雷公藤甲素治療胰腺癌分子機制的生物信息學(xué)分析?

車玉梅，何小鵑, 李 立，徐 潔，王敏智，呂愛平，馬超英

(1.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610031；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100700)

胰腺癌(Pancreatic cancer，PC)致死率位居惡性腫瘤第四位，其平均存活期只有5～6個月，5年生存率不足6%[1]，目前臨床一線化療藥物吉西他濱或其與順鉑、奧沙利鉑、5-氟、卡培他濱、伊立替康、多烯紫杉醇聯(lián)合用藥，均無法有效延長患者的生存期(僅有6～10個月)[2]。腫瘤耐藥[3]和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[4]是導(dǎo)致胰腺癌臨床化療失敗的主要原因。TP(Triptolide, TP)是傳統(tǒng)中草藥雷公藤的主要活性成分，研究表明TP是一種廣譜抗癌藥，具有多重抗癌機制，其抗癌活性比傳統(tǒng)抗癌藥物紫杉醇、多柔比星、絲裂霉素、順鉑更強[5]。體外研究顯示，TP能夠有效誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤血管形成和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[6, 7]。體內(nèi)研究表明，TP可有效減少小鼠體內(nèi)胰腺癌細(xì)胞，是非常有潛力的抗胰腺癌候選藥[8]。為探討TP治療胰腺癌的作用機制，我們嘗試運用生物信息學(xué)方法分析二者的分子網(wǎng)絡(luò)、生物學(xué)經(jīng)典通路和作用位點，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 靶蛋白及相關(guān)基因的檢索

在PubChem(http:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中查找TP(Triptolide)的分子信息及相應(yīng)的生物學(xué)測試，進而確定該化合物的活性靶蛋白。以“Pancreatic Cancer”為關(guān)鍵詞，在Gene(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)數(shù)據(jù)庫中查找胰腺癌的相關(guān)基因。

1.2 構(gòu)建TP及胰腺癌的分子網(wǎng)絡(luò)

將檢索到的TP對應(yīng)靶蛋白及胰腺癌相關(guān)基因，在線提交至IPA(Ingenuity Pathway Analysis http://www.ingenuity.com/)生物分析軟件。利用IPA軟件中的網(wǎng)絡(luò)分析(Network analysis)功能，分別構(gòu)建TP靶蛋白及胰腺癌相關(guān)基因的分子網(wǎng)絡(luò)。

1.3 對比TP靶蛋白及胰腺癌相關(guān)基因共同作用的生物學(xué)通路及作用位點

利用IPA軟件中比較(Comparison)模塊，比較TP對應(yīng)的靶蛋白及胰腺癌的生物學(xué)通路，并選取二者共同作用的通路進行深入研究，分析二者在共同作用的生物學(xué)通路中的位點，明確TP治療胰腺癌的分子機制。

2 結(jié)果

2.1 TP的靶蛋白及胰腺癌相關(guān)基因

截止2013年9月26日，在PubChem數(shù)據(jù)庫中查到TP的靶蛋白共11個，在Gene數(shù)據(jù)庫中查到胰腺癌相關(guān)基因288個，隨后將這些分子上傳至IPA軟件。

2.2 TP靶蛋白及胰腺癌相關(guān)基因的分子網(wǎng)絡(luò)

將檢索到的TP靶蛋白及胰腺癌相關(guān)基因上傳至IPA軟件，利用網(wǎng)絡(luò)分析功能構(gòu)建二者的分子網(wǎng)絡(luò)，其中雷公藤靶蛋白共構(gòu)建2個功能不同的網(wǎng)絡(luò)，胰腺癌相關(guān)基因共構(gòu)建23個功能不同的網(wǎng)絡(luò)(選擇前3個進行展示)(表1A、B)。網(wǎng)絡(luò)圖中，每個節(jié)點代表1個分子，圖中灰色的分子為TP的靶蛋白或胰腺癌相關(guān)基因，未涂色的分子為構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)所需的相關(guān)分子。圖注說明不同形狀分子的分類屬性，實線代表2個分子間直接的作用關(guān)系，虛線代表2個分子間接的作用關(guān)系。

表1 TP靶蛋白及胰腺癌相關(guān)基因構(gòu)成的分子網(wǎng)絡(luò)圖及網(wǎng)絡(luò)功能

ATP靶蛋白(灰色分子)構(gòu)成的分子網(wǎng)絡(luò)及功能

B胰腺癌靶蛋白(灰色分子)構(gòu)成的分子網(wǎng)絡(luò)圖

從二者構(gòu)成的分子網(wǎng)絡(luò)圖中我們可以看出，構(gòu)成TP靶蛋白網(wǎng)絡(luò)的分子，大多與細(xì)胞信號傳導(dǎo)和相互作用、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、細(xì)胞發(fā)育以及凋亡有關(guān)；胰腺癌相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)中的分子，大多與細(xì)胞周期、細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞生長和增殖以及凋亡有關(guān)，說明二者構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)既有共同的分子又有差異的分子，各自的生物功能復(fù)雜多樣。

