血管內(nèi)皮細胞衰老的研究進展

周智輝 綜述，戴亞蕾 審校

(同濟大學(xué)免疫學(xué)教研室，上海 200092)

細胞衰老可分為應(yīng)激性衰老和復(fù)制性衰老［1］，應(yīng)激性衰老通常是指促衰老因素刺激細胞，進而引起增殖分化異常而發(fā)生的細胞衰老;復(fù)制性衰老是指細胞在多次增殖分裂之后端粒縮短或活性下降，導(dǎo)致細胞衰老的發(fā)生。血管內(nèi)皮細胞衰老可預(yù)期血管衰老，血管內(nèi)皮細胞生物學(xué)改變是血管衰老和血管性疾病發(fā)生的基礎(chǔ)，本研究就近期血管內(nèi)皮細胞衰老的相關(guān)研究進展從促進和抑制兩方面因素進行綜述。

衰老(aging，senescence)，是指時間依賴的功能下降進而影響機體存活的現(xiàn)象，是不可逆的生命過程。細胞衰老概念的正式提出源自于1961年Hayflick［2］首次報道了體外培養(yǎng)的人成纖維細胞具有增殖分裂的界限，其研究結(jié)果顯示體外培養(yǎng)的人二倍體細胞以1∶2的比率連續(xù)傳代，平均只能傳代40～60次，提示細胞的增殖能力以及壽命是有限的;來自胎兒肺組織的胚胎成纖維細胞平均可傳代48次，而來自成年肺組織的成纖維細胞平均只能培養(yǎng)20代，表明細胞的增殖能力與供體年齡相關(guān)，細胞的衰老進而控制細胞的分裂次數(shù)。所有細胞衰老的共同特征［3］主要表現(xiàn)為:β-半乳糖苷酶的活性增高，溶酶體活性增高，蛋白質(zhì)合成和降解能力下降;而內(nèi)皮細胞衰老時thymosin-β-10的表達下降。關(guān)于衰老發(fā)生的機制除端粒以及端粒酶學(xué)說之外，還有線粒體功能紊亂、細胞增殖和凋亡學(xué)說、基因?qū)W說以及蛋白質(zhì)修飾學(xué)說等。目前鑒定細胞衰老的常用方法是檢測β-半乳糖苷酶的活性，即細胞衰老β-半乳糖苷酶染色增強，而細胞增殖能力測定、細胞周期分析、衰老相關(guān)基因表達、端粒長度以及端粒酶活性分析等也用于檢測細胞衰老的指標(biāo)。

1 促進血管內(nèi)皮細胞衰老的主要因素

1.1 端粒與端粒酶變化

端粒是正常染色體末端包括DNA與蛋白質(zhì)的復(fù)合結(jié)構(gòu)，在細胞的復(fù)制性衰老中起關(guān)鍵作用，端粒會隨著細胞分裂次數(shù)的增加而縮短，端粒DNA的丟失存在補償機制，包括端粒酶依賴途徑和非端粒酶依賴途徑，端粒酶是一種特殊的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，主要功能是維持端粒的長度并從頭合成端粒重復(fù)序列。當(dāng)端?？s短到一定程度時，染色體末端暴露，會誘發(fā)一種類似于DNA損傷的級聯(lián)信號。許多研究證實，端粒的長度與衰老密切相關(guān)，體外連續(xù)培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)，結(jié)果顯示隨著傳代次數(shù)的增加，細胞的端粒長度隨之減少［4］。增齡對血管內(nèi)皮細胞衰老具有重要的影響，可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞功能紊亂。李東霞等［5］通過選擇青年組(3月齡)、成年組(9月齡)、中年組(15月齡)的健康雄性大鼠，通過檢測血漿和主動脈組織中血管內(nèi)皮功能相關(guān)指標(biāo)(如 NO、eNOS、iNOS、ET-1)來評估增齡對大鼠血管內(nèi)皮細胞的影響，結(jié)果顯示血漿中NO、eNOS、iNOS及主動脈組織的NOS活性隨月齡增加逐漸降低。分離不同月齡的小鼠主動脈內(nèi)皮細胞進行培養(yǎng)，模擬復(fù)制性衰老模型，采用衰老相關(guān)β半乳糖苷酶染色進行跟蹤，結(jié)果發(fā)現(xiàn)50周齡小鼠主動脈內(nèi)皮細胞衰老數(shù)量明顯比2周齡小鼠增多，進一步采用免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)衰老細胞表面β4整合素的相對密度顯著升高［4］，表明增齡會加速小鼠主動脈內(nèi)皮細胞衰老。細胞在體外培養(yǎng)傳代多次后也會出現(xiàn)衰老的表型，通常將此種細胞衰老稱為復(fù)制性衰老，復(fù)制性細胞衰老實驗中通常采用計算細胞的群倍加數(shù)(population doubling，PD)以及群體倍增水平(population doubling level，PDL)來評價細胞衰老狀況。復(fù)制性衰老細胞模型的建立為探索血管內(nèi)皮細胞的衰老機制提供了可靠的實驗工具，眾多研究通過建立血管內(nèi)皮細胞復(fù)制性衰老模型，揭示了細胞衰老的分子機制以及衰老干預(yù)的最新進展［5-7］，目前大量研究結(jié)果顯示不論是體內(nèi)試驗還是體外實驗均提示增齡能夠促進血管內(nèi)皮細胞的衰老。

