反復(fù)丙泊酚麻醉對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響

秦曉菁，張曉慶

(同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院麻醉科，上海 200065)

丙泊酚(propofol)，是一種起效快，蘇醒迅速，持續(xù)輸注后無蓄積作用的短時(shí)效全身麻醉藥。臨床上，丙泊酚常用以手術(shù)前麻醉誘導(dǎo)、術(shù)中麻醉維持及術(shù)后的ICU鎮(zhèn)靜。

研究［2］顯示，應(yīng)用較大麻醉劑量的丙泊酚不僅可產(chǎn)生逆行性遺忘，同時(shí)也對(duì)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶功能有所影響。當(dāng)腹腔注射低于鎮(zhèn)靜劑量的丙泊酚后，記憶能力受損［3］，靜脈注射鎮(zhèn)靜劑量的丙泊酚后，損傷老年大鼠的術(shù)后認(rèn)知功能［4］。許繼元等［5］的研究顯示，注射鎮(zhèn)靜劑量后，雖影響學(xué)習(xí)記憶功能，但停藥后又迅速消失。因此，對(duì)于不同劑量的丙泊酚對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響，及影響的時(shí)效性及劑量依賴性仍取決于多方因素的調(diào)控，有待更為全面詳盡的基礎(chǔ)研究。此外，丙泊酚在腦細(xì)胞促凋亡及海馬突觸可塑性改變方面的作用［6］，是學(xué)習(xí)記憶功能的神經(jīng)生物基礎(chǔ)。

本研究使用Morris水迷宮，對(duì)多次注射不同劑量丙泊酚的成年SD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能進(jìn)行檢測(cè)，并通過Bax抗體染色進(jìn)行細(xì)胞凋亡反應(yīng)的測(cè)定，同時(shí)觀測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞及突觸超微結(jié)構(gòu)的變化，探討不同劑量的丙泊酚連續(xù)注射，對(duì)成年SD大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能的可能影響及是否存在劑量依賴性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF級(jí)7周齡雄性SD大鼠32只，常規(guī)飼養(yǎng)1周(實(shí)驗(yàn)時(shí)為8周齡)，體質(zhì)量250～270 g。將大鼠隨機(jī)分為4組，每組8只，分別為:鎮(zhèn)靜劑量丙泊酚組(Prop 5組)、低劑量丙泊酚組(Prop 20組)、高劑量丙泊酚組(Prop 30組)和10%脂肪乳劑組(Lip組)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 給藥方法 丙泊酚的3個(gè)劑量組，均采用15 mg/kg的丙泊酚作為誘導(dǎo)劑量。之后，Prop 5組、Prop 20 組和Prop 30 組分別以5、20、30 mg/(kg·h)的劑量維持麻醉2 h;Lip組首先給予15 mg/kg的脂肪乳劑，之后脂肪乳劑維持輸注量與Prop 30等毫升數(shù)。所有藥物經(jīng)大鼠尾靜脈注射，每日給藥1次，連續(xù)5 d。第6天起，進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)(定位航行實(shí)驗(yàn)及空間探索實(shí)驗(yàn))。

1.2.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法 開始正式行為學(xué)實(shí)驗(yàn)前，將大鼠置于Morris水迷宮不含平臺(tái)的水池中，自由游泳1 min左右，以適應(yīng)環(huán)境，繼而行定位航行實(shí)驗(yàn)。從離平臺(tái)最遠(yuǎn)象限(本實(shí)驗(yàn)中即為左上象限)，將大鼠背對(duì)平臺(tái)投入水中，計(jì)時(shí)120 s。若找到平臺(tái)(本實(shí)驗(yàn)中為右下象限)，讓其停留在平臺(tái)上;若規(guī)定時(shí)間內(nèi)未尋找到平臺(tái)，引導(dǎo)其上平臺(tái)，停留20 s。大鼠每天訓(xùn)練2次，記錄尋找平臺(tái)的時(shí)間，即潛伏期(在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，未找到平臺(tái)，按120 s計(jì)算)。第10天，行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤去隱匿平臺(tái)，按同一入水位置，投入水中，記錄60 s內(nèi)大鼠的游行軌跡、穿越平臺(tái)的次數(shù)及第1次穿越平臺(tái)的時(shí)間。

