電針預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注損傷后頸靜脈血糖及腦水腫的影響

萬秋霞，王威威，劉冬冬，劉天華，全麗妮

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，黑龍江哈爾濱 150086)

腦缺血后再灌注(ischemia reperfusion，IR)可加重缺血細胞的損傷，甚至導(dǎo)致細胞的死亡。研究表明電針刺激穴位對腦缺血再灌注損傷有保護作用，取得了比較滿意的效果［1-2］。預(yù)處理可以減輕再灌注損傷，保護組織器官，該領(lǐng)域研究正不斷深入。針刺是否能作為一種預(yù)處理方式，目前國內(nèi)外極少有人研究［3］。本實驗采用大鼠全腦缺血模型，首次提出通過觀察電針預(yù)處理大鼠“百會”(Du20)與“水溝”(Du26)穴對腦缺血再灌注后頸靜脈血糖及腦組織含水量的影響，初步揭示電針預(yù)處理的腦保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康雄性 Winster大鼠90只，體質(zhì)量250～300 g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院動物實驗中心提供，在控溫(23±1)℃，標準明-暗周期飼養(yǎng)(明期6:00～18:00)環(huán)境下自由飲水覓食。經(jīng)過5 d適應(yīng)期后隨機分為假手術(shù)組(SH組)，腦缺血再灌注組(IR組)，電針預(yù)處理加腦缺血再灌注組(EA組)，每組30只。并按照缺血再灌注后不同時間點再進一步細分為2、6、24 h三個亞組，每組10只。所有動物實驗均經(jīng)過哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物實驗倫理委員會批準。

1.2 動物模型的建立

參照文獻報道的方法［4-5］加以改進，即采用阻斷雙側(cè)頸總動脈合并低血壓方法建立大鼠腦缺血再灌注模型。麻醉前禁食12 h。腹腔注射10%的水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后，經(jīng)口氣管插管后，動物仰臥固定，接呼吸機，機械通氣，定時血氣分析以調(diào)整呼吸頻率、潮氣量，使呼吸末二氧化碳分壓(PetCO2)和動脈血pH保持在生理范圍。頸部去毛，70%酒精棉球消毒，頸部正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈，分別穿線以方便提起。雙側(cè)腹股溝部切口，分離股動脈，左股動脈置管用于采血樣、監(jiān)測血壓，右股動脈置管用于放血和血液回輸。SH組僅暴露雙側(cè)頸總動脈及股動脈置管，麻醉和手術(shù)步驟同腦缺血再灌注組，只是不夾閉左右頸總動脈，不回抽血液。其余組用肝素化的注射器自右股動脈抽血，使MAP降至35～40 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)時，用無創(chuàng)動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈15 min，缺血期間通過抽吸股動脈血維持MAP 35 mmHg～40 mmHg。同時雙側(cè)顳部頭皮插入電極描記腦電波，大鼠在缺血10～15 s時腦電圖即可變?yōu)榈入娢?，可判斷為腦缺血模型建立。缺血15 min后去除兩側(cè)頸總動脈上動脈夾并將血液回輸完成再灌注。術(shù)中使用恒溫電熱毯維持直腸溫37℃ ～38℃。

1.3 電針預(yù)處理

電針預(yù)處理組在腦缺血前給予電針刺激。參考全國《實驗針灸學(xué)》教材取大鼠“百會”(Du20)與“水溝”(Du26)穴。用直徑為0.40 mm、長25 mm的華佗牌不銹鋼毫針，“百會”頂骨正中向前刺入2 mm，“水溝”唇裂鼻尖下1 mm正中處直刺入1 mm，至針下出現(xiàn)沉緊感時接通上海產(chǎn)G6805電針儀，用疏密波，頻率2/15 Hz，強度(電流)1 mA，刺激強度以大鼠頭部輕微抖動為度，持續(xù)30 min。

1.4 腦組織含水量測定

將各組實驗動物在規(guī)定的各時間點斷頭處死，取腦組織，濾紙吸干腦表面水分，用預(yù)先稱重編號，錫紙包裹，先用電子天平稱取腦組織濕重，然后將包好的腦組織放入95℃恒溫烤箱內(nèi)烘干24 h至恒重，取出待測腦組織恢復(fù)到室溫后稱取其干重。計算腦組織含水量=(濕重－干重)/濕重×100%。

1.5 頸靜脈血糖的測定

血糖測定采用德國羅氏血糖測定儀，在各個時間點取一滴頸靜脈血，即刻用血糖儀測定血糖含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件包進行統(tǒng)計分析，計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組資料可比性

SH組、IR組、EA組大鼠體質(zhì)量、血氣值、HR、MAP、血糖基礎(chǔ)水平等指標差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、血氣值、HR、MAP、血糖基礎(chǔ)值Tab.1 Physiological values measured in 3 groups of rats (n=30，±s)

表1 各組大鼠體質(zhì)量、血氣值、HR、MAP、血糖基礎(chǔ)值Tab.1 Physiological values measured in 3 groups of rats (n=30，±s)

