養(yǎng)陰生肌膜對大鼠實驗性口腔潰瘍的治療作用?

李喜香，禚 君，豆金彥，劉軍剛，高小恒，黃清杰

(甘肅省中醫(yī)院，蘭州 730050)

口腔潰瘍是常見的口腔黏膜疾病，發(fā)病率為20%[1]，表現(xiàn)為口腔灼燒痛、潰爛，呈周期性、游走性反復(fù)發(fā)作難于治愈，直接影響患者的進(jìn)食、吞咽和說話等日常生活。其潰瘍面成圓形或卵圓形，凹陷且周圍充血，創(chuàng)面刺激引發(fā)疼痛，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對其尚無較好的治療方法。研究發(fā)現(xiàn)[2]，免疫功能紊亂是口腔潰瘍發(fā)生的最重要原因，感染、遺傳、微量元素(鋅、鐵)和維生素VitB12缺乏、口腔黏膜局部微循環(huán)障礙和精神神經(jīng)功能紊亂等諸多因素均可導(dǎo)致該病的發(fā)生和加重。養(yǎng)陰生肌膜是對養(yǎng)陰生肌散劑型改造而制得的膜劑[3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)陰生肌膜對口腔潰瘍模型大鼠具有一定的治療作用[4]。本文進(jìn)一步研究養(yǎng)陰生肌膜對大鼠實驗性口腔潰瘍的治療作用，并探討其作用機(jī)理。

1 材料

1.1 動物

SD大鼠140只，SPF級，雌雄各半，體質(zhì)量200±20 g,由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實驗中心提供(合格證號SCXK(甘)2011-0004)。

1.2 藥品與試劑

養(yǎng)陰生肌膜，甘肅省中醫(yī)院制劑中心；苯酚，天津市天驕制藥有限公司(批號000126)；乙醚，天津市中建化工有限公司(批號20120106)；甲醛，上海金泓化工有限公司(批號20110925)。大鼠TNF-a酶聯(lián)免疫試劑盒、IL-2酶聯(lián)免疫試劑盒，均由南京建成生物制品有限公司提供(批號20130902-01)。

1.3 主要儀器

電子天平(德國sartorius)，TGL-16G高速低溫離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)， OLMPUS顯微鏡(奧林帕斯公司出品)，大恒細(xì)胞分析系統(tǒng)(中國大恒集團(tuán)有限公司)，TEC5組織包埋機(jī)(北京怡康勇佳科技有限責(zé)任公司)，全自動密閉式組織脫水機(jī)(北京怡康勇佳科技有限責(zé)任公司)，RM2135石蠟切片機(jī)(德國Leica 公司)，SP-Max 2300A酶標(biāo)儀(上海閃譜生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 模型復(fù)制

取大鼠84只，隨機(jī)預(yù)留14只為空白對照組，其余大鼠參考文獻(xiàn)[5]并改進(jìn)方法，用醫(yī)用乙醚吸入麻醉，取一直徑為5 mm的塑料管，將小棉球(約20 mg)用30 μL 95% 的苯酚溶液浸透后置于塑料管一端(與塑料管管口取平)，將塑料管置于麻醉大鼠左側(cè)頰黏膜上，保留60 s，用生理鹽水清洗灼燒面。24 h 后觀察，左側(cè)實驗區(qū)形成直徑約3 mm的圓形潰瘍，表面有黃白色膿腫，與周邊分界明顯，周圍黏膜紅腫充血，表明模型復(fù)制成功。