1.3 石蠟、電鏡標(biāo)本制作

空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，每組隨機(jī)取6只大鼠，用10%水合氯醛腹腔麻醉(0.35 mg/kg)。開胸后暴露心臟，經(jīng)左心室灌注生理鹽水約100 ml后，制作石蠟標(biāo)本的大鼠以4%多聚甲醛(pH 7.4)灌注，持續(xù)約15 min。制作電子顯微鏡標(biāo)本的大鼠灌注4%多聚甲醛－1%戊二醛固定液(pH 7.4)100 ml。大鼠灌流固定后，分別斷頭取腦，參照大鼠立體定位圖譜，取視交叉后5 mm至小腦前的腦組織塊。用以制作石蠟標(biāo)本的組織經(jīng)乙醇梯度脫水，二甲苯透明后石蠟包埋，用于后期H-E染色和免疫組織化學(xué)法染色。用于免疫組織化學(xué)法染色的組織，需在取材48 h內(nèi)制成蠟塊。用于制作電子顯微鏡標(biāo)本的組織置于蠟板上，剝離海馬組織，取4～5粒1 mm3的海馬組織塊，放入4℃含戊二醛的固定液中，固定至少2 h后備用。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS 14.0軟件處理，行為學(xué)數(shù)據(jù)由Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)直接獲得，為計(jì)量資料，以x±s表示，t檢驗(yàn)、單因素方差分析進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在定位航行實(shí)驗(yàn)中，不同劑量的丙泊酚各組，潛伏期均長(zhǎng)于Lip組。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示:Prop 5組第2天的潛伏期有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，Prop 20和Prop 30組在第2、3天內(nèi)的潛伏期明顯長(zhǎng)于Lip組(P＜0.05)。在同一時(shí)間點(diǎn)，隨丙泊酚濃度的增加，潛伏期延長(zhǎng)(P＜0.05)，見表1。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，Prop 20組及Prop 30組的穿越平臺(tái)次數(shù)和首次穿越平臺(tái)時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);4組組間活動(dòng)總路程，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2、圖1。

表1 大鼠連續(xù)4 d定位航行實(shí)驗(yàn)潛伏期Tab.1 Latency in place navigate test in four groups(±s)

表1 大鼠連續(xù)4 d定位航行實(shí)驗(yàn)潛伏期Tab.1 Latency in place navigate test in four groups(±s)

與 Lip組相比，(1)P ＜0.05;丙泊酚三組組內(nèi)比較，(2)P＜0.05

組別 第1天 第2天 第3天 第4天Lip 組 103.79 ±8.49 48.23 ±4.12 34.75 ±3.62 16.58 ±4.43 Prop 5 組 109.13 ±7.95 76.35 ±5.82(1)54.83 ±6.53(2) 30.17 ±5.48(2)Prop 20 組115.44 ±5.29 85.25 ±4.79(1)60.69 ±4.46(1)(2)33.43 ±6.54(1)(2)Prop 30 組117.58 ±5.58 92.83 ±4.24(1)69.42 ±3.81(1)(2)38.35 ±4.32(1)(2)

表2 大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of spatial probe test in four groups(±s)

表2 大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of spatial probe test in four groups(±s)

與 Lip組相比，(1)P ＜0.05

組別 第1次穿越平臺(tái)時(shí)間/s穿越原平臺(tái)次數(shù) 總路徑/mm Lip 組 15.15 ±2.47 3.08 17 821.25 Prop 5 組 18.53 ±2.12 2.45 19 357.13 Prop 20 組 23.29 ±3.57(1) 2.20(1) 20 371.38 Prop 30 組 27.36 ±3.84(1) 1.85(1) 21 167.94

圖1 空間探索軌跡圖Fig.1 Trajectories of spatial probe tests in four groups

2.2 H-E及免疫組化染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果

觀察4組大鼠海馬CA1區(qū)H-E染色切片，低倍顯微鏡下，丙泊酚3組海馬組織，與Lip組比較，均未見明顯差異，各組染色均勻，結(jié)構(gòu)清晰，見圖2。使用Bax抗體染色后，Prop 20及Prop 30組，光學(xué)顯微鏡下染色呈現(xiàn)棕黃色顆粒，位于細(xì)胞漿內(nèi)(如箭頭所示)，有凋亡細(xì)胞顆粒產(chǎn)生。而Lip組和鎮(zhèn)靜劑量丙泊酚組無凋亡細(xì)胞顆粒產(chǎn)生，見圖3。

圖2 4組海馬組織H-E常規(guī)病理染色結(jié)果Fig.2 Results of H-E staining of cerebral hippocampus in four groups(×40)

2.3 透射電鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

電子顯微鏡下觀察4組海馬組織CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)，Lip組海馬組織、神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)無明顯變化。Prop 5組，海馬神經(jīng)細(xì)胞胞體輕度腫脹，突觸前膜囊泡不致密;Prop 20組，胞體腫脹，外緣有分離趨勢(shì);Prop 30組，細(xì)胞體嚴(yán)重腫脹，并且高倍鏡下可見個(gè)別神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)有自噬現(xiàn)象(如箭頭所示)，見圖4。

圖3 4組海馬組織Bax抗體免疫組織化學(xué)法染色結(jié)果Fig.3 Immunohistochemical staining of Bax expression in four groups(×40)

圖4 四組海馬組織CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)電鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Ultrastructural changes of hippocampal CA1 neurons

3 討 論

海馬組織作為大腦邊緣系統(tǒng)的主要部分，參與學(xué)習(xí)與記憶條件反射的形成。既往報(bào)道大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能與海馬組織有密切關(guān)系［6-7］。尤其是海馬神經(jīng)的突觸可塑性，被認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)［8］。突觸可塑性與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、損傷后的修復(fù)及學(xué)習(xí)記憶等重要腦功能的完成密切相關(guān)，在條件刺激下誘發(fā)的突觸傳遞功能的長(zhǎng)時(shí)程改變，即是長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation，LTP)，而突觸囊泡與突觸前膜的融合，是突觸傳遞的基礎(chǔ)［9］。