項目 SH組 IR組 E組體質(zhì)量/g 281±15 276±12 377±13 pH 7.41 ±0.05 7.41 ±0.02 7.42 ±0.16 PaCO2/mmHg 40.6 ±3.2 40.1 ±2.9 39.8 ±3.1 PaO2/mmHg 482±17 483±23 487±25 HCO－3/(mmol·L －1)24.2 ±1.4 24.2 ± 1.1 23.5 ± 1.6 HR/(次·min－1) 350±20 353±17 346±18 MAP/mmHg 123±3 121±11 125±10血糖/(mmol·L －1)4.3 ±0.66 4.46 ±0.61 4.41 ±0.58

2.2 缺血大鼠腦電圖變化

建立缺血大鼠模型腦電圖均出現(xiàn)變化，大鼠在缺血10～15 s時腦電圖均可由缺血前腦電圖(圖1A)變?yōu)榈入娢?圖1B)，可判斷為腦缺血模型建立。

圖1 大鼠腦缺血前后腦電圖波形Fig.1 Electroencephalogram of rat before and after cerebral ischemia

2.3 腦組織含水量變化

IR組和SH組以及EA組的含水量在術(shù)后2 h無明顯差別。IR組和EA組腦含水量在再灌注后6 h顯著升高，48 h達到高峰，與SH組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與IR組比較，電針預(yù)處理組在再灌注后6 h和24 h腦含水量顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見表2。

2.4 頸靜脈血糖的變化

和SH組對比，EA組和IR組在再灌注后2 h血糖明顯升高，6 h達到最高值，至24 h有所回落，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與IR組比較，EA組在再灌注2、6 h和24 h血糖值顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見表2。

表2 各組大鼠各個時間點血糖、腦組織含水量的比較Tab.2 Comparison of blood glucose and brain water content in 3 groups at different time points (n=30，±s)

表2 各組大鼠各個時間點血糖、腦組織含水量的比較Tab.2 Comparison of blood glucose and brain water content in 3 groups at different time points (n=30，±s)

與 SH組比較，(1)P ＜0.01;與 IR 組比較，(2)P＜0.01

組別 血糖/(mol·L－1) 腦組織含水量/%2h 6h 24h 2h 6h 24h SH 組 4.56 ±0.55 4.54 ±0.57 4.20 ±0.52 77.38 ±0.20 77.42 ±0.19 77.37 ±0.24 IR 組 7.17 ±0.57(1) 8.73 ±0.47(1) 7.23 ±0.45(1) 77.33 ±0.26 79.36 ±0.27(1) 81.20 ±0.46(1)EA 組 6.27 ±0.56(1)(2) 7.53 ±0.36(1)(2) 6.27 ±0.54(1)(2) 77.29 ±0.16 78.31 ±0.16(1)(2)79.23 ±0.33(1)(2)

3 討 論

臨床上處理腦缺血性損傷的原則是盡早恢復(fù)血液再灌注，然而缺血后的血流恢復(fù)在某些情況下能導(dǎo)致進一步的組織損傷和功能障礙，即缺血/再灌注損傷。腦缺血-再灌注損傷后高血糖反應(yīng)和腦水腫的發(fā)生是導(dǎo)致患者病情加重甚至死亡的常見原因。有報道認為［6］，急性顱腦損傷患者會發(fā)生不同程度的高血糖癥，且患者的預(yù)后與高血糖水平成正相關(guān)。如何防治腦缺血再灌注后血糖的升高和腦水腫的發(fā)生是近年來愈來愈受到重視的研究課題之一。

腦缺血后血糖升高的發(fā)生機制和血糖的變化規(guī)律目前仍不清楚，可能與應(yīng)激和激素水平的變化等因素有關(guān)［7-8］。本實驗中大鼠腦缺血再灌注后2 h血糖顯著升高，6 h達到高峰，24 h有所下降，維持在一個較高水平。這可能是大鼠腦缺血再灌注后，機體由于應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致應(yīng)激激素分泌增多，胰島素分泌減少，葡萄糖攝入下降，同時受損的腦細胞代謝降低，對糖的攝取和利用降低，最終導(dǎo)致血糖升高。

本研究發(fā)現(xiàn)電針預(yù)處理大鼠在缺血再灌注后血糖也升高，但較缺血再灌注組顯著減少，表明電針預(yù)處理對缺血再灌注損傷導(dǎo)致血糖升高有調(diào)理作用，有效提高受損腦細胞的代謝水平，增加腦細胞對葡萄糖的攝取和利用，對腦組織能量代謝的恢復(fù)具有明顯的促進作用，有利于缺血性腦損傷的盡快康復(fù)。

在以往使用大鼠進行電針實驗的研究過程中，實驗對象多數(shù)是在清醒的狀態(tài)下進行針灸或電針干預(yù)，常常導(dǎo)致動物在接受治療的同時處于應(yīng)激狀態(tài)，嚴重影響了實驗結(jié)果。為了排除電針干預(yù)引起的應(yīng)激反應(yīng)，本研究中均給大鼠麻醉，避免電針針刺本身對大鼠血糖的干擾。