1.2 線粒體功能紊亂

自由基氧化損傷導(dǎo)致線粒體功能紊亂是細胞衰老的一個重要機制，線粒體是產(chǎn)生自由基的主要場所，也容易受到活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的攻擊而產(chǎn)生DNA氧化損傷。一方面，氧化損傷隨增齡不斷累積，另一方面，機體對損傷產(chǎn)生應(yīng)答能力。當(dāng)應(yīng)答反應(yīng)以及損傷修復(fù)能力下降時，會導(dǎo)致細胞衰老，隨著細胞的衰老，呼吸鏈的效應(yīng)也隨之下降，進而使ATP的生成減少［13］。常見的自由基包括氧自由基，又稱活性氧，如過氧化氫等，還有羥自由基、有機過氧基和過氧化物以及氮氧自由基。自由基的產(chǎn)生可分為內(nèi)源性和外源性，其主要特點是活性高，不穩(wěn)定，易與其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)形成新的自由基或氧化物，并且容易產(chǎn)生連鎖反應(yīng)。自由基可導(dǎo)致DNA特別是線粒體DNA的損傷斷裂，并能促使膠原蛋白交聯(lián)，導(dǎo)致結(jié)締組織的理化性狀發(fā)生改變。機體衰老的過程中自由基的水平會升高，而自由基對組織的損傷特別是線粒體DNA的破壞能夠加速衰老，這種效應(yīng)的長期累積可認為是細胞衰老發(fā)生的一個基礎(chǔ)［14-15］。為研究ROS對血管內(nèi)皮細胞miRNAs(microRNAs)表達的影響，經(jīng)體外培養(yǎng)HUVEC，在200 μmol/L的過氧化氫刺激24 h后檢測了250個 miRNAs的表達，其中 miR-200c表達顯著上調(diào)，而miR-1和miR-147表達明顯下調(diào)，其他的miRNAs未見明顯變化［16］，進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-200c可調(diào)節(jié)HUVEC細胞的增殖、凋亡和衰老;氧化應(yīng)激通過miR-200c下調(diào)ZEB1(zinc finger E-box binding homeobox 1)蛋白的表達，進而顯著影響細胞的增殖、促使凋亡的發(fā)生，ZEB1的下調(diào)，同樣能顯著促進HUVEC細胞的衰老，衰老相關(guān)β半乳糖苷酶染色陽性細胞比例明顯上升，P21的表達增高;過氧化氫介導(dǎo)的miR-200c上調(diào)的機制主要涉及p53和Rb(retinoblastoma)蛋白的參與。過氧化氫刺激不僅對HUVEC細胞有影響，也促進主動脈血管內(nèi)皮細胞衰老。有研究發(fā)現(xiàn)100 μmol/L的過氧化氫與小鼠主動脈內(nèi)皮細胞共孵育1 h后，再更換正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72 h可檢測到衰老細胞的比例顯著上升［7］。由此可見，自由基以及氧化應(yīng)激反應(yīng)與血管內(nèi)皮細胞衰老具有密切的關(guān)系。

