):688-692.

[6]郭肖紅,高文遠,李克峰.丹參不定根組織培養(yǎng)的研究(Ⅱ)碳源、氮源和磷源對丹參不定根培養(yǎng)的影響[J].中草藥, 2007,38(6):907-911.

[7]彭 昕,汪榮斌,何軍邀,等.三葉青顆粒狀愈傷組織懸浮培養(yǎng)系的建立及培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].中成藥,2012,34(5): 961-965.

[8]王 娟,高文遠,尹雙雙,等.藥用植物細胞懸浮培養(yǎng)的研究進展[J].中國中藥雜志,2012,37(24):3680-3683.

[9]高艷麗,高山林,焦小珂,等.培養(yǎng)基中氮源對脹果甘草細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮類化合物的影響[J].海峽藥學(xué),2008, 20(10):136-139.

[10]方文娟,韓烈保,曾會明.植物細胞懸浮培養(yǎng)影響因子研究[J].生物技術(shù)報,2005,21(5):11-15.

[11]Zhao J,Zhu WH,Hu Q,et al.Enhanced indole alkaloid production in suspension compact callus clusters of Catharanthus roseus:impacts of plant growth regulators and sucrose[J].Plant Growth Regulation,2001,33(1):33-41.

[12]李 蕤,譚曉芳,陳 群,等.霍山石斛細胞懸浮培養(yǎng)及條件優(yōu)化[J].中草藥,2011,42(2):358-362.

[13]王 娟,高文遠,黃 滔,等.培養(yǎng)條件對西洋參懸浮細胞生物量和活性成分的影響[J].中國中藥雜志,2009,34(4): 375-378.

[14]李春斌,王關(guān)林,岳玉蓮,等.培養(yǎng)條件對銀杏懸浮培養(yǎng)細胞黃酮合成影響研究[J].大連理工大學(xué)學(xué)報,2003,43(3): 287-291.

[15]Gabriella P，F(xiàn)austo M，Barbara M，et al.Effects of the culture medium pH and ion uptake in in vitro vegetative organogenesis in thin cell layers of tobacco[J].Plant Science，2002，162(6): 947.

[16]陳 薇,梅文泉,趙豐萍,等.菘藍下胚軸愈傷組織細胞懸浮培養(yǎng)[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2002,24(2):105-107.

[17]廖禮佳,李祥會,楊 軍,等.長春花懸浮培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].西華師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版,2013,34(3):252-255.

[18]陳曉亞,湯章城.植物生理與分子生物學(xué)[M].北京:高等教育出版社,2007:128.

[19]華 萍,呂 虎,余繼紅,等.不同培養(yǎng)條件對懸浮培養(yǎng)茶葉細胞生長及茶氨酸合成的影響[J].云南植物研究,2006, 28(2):215-218.

[20]Verpoorte R,Heijden R,Memelink J.Engineering the plant cell factory for secondary metabolite production[J].Transgenic Research,2000,9(4-5):323-343.

[21]杜曉映.葡萄細胞的懸浮培養(yǎng)及誘導(dǎo)子對懸浮細胞多酚產(chǎn)量影響的研究[D].西安：西北農(nóng)林科技大學(xué),2008.

[22]趙 微,尹 靜,詹亞光,等.溫度脅迫對白樺懸浮細胞中三萜積累及防御酶活性的影響[J].中國生物工程雜志,2013, 33(2):34-40.

[23]Wang YD,Yuan YJ,Wu JC.Induction studies of methyl jasmonate and salicylic acid on taxane production in suspension cultures of Taxus chinensis var mairei[J].Biochemical Engineering Journal,2004,19(3):259-265.

[24]戴均貴,朱蔚華,吳蘊祺,等.前體及真菌誘導(dǎo)子對銀杏懸浮培養(yǎng)細胞產(chǎn)生銀杏內(nèi)酯B的影響[J].藥學(xué)學(xué)報,2000, 35(2):73-77.

[25]張獻龍,唐克軒.植物生物技術(shù)[M].北京:科學(xué)出版社, 2004.

[26]黃建安,劉仲華.毛狀根培養(yǎng)與植物次生代謝物的生產(chǎn)[J].微生物學(xué)雜志,2003,23(5):35-39.

[27]孫 敏,曾建軍.長春花毛狀根培養(yǎng)及抗癌生物堿產(chǎn)生的研究[J].中國中藥雜志,2005,30(10):741-743.

[28]張蔭麟.發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri-質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和賽莨菪的發(fā)根培養(yǎng)[J].植物學(xué)報,1988,30(4):368-372.

[29]李 祝,任秀秀,周禮紅,等.兩相培養(yǎng)用于提高植物次生代謝物產(chǎn)量的研究進展[J].食品工程,2011,17(1):10-12.

[30]吳兆亮,邸進申,元英進,等.東北紅豆杉細胞兩液相培養(yǎng)中紫杉醇釋放行為研究[J].生物工程學(xué)報,2000,16(4): 500-504.

[31]孫立影,于志晶,李海云,等.植物次生代謝物研究進展[J].吉林農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,34(4):4-10.

[32]Mahmoud SS,Croteau RB.Metabolic engineering of essential oil yield and composition in mint by altering expression of deoxyxylulose phosphate reductoisomerase and menthofuran synthase[J].PNAS,2001,98(15):8915-8920.

[33]胡鐵強,李晨東,姜 燕.藥用植物資源的可持續(xù)利用[C].第三屆生物多樣性保護與利用高新科學(xué)技術(shù)國際研討會,北京:北京科學(xué)技術(shù)出版社,2003.

[34]黃艷娜,朱天輝.植物誘導(dǎo)抗病性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[J].中南林學(xué)院報,2005,25(5):142-148.

[35]呂春茂,范海延.植物細胞培養(yǎng)技術(shù)合成次生代謝物質(zhì)研究進展[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，22(1):59-61.

R285.5

：A

：1673－9043（2014）06－0375-03

2014-08-17）

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.06.16

天津市科技支撐計劃項目（10ZCZDSY12400）。

劉 群（1989-），女，碩士研究生，研究方向為中藥質(zhì)量控制與資源開發(fā)。

李天祥，E-mail:litianxiang612@sina.com。