大鼠心肌缺血再灌注損傷模型建立的關鍵性問題*

侯夢夢，邢冬梅，劉 璇，華聲瑜

（天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津 300193）

大鼠心肌缺血再灌注損傷模型建立的關鍵性問題*

侯夢夢，邢冬梅，劉 璇，華聲瑜

（天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津 300193）

心肌缺血再灌注損傷模型是研究心肌缺血預適應機制、評價抗心肌缺血及心律失常藥物療效的經(jīng)典動物模型，傳統(tǒng)實驗操作仍有較多缺陷，需要對造模的關鍵技術不斷完善。加強該模型術前處理、術中操作和術后護理3個方面的研究，分析心肌缺血再灌注損傷實驗大鼠模型成功建立的關鍵性問題，并提出解決辦法，組建心肌缺血再灌注損傷模型的規(guī)范化造模流程。

心肌缺血再灌注損傷模型；關鍵性問題；術前處理；術中操作；術后護理

目前，冠狀動脈再通是急性心肌梗死公認的有效治療方法，然而，冠狀動脈再通又存在再灌注損傷問題，因而對再灌注損傷的研究及防治已成為研究的熱點問題。Jennings等[1]于1960年針對組織細胞低灌流缺血后獲得血液再供應時，組織細胞缺血性損害未得以減輕或恢復，缺血性損傷反而加重的病理變化首次提出了心肌缺血再灌注損傷（MIRI）的概念。目前心肌梗死的臨床治療手段已由傳統(tǒng)的藥物治療逐漸上升到基因治療、細胞治療等方法，但任何方法在臨床應用前都要經(jīng)過動物實驗研究。近些年，MIRI模型已經(jīng)成為抗MIRI臨床前研究的重要手段，是指導臨床應用、復雜新藥開發(fā)的重要研究方法。但是在MIRI造模過程的實踐中，存在較多難以把握的關鍵技術，能否成功建立MIRI模型已成為值得關注的問題。

1 術前處理

1.1 實驗動物的確定 MIRI模型旨在通過結扎左冠狀動脈前降支，造成急性心肌缺血，并在預定時間內(nèi)予以再灌注，已成為模擬人類缺血性心臟病恢復血供必需的實驗方法[2]?，F(xiàn)代研究中，用于建立MIRI模型的常用實驗動物有：豬、犬、兔、羊、小鼠及大鼠等[3]。實驗動物的選擇依照接近人體病理生理的原則，選擇進化關系上接近人類的大鼠，其基因背景清楚、繁殖周期短、冠狀動脈側支循環(huán)少、心肌壞死出現(xiàn)早、模型重復率高，結扎大鼠左冠狀動脈前降支造成心肌梗死是目前國內(nèi)外公認的模型制備方法[4]。在實驗過程中，建立MIRI模型應選擇為鼠齡9～11周，體質(zhì)量為220～280 g的大鼠。

1.2 麻醉處理 隨著麻醉技術的飛速發(fā)展，采用現(xiàn)代麻醉藥物傳遞系統(tǒng)理念，結合傳統(tǒng)麻醉藥物的施藥特點、動物的反應，摒除毒性作用較大的烏拉坦和麻醉誘導時間較長的水合氯醛，采用戊巴比妥鈉進行麻醉，其麻醉誘導時間短，對心臟毒性小，且大鼠術后蘇醒快，劑量易掌握[5]。在麻醉過程中，應注意下面幾點：1）麻醉藥現(xiàn)用現(xiàn)配，防止日久變質(zhì)。2）實驗大鼠均嚴格稱質(zhì)量，精確計算麻醉藥量，3%的戊巴比妥鈉腹腔注射劑量1.5 mL/kg[6]。3）麻醉藥盡量一次性注射到實驗大鼠的腹腔內(nèi)，避免中途補藥造成死亡，若因種種原因未將麻醉藥注射完全，應改用其他待做大鼠麻醉[7]。4）在麻醉劑給予過程中，基礎給藥量確定后，應根據(jù)動物對麻醉藥的反應，適時對給藥量進行微調(diào)[6]。5）實驗中加用1%的普魯卡因進行局部麻醉，可有效減輕大鼠的疼痛反應，降低麻醉藥的使用量，降低呼吸抑制作用。6）麻醉期間，使用37℃的電熱毯進行保溫。