2.3 生物學(xué)通路比較

通過IPA軟件的Comparison Analysis模塊，對比TP靶蛋白和胰腺癌相關(guān)基因作用的生物學(xué)通路，我們發(fā)現(xiàn)二者共同作用的通路超過20條，對其通路進行分類，其中2類通路與癌癥相關(guān)，分別為凋亡相關(guān)通路(圖2)、癌癥信號相關(guān)通路(圖3)。在凋亡相關(guān)通路中，主要涉及神經(jīng)酰胺信號通路、IL-15生成通路、IL-15信號通路及JAK/Stat信號通路；癌癥信號相關(guān)通路主要涉及胰腺癌信號通路、組織因子調(diào)控通路、PI3K/AKT信號通路、結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移信號通路、腫瘤分子調(diào)控5個信號通路。以上結(jié)果提示，TP主要作用于凋亡通路和癌癥信號通路，且通過調(diào)節(jié)這些通路進而對胰腺癌產(chǎn)生療效。

圖2 TP靶蛋白及胰腺癌相關(guān)基因共同作用的凋亡通路

圖3 TP靶蛋白及胰腺癌相關(guān)基因共同作用的癌癥信號通路

2.4 生物通路作用位點

為明確TP靶蛋白及胰腺癌相關(guān)基因參與以上共同通路的作用位點，基于以上結(jié)果我們選取了神經(jīng)酰胺信號通路、胰腺癌信號通路、PI3K/AKT信號通路、抑瘤素M信號通路進行深入分析(見圖4A、B、C、D)。圖中涂灰分子為胰腺癌在通路的作用位點，粗邊分子為TP在通路的作用位點?？梢园l(fā)現(xiàn)，粗邊且涂灰標(biāo)記的JAK為TP參與胰腺癌的癌癥相關(guān)通路作用位點。

圖4 TP靶蛋白及胰腺癌相關(guān)基因共同作用的生物學(xué)通路作用位點

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為胰腺癌多為實證，其常見證型為氣滯血瘀證、濕熱蘊結(jié)/濕熱毒蘊證、脾虛濕熱/濕困、陰虛(含陰虛內(nèi)熱、氣陰兩虛)，多認(rèn)為病位在脾(脾胃)，其次為肝(肝膽)[9]。雷公藤為衛(wèi)矛科植物，傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為其歸屬于祛風(fēng)濕藥，有祛風(fēng)除濕之功效[10]。TP是雷公藤的主要藥效成分，是環(huán)氧化二萜內(nèi)酯化合物，具有廣泛、強效的藥理作用：具有廣譜、強效的抗腫瘤活性，對來源于白血病、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌等諸多癌癥細(xì)胞有強效的殺傷作用；TP可抑制促炎因子和趨化因子的產(chǎn)生，其抗炎作用已經(jīng)在多種細(xì)胞模型和動物模型中被證實；可通過直接抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生并持續(xù)上調(diào)IL-1治療滑膜成纖維細(xì)胞中抑制水平，治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫疾病。已有研究表明，TP通過凋亡途徑(死亡受體途徑和線粒體途徑)和自噬途徑引起胰腺癌細(xì)胞程序性死亡[6]，此外TP可顯著抑制小鼠體內(nèi)胰腺癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移[11]。目前，對TP治療胰腺癌的深入研究正在開展。

Pubchem是由NIH(美國國立衛(wèi)生研究院)運行的小分子生物活性綜合數(shù)據(jù)庫，其中包含眾多對化學(xué)物質(zhì)的活性測定數(shù)據(jù)。國內(nèi)已有學(xué)者利用該數(shù)據(jù)庫進行研究，同時結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)，利用IPA軟件將疾病相關(guān)基因與化合物的活性靶標(biāo)進行網(wǎng)絡(luò)擬合與交互，可以探索化合物對疾病治療的潛在靶點，國內(nèi)外已有相關(guān)研究發(fā)表[12, 13]。

本研究結(jié)果顯示，TP的靶蛋白和胰腺癌相關(guān)基因構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)、分子之間相互聯(lián)系與作用，生物功能復(fù)雜。在胰腺癌的發(fā)病過程中，溶血磷脂酸及其對應(yīng)GPCR-EDG可以誘發(fā)細(xì)胞功能改變，如誘導(dǎo)細(xì)胞分化、存活、抗藥和運動能力[14]。而JAK (加納斯激酶)作為重要的信號傳導(dǎo)分子，在癌癥和自身免疫性疾病中的研究得到更多重視[15, 16]。本研究提示，TP可能通過凋亡相關(guān)的神經(jīng)酰胺途徑，通過影響EDG繼而激活Ras基因，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。同時，TP還可能通過作用于JAK，進而干預(yù)胰腺癌信號通路和抑瘤素M通路上的STAT3和STAT1跨核膜作用，對核內(nèi)胰腺癌相關(guān)的細(xì)胞周期調(diào)控以及基質(zhì)金屬蛋白酶相關(guān)基因的表達進行影響[15, 18, 19]。與此同時，TP也可通過作用JAK，在胞漿內(nèi)干預(yù)akt基因，進而調(diào)控眾多的下游基因[20]。上述結(jié)果表明，JAK和EDG可能是TP治療胰腺癌的作用靶點，而其具體作用強度和作用機制還有待進一步深入研究。

基于Pubchem數(shù)據(jù)庫和IPA生物信息學(xué)分析，可以探索TP治療胰腺癌的分子機制，為后續(xù)的深入驗證研究提供較好的思路和明確的靶點，是一個良好的嘗試和開端。若在此基礎(chǔ)上開展更廣泛和深入的基礎(chǔ)研究，進而明確揭示TP治療胰腺癌的作用機理，必將為TP的臨床應(yīng)用打下更為堅實的基礎(chǔ)。

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