腦水腫是腦缺血再灌注后的基本病理變化之一，是一個復(fù)雜的多因素過程。本實驗中觀察到缺血再灌注后2 h腦含水量沒有顯著性變化，6 h含水量顯著增加，至24 h達到高峰，說明腦缺血再灌注后腦水腫逐漸加重。水通道蛋白4 AQP4是水通道蛋白家族中的一員，AQP4對水分子有高通透性，是腦內(nèi)調(diào)控水分子進出的重要的水通道蛋白［9-10］。腦缺血再灌注后腦水腫的發(fā)生與AQP-4的表達及其在血管周邊的分布變化密切相關(guān)［11］。有研究表明［11-12］，在缺血再灌注早期(6 h)，AQP4蛋白表達及其在血管周邊的密度均升高，而在缺血再灌注24 h后，雖然其總蛋白的表達進一步上升，但其在血管周邊的分布卻明顯下降，直接影響了水腫的消散，造成腦缺血后腦腫脹的加劇。本研究結(jié)果表明，缺血再灌注后6 h和24 h腦水含量的變化支持這一理論，但具體機制還需進一步研究。

有研究表明［12］，在再灌注6 h，電針組AQP4在血管周邊的密度減少，而在再灌注后24 h，電針組的AQP4在血管周邊的密度顯著升高。由此推測，電針干預(yù)能減緩早期細胞性水腫的生成，促進了晚期水腫的消散。本實驗發(fā)現(xiàn)，電針預(yù)處理后雖不能完全控制腦水腫，但可以在缺血再灌注后6 h、24 h明顯降低腦組織含水量，減輕腦水腫，表明電針預(yù)處理能顯著減少大鼠腦缺血再灌注后腦組織含水量，減輕再灌注后腦水腫的程度，對腦組織具有保護作用。電針預(yù)處理對AQP-4分布的影響在多大程度上參與了電針的抗缺血再灌注損傷，還需進一步的深入研究。

有研究報道［6］，缺血再灌注后腦水腫和血糖升高是相輔相成的。本實驗中觀察到大鼠血糖在再灌注后2 h升高，腦組織含水量在再灌注后6 h升高，血糖升高較腦水腫早發(fā)生，這也說明高血糖可能促進了腦水腫的發(fā)生，腦缺血再灌注晚期腦水腫達到高峰可能又促進了血糖升高。

本研究顯示，電針預(yù)處理能夠顯著降低腦缺血再灌注后大鼠出現(xiàn)的高血糖，同時可以降低腦組織的含水量，從而減輕腦缺血再灌注損傷，實現(xiàn)對中樞神經(jīng)元的保護作用。這一初步研究結(jié)果具有一定的臨床應(yīng)用前景，其具體機制尚待進一步揭示。

［1］ Zhou F，Guo J，Cheng J，et al.Electroacupuncture increased cerebral blood flow and reduced ischemic brain injury:dependence on stimulation intensity and frequency ［J］.J Appl Physiol，2011，111(6):1877-1887.

［2］ Zhang F，Wu Y，Jia J.Electro-acupuncture can alleviate the cerebral oedema of rat after ischemia［J］.Brain Inj，2011，25(9):895-900.

［3］ Xiong L，Lu Z，Hou L，et al.Pretreatment with repeated electroacupuncture attenuates transient focal cerebral ischemic injury in rats［J］.Chin Med J(Engl)，2003，116(1):108-111.

［4］ Brambrink AM，Koerner IP，Diehl K，et al.The antibiotic erythromycin induces tolerance against transient global cerebral ischemia in rats(pharmacologic preconditioning)［J］.Anesthesiology，2006，104:1208-1215.

［5］ Zhou Q，Cao B，Niu L，et al.Effects of permissive hypercapnia on transientglobalcerebralischemiareperfusion injury in rats［J］.Anesthesiology，2010，112:288-297.

［6］ Lam AM，Winn HR，Cullen BF，et al.Hyperglycemia and neurological outcome in patients with head injury［J］.J Neurosurg，1991，75:545-551.

［7］ Hamill RW， WoolfPD， McDonaldJV， etal.Catecholamines predict outcome in traumatic brain injury ［J］.Ann Neurol，1987，21(5):438-443.

［8］ Pentelenyi T，Kammerer L.Alterations of the serum cortisol and blood glucose in brain-injured patients［J］.Injury，1984，15(6):397-402.

［9］ Zelenina M，Zelenin S，Aperia A.Water channels(aquaporina)and their role for postnatal adaptation［J］.Pediatr Res，2005，57(5Pt 2):47R-53R.

［10］ Manley GT，Binder DK，Papadopoulos MC，et a1.New insights intowater transport and edema in the central nervous system from phenotype analysis of aquaporin-4 null mice［J］.Neuroscience，2004，129:983-991.

［11］ Ribeiro Mde C，Hirt L，Bogousslavsky J，et al.Time course of aquaporin expression after transient focal cerebral ischemia in mice［J］.J Neurosci Res，2006，83(7):1231-1240.

［12］ 任清瀟，楊帆，彭擁軍，等.電針影響大鼠腦缺血再灌注后水通道蛋白4(AQP4)的表達及其在血管周邊的分布［J］.復(fù)旦學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2012，39(6):594-599.