2 術中操作

2.1 開胸方式 曾有研究在實驗過程中將肋骨剪斷，擴大手術視野，對大鼠造成較大損傷，極易引起心律失常致死[8]。在實驗過程中，在麻醉后背位固定大鼠，首先用手觸摸其心尖搏動處，確定心臟在胸腔中的大體位置。沿胸骨左緣心臟搏動處縱向剪開皮膚2～3 cm，用止血鉗逐層分離皮下肌肉，暴露左第3、4肋[9]。再用16 cm彎頭止血鉗迅速沿胸骨左緣3、4肋間隙插入胸腔分開肋骨，將心臟輕柔迅速的擠出胸腔，掛線結扎，結果顯示成功率較高，改良方法重視細節(jié)上對模型制備的操作，明確指出手術時視野、心臟固定的難易程度、大鼠胸腔的正常結構等方面的關鍵性問題，綜合控制大鼠在開胸過程中的情況，保證模型制作的成功率。在實驗中應注意以下幾個狀況：1）在大鼠開胸前，應仔細剪除大鼠胸部毛發(fā)，清理后可使用生理鹽水或碘伏將皮膚擦干凈，避免開胸后毛發(fā)貼在心臟表面與神經(jīng)、血管混淆，影響結扎操作[10]。2）若出現(xiàn)胸腔粘連，用手術剪輕輕將心包膜撕裂后再將心臟擠出胸腔，然后按照上面步驟進行操作。3）若出現(xiàn)體質(zhì)量過重或者過輕以及罕見的右位心現(xiàn)象，在術前超聲過程中進行標記[11]，便于找到正確的位置進行開胸。4）實驗總結發(fā)現(xiàn)，應注重機體病理狀態(tài)，摒棄外援呼吸系統(tǒng)，每隔2～5 min用棉簽清理口腔至呼吸道中的分泌物，防止大鼠窒息死亡。

2.2 結扎過程的關鍵性問題

2.2.1 結扎操作 結扎前于心臟大靜脈處放1根實心玻璃絲引線（1.5～2.0 mm），石蠟油潤滑后[7]，用6/0無創(chuàng)縫合針于左心耳根部下方2 mm處穿過心肌表層，在肺動脈圓錐旁出針[12]，進針深度為0.5～1.0 mm、寬度為2.0～3.0 mm[13]，此時稍微輕輕用力拉起縫合線兩端，心尖的左室前壁失去原有光澤而顯暗灰色或青紫色，左室收縮活動減弱及此過程動態(tài)心電圖中出現(xiàn)ST段弓背向上持續(xù)抬高和R波增高的現(xiàn)象，初步判斷縫合線牽拉住左冠狀動脈前降支，結扎位置準確[14]。若出現(xiàn)因局部刺激導致心肌蒼白，之后很快恢復正常的現(xiàn)象，或者未見到ST段弓背向上持續(xù)抬高和R波增高的情況，則表明結扎未成功，立即輕輕抽出縫合線，重新按照以上步驟進行再次結扎操作[15]。在結扎過程中注意以下幾點：1）進針位置：盡量一次成功，由于重復縫扎會束縛較多的心肌組織，造成機械性損傷，易致大鼠胸腔粘連，嚴重影響模型的穩(wěn)定性。2）進針深淺：進針深易穿透心室壁，造成大量出血，死亡率較高，進針淺易穿過心肌表層，未能準確結扎到血管，均會導致模型建立失敗[16]。3）結扎松緊度：結扎過緊易引發(fā)血管斷裂，過松易造成不完全性缺血，均會影響造模的成功率。為避免這樣的問題出現(xiàn)，模型建立時為保證手術的穩(wěn)定均一性，應由同一人完成整個手術操作。4）心臟出血：用干紗布適當力度壓迫出血點，止血效果顯著，切記盲目使用鉗夾以防造成更大的損傷，降低模型成功率。5）摒棄再灌注時將活結打開的傳統(tǒng)方法，現(xiàn)采用實心玻璃絲引線[7]，再灌注時直接將其抽出的手段，防止縫合線牽扯心肌組織，避免出現(xiàn)不可逆損傷狀況。

2.2.2 結扎后處理 結扎后0～30 min大鼠發(fā)生房顫、室速等心律失常的幾率較大，此時在傷口縫合處滴入少量治療快速室性心律失常的藥物利多卡因（生理鹽水稀釋100倍），使其滲入到心臟組織中，并適當給與心外膜按摩，有效緩解心律失常的發(fā)生，減少因心律失常所引起的死亡[17-18]。