本實(shí)驗(yàn)在SD大鼠成年期，每日使用不同劑量的丙泊酚鎮(zhèn)靜、麻醉，連續(xù)5 d。后選用Morris水迷宮行大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)，觀察海馬組織細(xì)胞及突觸的超微結(jié)構(gòu)變化。定位航行實(shí)驗(yàn)顯示，丙泊酚各組潛伏期均長(zhǎng)于脂肪乳劑組，Prop 20和Prop 30組在第2天、第3天內(nèi)的潛伏期明顯長(zhǎng)于Lip組(P＜0.05)。表明丙泊酚對(duì)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能的影響較明顯。本實(shí)驗(yàn)中，在同一時(shí)間點(diǎn)，隨著丙泊酚濃度的增加，潛伏期明顯延長(zhǎng)(P＜0.05)。脂肪乳劑作為溶劑對(duì)照，排除了因溶劑因素可能導(dǎo)致的影響。隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，脂肪乳劑及丙泊酚各組大鼠的尋找平臺(tái)潛伏期均逐漸縮短(P＜0.05)，這一現(xiàn)象符合學(xué)習(xí)記憶的一般規(guī)律［10-11］。第4天時(shí)，由于經(jīng)過3 d的訓(xùn)練，強(qiáng)化了記憶，因此各組間差別已不明顯。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，低劑量及高劑量組的穿越平臺(tái)次數(shù)和首次穿越平臺(tái)時(shí)間，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，隨著濃度增加，首次穿越時(shí)間延長(zhǎng)，穿越次數(shù)減少。丙泊酚對(duì)大鼠的空間記憶功能產(chǎn)生抑制作用，并且呈劑量依賴性。

在細(xì)胞凋亡過程中，Bcl基因家族的表達(dá)蛋白具有重要作用，其中Bax基因表達(dá)的蛋白則具有促凋亡的作用。本實(shí)驗(yàn)選用凋亡因子Bax測(cè)定實(shí)驗(yàn)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。經(jīng)Bax抗體染色后，Prop 20組和Prop 30組海馬組織有棕黃色凋亡顆粒。而Lip組和Prop 5組沒有棕黃色凋亡顆粒。提示鎮(zhèn)靜劑量的丙泊酚無明顯的促細(xì)胞凋亡作用，麻醉劑量的丙泊酚則表現(xiàn)為明顯的促進(jìn)海馬細(xì)胞的凋亡反應(yīng)，從而對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能產(chǎn)生明顯抑制。既往研究［2，4］顯示，腹腔單次注射麻醉劑量丙泊酚，導(dǎo)致鼠的學(xué)習(xí)記憶功能短暫受損;雖鎮(zhèn)靜劑量的丙泊酚也會(huì)影響老鼠學(xué)習(xí)記憶功能，但停藥后1 d即迅速消失。由此可見，鎮(zhèn)靜劑量下的丙泊酚或單次注射麻醉劑量丙泊酚，對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能的損傷是短暫的。本實(shí)驗(yàn)中，通過反復(fù)多次丙泊酚鎮(zhèn)靜及麻醉，發(fā)現(xiàn)丙泊酚對(duì)海馬細(xì)胞的凋亡反應(yīng)有促進(jìn)作用，并隨著劑量的增加，損傷更明顯，即呈現(xiàn)劑量依賴性。

研究［12］證實(shí)海馬腦片LTP的形成能被丙泊酚抑制，丙泊酚對(duì)海馬LTP的抑制作用呈劑量依賴性，其機(jī)制可能與影響突觸體的谷氨酸、γ-氨基丁酸和5-羥色胺釋放有關(guān)［13］。國(guó)外類似研究［14］采用連續(xù)酶標(biāo)熒光法測(cè)定結(jié)果表明，丙泊酚呈劑量依賴性地抑制鼠大腦皮層突觸體谷氨酸的釋放，最終抑制大腦皮層和海馬LTP的形成。

本實(shí)驗(yàn)通過透射電鏡觀察到，Lip組海馬結(jié)超微構(gòu)無明顯異常。而丙泊酚各組的海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)存在不同程度的改變。Prop 5組神經(jīng)細(xì)胞輕度腫脹，突觸前膜囊泡較疏松、不致密;Prop 20組胞體腫脹，細(xì)胞外緣有分離的趨勢(shì)，對(duì)受體傳導(dǎo)通路可能造成了影響;Prop 30組海馬神經(jīng)元細(xì)胞胞體嚴(yán)重腫脹，細(xì)胞間分離，突觸前膜囊泡疏松，并且高倍鏡下可見個(gè)別神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)已存在自噬現(xiàn)象?？梢?，隨著丙泊酚劑量的增加，海馬神經(jīng)元細(xì)胞及突觸的改變愈加明顯。

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