1.3 細胞凋亡

細胞凋亡與細胞衰老之間存在著密切關(guān)系，細胞凋亡可通過破壞不可替代的細胞進而促進衰老。一些促凋亡因子也能引起細胞衰老，如腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNFα)，體內(nèi)多種細胞，如單核/巨噬細胞、淋巴細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞以及成纖維細胞等均可產(chǎn)生和釋放TNFα，TNFα與其相對應(yīng)的受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)活性。近期研究［11］顯示用 10 ng/ml的 TNFα 誘導(dǎo) HUVEC 24 h后換液正常培養(yǎng)，當(dāng)PD為22時，細胞開始衰老，在PD 42時細胞的生存能力顯著下降，通過β半乳糖苷酶染色鑒定發(fā)現(xiàn)，TNFα能誘導(dǎo)HUVEC細胞衰老，并使抗衰老基因Klotho表達下調(diào)，縮短的端粒細胞比例顯著升高。TNFα誘導(dǎo)的HUVEC細胞衰老主要發(fā)生在 PD 2～PD 26，而對 PD 42的HUVEC細胞誘發(fā)衰老不明顯，表明TNFα可誘導(dǎo)年輕的HUVEC細胞衰老，而對年老的HUVEC細胞作用并不明顯。沒有受TNFα刺激的HUVEC細胞，隨著PD的增加，ROS活性增加以及低線粒體膜電位細胞比例也隨之增加，但TNFα刺激年輕(PD 2和PD 26)的HUVEC細胞后，ROS活性增加以及低線粒體膜電位細胞比例增加較未受TNFα刺激更為顯著。此現(xiàn)象說明HUVEC的衰老不僅發(fā)生于細胞多次復(fù)制后引起的自然復(fù)制性衰老，而且還可被TNFα誘發(fā)促進細胞衰老。

2 抑制血管內(nèi)皮細胞衰老的主要因素

抗衰老基因在衰老和抗衰老的平衡過程中具有重要的調(diào)控作用，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)與血管內(nèi)皮細胞衰老密切相關(guān)的基因主要有sirtuins、Klotho、胰島素樣生長因子-1(insulinlike growth factor-1，IGF-1)、FoxOs轉(zhuǎn)錄因子等。

sirtuins基因家族包括SIRT1-7個成員，各成員在細胞定位以及組織分布中有所區(qū)別，根據(jù)核苷酸序列將其分為 4類:Ⅰ類(SIRT1-3)、Ⅱ類(SIRT4)、Ⅲ類(SIRT5)、Ⅳ類(SIRT6-7)［17］。過表達或激活SIRT1可通過增加NO的合成從而提高血管內(nèi)皮細胞的功能，為研究內(nèi)源性SIRT1對內(nèi)皮依賴的血管舒張以及炎癥激活的作用，Stein等［18］對20 周齡 ApoE‐/‐SIRT1+/+和 ApoE‐/‐SIRT1+/-小鼠主動脈的內(nèi)皮依賴功能和炎癥產(chǎn)生途徑進行了評估，較為有趣的是兩組小鼠在主動脈內(nèi)皮的收縮和舒張功能上未見顯著差異，主動脈環(huán)的總eNOS蛋白水平以及eNOS(Ser1177)磷酸化水平也具有相似性，表明內(nèi)源性SIRT1不影響ApoE‐/‐小鼠的內(nèi)皮功能;然而ICAM-1和VCAM-1黏附分子表達在ApoE‐/‐SIRT1+/+小鼠主動脈硬化斑塊區(qū)域明顯高于ApoE‐/‐SIRT1+/-小鼠。體外實驗顯示血管內(nèi)皮細胞經(jīng)siRNA沉默SIRT1基因后，TNFα刺激5 h可顯著上調(diào)黏附分子VCAM-1 mRNA的表達［18］，提示VCAM-1的上調(diào)與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，而NF-κB信號通路在炎癥進程中具有重要作用，而SIRT1可通過對NF-κB亞單位RelA/p65的去乙?；饔靡种芅F-κB活化［19］。近期研究顯示30個月齡小鼠主動脈SIRT1蛋白的表達量較5～7個月齡小鼠顯著降低，臨床數(shù)據(jù)也顯示老齡健康人群組(平均64歲)肱動脈的SIRT1蛋白的表達量明顯低于年輕健康人群組(平均25歲)，提示SIRT1可作為衰老及年齡相關(guān)心血管疾病的治療靶點［15］。

Klotho基因也與血管內(nèi)皮細胞的衰老密切相關(guān)，外源性Klotho可抑制ROS活性以及TNFα所引起的HUVEC細胞凋亡，也可抑制端粒的縮短及細胞衰老β半乳糖胺酶活性［11］。Klotho蛋白通過絲裂原活化蛋白激酶途徑減少HUVEC細胞凋亡和衰老［21］。TNFα 可誘導(dǎo) HUVEC 高表達黏附分子ICAM-1和VCAM，而Klotho蛋白能顯著抑制此效應(yīng)。體外實驗發(fā)現(xiàn)TNFα能顯著增加HUVEC內(nèi)NF-κB的活性，而Klotho能夠有效地抑制TNFα引起的NF-κB的激活，而Klotho本身并不引起NF-κB的活化;黏附分子ICAM-1和VCAM的表達通常受轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB 的調(diào)節(jié)［22］，表明 Klotho蛋白是通過抑制NF-κB的活性進而抑制HUVEC細胞表達ICAM-1和VCAM達到抗衰老作用。