2.3 缺血及再灌注時間選擇

2.3.1 缺血時間 模型建立過程中，缺血心肌組織在恢復血液灌注后發(fā)生的細胞死亡或功能降低、引起超微結構、功能、代謝及電生理方面發(fā)生進一步的損傷，根據(jù)缺血時間的長短其表現(xiàn)形式也各有不同，分別為血管損傷、再灌注心律失常以及心肌梗死[19]。缺血時間小于5 min的心肌處于血管性損傷狀態(tài)，若此時恢復再灌注后缺血心電圖迅速恢復正常狀態(tài)，心肌的收縮和舒張功能能夠迅速恢復正常；缺血時間在5～20 min的心肌功能、形態(tài)結構尚未發(fā)生較大改變，再灌注后主要表現(xiàn)為心律失常；缺血時間大于或等于30 min的心肌處于不可逆性損傷狀態(tài)，直接造成心肌梗死。在實驗過程中，為模擬臨床病理狀態(tài)，心肌細胞形成不可逆性損傷，缺血時間一般定為30～40 min[16]。

2.3.2 再灌注時間 缺血30～40 min后，將實心玻璃絲引線拉出來，進行再灌注，大量氧自由基生成，其通過不飽和脂肪酸作用引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應生成丙二醛（MDA），通過多種途徑破壞細胞膜結構，另外，氧自由基還能促進鈣超載，胞漿內(nèi)游離鈣的增加進一步加速自由基的產(chǎn)生，加重再灌注損傷[20]。實驗證明，造模過程中的再灌注時限呈多樣化，再灌注1、2、3 h到24 h等，模型建立后心肌梗死面積均在20%～30%，表明MIRI模型在各種在灌注時限均可建立成功[21-24]。因此在實驗研究中，應根據(jù)實驗需要，采取不同的再灌注時間以及采用再灌期間連續(xù)給藥的方式，來評價藥物的治療效果[12]。

3 術后處理

結扎后將心臟輕輕地迅速推進胸腔，選擇三角針、最細型號縫線，右手持文式止血鉗稍微提起胸部肌肉，左手迅速沿與切口垂直方向擠壓胸腔[25]。采用肌腱縫合的方法按層次由深到淺分層，將相同類型的組織對齊縫合，以組織對合后不發(fā)生裂隙為宜，勿留死腔，以防積血、積液延緩傷口愈合和感染，由于肌肉分離的較碎、肋間肌肉較薄不易縫合，縫合過程中要用小針細線，避免打結脫線導致氣胸，提高模型成功率。手術結束后，將大鼠放在電熱毯上（37℃）至蘇醒，存活的大鼠放入籠中單獨飼養(yǎng)（防止術后大鼠的傷口感染或者因血腥味相互打斗）直到取材時間，術后肌肉注射青霉素預防感染[26]或給予姜黃素[27]腹腔注射治療。

4 結語

綜上所述，模擬人類心肌梗死的病理現(xiàn)象，傳統(tǒng)建立MIRI模型的實驗操作仍有較多缺陷，MIRI模型作為指導臨床研究、復雜藥效評價的重要方法需要不斷完善，其成功與否主要取決于以上幾個環(huán)節(jié)中的關鍵性操作。組建MIRI模型的規(guī)范化造模流程是進行心血管疾病研究和治療的根基，整個心血管疾病的研究工作都要圍繞建立成功的MIRI模型的基礎上展開，因此，建立MIRI模型的成功與否，對于其后一系列研究是否成功有著重要意義。

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Key troubles in reproducing myocardial ischemia and reperfusion injury in rats

HOU Meng-meng,XING Dong-mei,LIU Xuan,HUA Sheng-yu
（Institute of Traditional Chinese Medicine,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193, China）

The animal model of myocardial ischemia and reperfusion injury is a classic model in researching the preadaptation mechanism of myocardial ischemia,evaluating the therapeutic effect of the drugs of antimyocardial ischemia and irrhythmia.There are still many deficiencies in the classic experimental operation.It is necessary for the continuing improving some key techniques in modeling,strengthening the study on the preoperative treating,intra-operative procedure and post-operative nursing,analyzing the key troubles in reproducing these models of myocardial ischemia and reperfusion injury and providing the resolving method and establishing a normal process in modeling myocardial ischemia-reperfusion injury.

model of myocardial ischemia reperfusion injury;key trouble;preoperative treatment;intraoperative procedure;postoperative care

R541.4

：A

：1673－9043（2014）06－0323-04

2014-08-20）

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.06.02

國家自然科學基金項目（81202798）；教育部“創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃”資助項目（IRT1276）；天津市高等學?？萍及l(fā)展基金計劃項目（20110208）。

侯夢夢（1991-），女，碩士研究生，主要研究方向為中醫(yī)藥防治心腦血管疾病的中藥藥理學研究。

華聲瑜，E-mail:bravo2008@163.com。