2.2 分組與給藥

將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型對照組、陽性對照組(氯已定地塞米松口腔潰瘍膜)、養(yǎng)陰生肌膜高、中、低劑量組5組，每組14只。空白對照組正常飲食飼養(yǎng)，不做任何干預(yù)；模型對照組每日1次給予生理鹽水沖洗；其余各組分別進(jìn)行藥物干預(yù)，乙醚吸入麻醉后，將藥膜貼于潰瘍面處，保持5 min，直至藥膜溶化后，生理鹽水沖洗。陽性對照組給予5×5 mm2復(fù)方氯已定地塞米松膜，養(yǎng)陰生肌膜高、中、低劑量組分別給予5×5 mm2養(yǎng)陰生肌膜(按文獻(xiàn)[3]制備，每25 mm2分別含藥78.6、39.3、19.6 mg)，給藥后1 h內(nèi)禁食禁水，每日給藥1次，連續(xù)8 d。

2.3 觀察指標(biāo)及檢測方法

2.3.1 潰瘍面[6]造模后每日觀察大鼠潰瘍面基本形態(tài)，測量潰瘍面直徑，于給藥第2、4、6、8天用透明玻璃紙描記潰瘍面，用 Image-pro Plus 圖像分析軟件測量其面積大小。

2.3.2 平均愈合速度 每日拍照記錄大鼠潰瘍面愈合情況，記錄每只大鼠潰瘍完全愈合時間，計算各組平均愈合時間及平均愈合速度。平均愈合速度( mm2/d)=潰瘍面積(mm2)/愈合時間(d)。

2.3.3 血清TNF-a 和 IL-2 含量 末次給藥后1 h，各組大鼠麻醉后腹主動脈采血，4 ℃靜置2 h后，3000 r/min離心15 min，取上清液，按試劑盒操作步驟分別測定血清TNF-a 和 IL-2 含量。

2.3.4 組織病理學(xué)檢查 第4天和第8天給藥后1 h，隨機(jī)抽取各組大鼠4只，麻醉后剪取潰瘍部位組織，用無菌生理鹽水沖洗，4%中性多聚甲醛固定，梯度脫水，石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 養(yǎng)陰生肌膜對潰瘍愈合面積的影響

表1顯示，與模型對照組比較，給藥第4、6、8天養(yǎng)陰生肌膜高、中劑量組的潰瘍面積縮小明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表1 大鼠口腔潰瘍面積變化情況

注：與模型對照組比較:**P<0.01，*P<0.05

3.2 養(yǎng)陰生肌膜對口腔潰瘍平均愈合時間及速度的影響

表2顯示，與模型對照組比較，養(yǎng)陰生肌膜高、中劑量組大鼠口腔潰瘍平均愈合時間明顯縮短，平均愈合速度明顯加快，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。

表2 潰瘍平均愈合時間及速度比較

注：與模型對照組比較：**P<0.01，*P<0.05

3.3 養(yǎng)陰生肌膜對血清TNF-a 和 IL-2 水平的影響

表3顯示，與空白對照組比較，模型對照組血清 TNF-α水平明顯升高，血清IL-2水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)；與模型對照組比較，養(yǎng)陰生肌膜高、中劑量組血清TNF-α明顯降低，IL-2 水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

3.4 組織病理學(xué)改變

給藥第4天，空白對照組大鼠口腔黏膜形態(tài)正常，未見組織壞死和上皮細(xì)胞缺損，未見充水和炎性細(xì)胞浸潤；模型對照組病灶區(qū)多見組織壞死，表層鱗狀上皮缺失，滲出物多，固有層及肌層組織明顯充血水腫，大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、吞噬細(xì)胞浸潤；陽性對照組病灶區(qū)表層上皮及固有層壞死，大量炎細(xì)胞浸潤，新生的肉芽組織形成，血管豐富，肌層可見肌細(xì)胞變性、壞死，部分肌纖維增粗，肌細(xì)胞核內(nèi)移；養(yǎng)陰生肌膜高劑量組病灶區(qū)表層上皮壞死缺失，滲出物多，組織水腫明顯，大量炎細(xì)胞浸潤。固有層淺層壞死，新生肉芽組織形成，血管豐富；中劑量組程度較重；低劑量組病灶區(qū)大片組織壞死明顯，表層上皮缺失，滲出物多，固有層及肌層組織明顯充血水腫，大量炎細(xì)胞浸潤(見圖1)。