IGF-1在血漿中有較高含量，可由多種細胞表達分泌，對細胞的生長、增殖以及分化起重要作用。NO在內(nèi)皮細胞功能維持方面發(fā)揮重要作用，主要由于其對氧化還原反應(yīng)高度敏感，并具有高效的血管舒張效應(yīng)，IGF-1可通過調(diào)節(jié)NO產(chǎn)生從而提高血管內(nèi)皮的舒張功能，減少內(nèi)皮細胞功能紊亂，延緩由內(nèi)皮細胞功能紊亂引起的細胞衰老［23］。經(jīng)100 ng/mL的IGF-1預(yù)處理人主動脈內(nèi)皮細胞(human aortic endothelial cells，hAECs)24 h，再用100 μmol/L的過氧化氫誘導(dǎo)1 h，結(jié)果顯示IGF-1能抑制過氧化氫所誘發(fā)的hAECs細胞衰老;谷胱甘肽過氧化物酶-1(glutathione peroxidase-1，GPX-1)是細胞抗氧化系統(tǒng)的重要組分，有研究發(fā)現(xiàn)IGF-1可上調(diào)GPX-1在hAECs細胞的表達及其活化，這主要是通過磷酸肌醇 3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinase，PI3k)依賴的信號通路調(diào)節(jié)機制而實現(xiàn)［24］。

FoxOs基因有4個家族成員:FoxO1(FKHR)、FoxO3(FKHRL1)、FoxO4(AFX)和FoxO6。FoxOs基因在促進長壽方面具有重要作用［25］，其中FoxO1在細胞生長以及抵御氧化應(yīng)激等方面已得到廣泛證實。高血糖能引起人微血管內(nèi)皮細胞的衰老，衰老過程中SIRT(1-7)mRNA表達均較衰老前明顯下降，為進一步研究其作用機制，以FoxO1作為研究的關(guān)鍵分子，因為FoxO1是SIRT1的一個下游靶基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在高血糖引起的人微血管內(nèi)皮細胞衰老過程中，F(xiàn)oxO1的DNA結(jié)合能力下降以及乙?；腇oxO1表達增高，但此現(xiàn)象可被SIRT1激動劑有效逆轉(zhuǎn)［26］。抑制FoxO1的表達會降低其 DNA結(jié)合能力進而導(dǎo)致ROS的增高以及血管內(nèi)皮細胞衰老，采用siRNA技術(shù)沉默SIRT1表達也會導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞衰老，表明FoxO1在血管內(nèi)皮細胞的衰老中具有重要的調(diào)節(jié)作用。FoxOs基因表達還受PI3KAkt信號通路調(diào)節(jié)，對于細胞的增殖以及細胞存活等方面具有重要的調(diào)控作用［27］。

3 結(jié) 語

血管內(nèi)皮細胞的衰老是導(dǎo)致許多心腦血管疾病的重要原因，而目前心腦血管的疾病負擔(dān)尤為突出，如何防治首先需要對發(fā)病機制進行深入的研究。除自由基、端粒、抗衰老基因、線粒體損傷、DNA損傷、蛋白質(zhì)修飾以及熱量限制等學(xué)說之外，炎癥與衰老也存在著密切的關(guān)系，如細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)負調(diào)控蛋白3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)在個體生長發(fā)育過程中具有重要作用，參與抗凋亡過程。本課題組已成功建立體外高表達SOCS3的細胞模型［28］，為進一步研究SOCS3在抗凋亡過程中的分子作用機制提供研究手段。目前已證實IL-10可調(diào)控氧化性低密度脂蛋白所誘導(dǎo)的HUVEC細胞凋亡，其作用途徑是通過上調(diào)SOCS3進而抑制p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［29］。綜合各學(xué)說，從網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)角度來闡釋血管內(nèi)皮細胞衰老機制，血管內(nèi)皮細胞的增殖和分化需要保持一個動態(tài)平衡，當(dāng)促衰老因素或抗衰老因素失衡時，均可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞的衰老。促衰老因素不僅與自由基、增齡、腫瘤壞死因子等因素有關(guān)，還與抗衰老因素，尤其是抗衰老基因的作用密切相關(guān)。植物活性成分如白藜蘆醇、大黃酸及其衍生物賴氨大黃酸，某些抗高血壓以及糖尿病的治療藥物也具有保護血管內(nèi)皮細胞的功能。這些都為血管內(nèi)皮細胞衰老的機制研究提供理論數(shù)據(jù)，有望發(fā)現(xiàn)新的治療靶點，為藥物研發(fā)提供新的依據(jù)。

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