表3 養(yǎng)陰生肌膜對血清TNF-α、IL-2水平的影響

注：與空白對照組比較：##P<0.01，#P<0.05；與模型對照組比較：**P<0.01，*P<0.05

圖1 給藥第4 d各組大鼠口腔黏膜組織病理學(xué)變化

給藥第8天，空白對照組大鼠口腔黏膜形態(tài)正常，模型對照組病灶區(qū)新生上皮組織部分處于分離狀態(tài)，尚未完全覆蓋，滲出物基本消失，固有層中肉芽組織仍較豐富，炎細(xì)胞浸潤，可見中性粒細(xì)胞、纖維母細(xì)胞增生。肌層中肌細(xì)胞核大、淡染，處于增生階段。組織中血管較大，血細(xì)胞較多；陽性對照組和養(yǎng)陰生肌膜高劑量組病灶區(qū)新生上皮組織完整覆蓋，肉芽組織已轉(zhuǎn)化為瘢痕組織，肌肉層修復(fù)完全，未見炎細(xì)胞；中劑量組病灶區(qū)新生上皮組織完全覆蓋，固有層為瘢痕組織，血管減少，纖維母細(xì)胞增生，膠原纖維豐富，肌層修復(fù)完整；低劑量組新生上皮組織尚未完全覆蓋，固有層中炎細(xì)胞浸潤明顯，血管較多，肉芽組織仍存在，纖維母細(xì)胞增生，可見肥大細(xì)胞。肌層肌纖維粗細(xì)不一，仍處于增生階段(見圖2)。

圖2 給藥第8天各組大鼠口腔黏膜組織病理學(xué)變化

4 討論

細(xì)胞因子在復(fù)發(fā)性口腔潰瘍(recurrent oral ulcer，ROU)發(fā)病炎癥損傷及其抗炎修復(fù)中具有非常重要的意義[7]。機(jī)體受到侵襲時，釋放炎癥因子引起炎癥反應(yīng)，同時產(chǎn)生一系列抗炎因子，以維持機(jī)體的平衡穩(wěn)態(tài)，能有效減少ROU的復(fù)發(fā)，減輕患者的痛苦。白細(xì)胞介素、干擾素、TNF-β、生長因子、集落刺激因子等的表達(dá)，其他一些外界、機(jī)體的因素都可能會影響 ROU 的發(fā)生發(fā)展，TNF-α 和 IL-2 表達(dá)水平的改變對 ROU 有一定的療效[8]。TNF-α 是ROU發(fā)病中很重要的損傷性細(xì)胞因子之一[8，9]，炎性細(xì)胞所分泌的 TNF-α 能進(jìn)一步損傷組織，放大炎癥反應(yīng)。因此抑制 TNF-α 的合成、分泌，能有效地抑制局部炎癥反應(yīng)。IL-2 可以有效改善 ROU 患者的細(xì)胞免疫功能，是促進(jìn) T 細(xì)胞由 G1 期進(jìn)入 S 期最重要的細(xì)胞因子，并具有促進(jìn) B 細(xì)胞增殖、分化、合成抗體，誘導(dǎo)許多細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞因子受體表達(dá)等生物學(xué)功能，同時 IL-2 受體的表達(dá)可活化外周血淋巴細(xì)胞，調(diào)節(jié)復(fù)發(fā)性口腔潰瘍患者 IL-2 的血漿水平，增強(qiáng)口腔黏膜抵抗病原微生物的能力，促進(jìn)潰瘍面的愈合。養(yǎng)陰生肌膜能顯著降低 TNF-α 水平，同時也能明顯提高 IL-2水平。本研究結(jié)果表明，養(yǎng)陰生肌膜組大鼠口腔潰瘍上皮細(xì)胞損傷減輕，直徑明顯縮小，癥狀明顯緩解，這可能與TNF-α、IL-2水平的改變有關(guān)。

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