不同浸提介質(zhì)對醫(yī)用護(hù)理墊體外細(xì)胞毒性評價(jià)的影響

劉春麗 蘇小軍 方菁嶷 蘇鋒 寧萍

1 蘇州大學(xué)衛(wèi)生與環(huán)境技術(shù)研究所（蘇州 215123）

2 蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部（蘇州 215123）

醫(yī)用護(hù)理墊因具有超強(qiáng)吸收力，透氣性能好，柔軟舒適，保持床單整潔干凈，預(yù)防并發(fā)癥等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于臨床，同時(shí)其生物安全性也逐漸引起人們的注意。體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)是生物安全性評價(jià)的重要組成部分，是評價(jià)直接或間接接觸人體組織和細(xì)胞的醫(yī)療器械和材料的通用方法。浸提液實(shí)驗(yàn)是目前用于檢測醫(yī)療器械和材料的細(xì)胞毒性比較廣泛的一種方法，選擇不同的浸提介質(zhì)可能對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有直接的影響。目前標(biāo)準(zhǔn)推薦的浸提介質(zhì)有：含血清培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基、生理鹽水溶液以及其他適宜的溶劑。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)ISO 10993-5:2009[1]的試驗(yàn)原則和評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，采用不同的浸提介質(zhì)制備了醫(yī)用護(hù)理墊浸提液，用MTT 比色法評價(jià)不同的浸提介質(zhì)對細(xì)胞L929 毒性的影響。

1.材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

L929 小鼠成纖維細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Forma)，倒置相差顯微鏡(Lecia)，酶標(biāo)儀(Bio-tek)，含/不含酚紅MEM 培養(yǎng)液（Gibco），胎牛血清（Gibco），胰酶（Gibco），青鏈酶素（Gibco），MTT（Sigma），異丙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組

A 浸提介質(zhì)組，含10%胎牛血清的MEM 培養(yǎng)基；B 浸提介質(zhì)組，MEM 培養(yǎng)基，浸提結(jié)束補(bǔ)充10%的胎牛血清；C 浸提介質(zhì)組，MEM 培養(yǎng)基，浸提結(jié)束用含20%胎牛血清的2×MEM 做1:1稀釋；D 浸提介質(zhì)組，0.9%NaCl 注射液，浸提結(jié)束用含20%胎牛血清的2×MEM 做1:1 稀釋。浸提結(jié)束立刻用于實(shí)驗(yàn)，浸提液濃度設(shè)100%、75%、50%、25%四個(gè)劑量。每組均設(shè)實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組(高密度聚乙烯)、陽性對照組（含0.4% 苯酚的相應(yīng)浸提介質(zhì))和空白對照組，各組設(shè)5 個(gè)平行孔。

1.2.2 浸提液的制備

護(hù)理墊厚度為1mm，根據(jù)ISO 10993-5:2009和ISO 10993-12:2009[2]，護(hù)理墊按3 cm2/ml 分別浸入A、B 浸提介質(zhì)；護(hù)理墊按1.5 cm2/ml 分別浸入C、D 浸提介質(zhì)，置于37?C 浸提24h 后備用。同法制備陰性對照和陽性對照。

1.2.3 MTT 比色法

將L929 細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清和抗生素（青霉素100 U/ml，鏈霉素100 μg/ml）的MEM 培養(yǎng)液中，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用胰酶消化制備成單細(xì)胞懸液，離心（200g，3min），將細(xì)胞重新分散于培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml；接種上述細(xì)胞懸液到96 孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，置37?C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；待細(xì)胞貼壁后吸出原來的培養(yǎng)液，分別加入100 μl 不同濃度護(hù)理墊浸提液（100%、75%、50%、25%）、空白對照液、陽性對照和陰性對照液（100%），培養(yǎng)24h 后，取出96 孔板置倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。吸出原來的培養(yǎng)液，每孔加50μL MTT（1mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)2h 后棄去孔內(nèi)液體，加入100 μL 異丙醇，置振蕩器上振蕩10min，在酶標(biāo)儀上以570nm 為主吸收波長，650nm 為參考波長測定吸光度值。按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：Viab.%=試驗(yàn)組（陰性、陽性組）吸光度值×100／空白組吸光度值。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，采用SPSS 11.0 統(tǒng)計(jì)軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，P<0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.5 評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)ISO 10993-5:2009，樣品50%浸提液的細(xì)胞存活率應(yīng)大于或等于100%浸提液的細(xì)胞存活率，試驗(yàn)成立，否則應(yīng)重復(fù)試驗(yàn)。試驗(yàn)品100%浸提液的細(xì)胞存活率小于空白組70%，說明樣品具有潛在的細(xì)胞毒性。

2.結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果

加樣后24 h 鏡下觀察空白組和陰性對照組，細(xì)胞形態(tài)呈長條梭形或不規(guī)則多邊形，細(xì)胞貼壁良好，無空泡，細(xì)胞大量增殖。陽性對照組細(xì)胞變圓、胞核固縮或裂解死亡，細(xì)胞數(shù)量無明顯增加。護(hù)理墊A 浸提介質(zhì)組（100%浸提液）細(xì)胞部分變圓，細(xì)胞數(shù)量明顯低于陰性對照組，細(xì)胞生長受到明顯抑制。B、C、D 浸提介質(zhì)組（100%浸提液）細(xì)胞數(shù)量和陰性對照組與空白組比較無明顯差異，見圖1。

2.2 MTT 比色法結(jié)果

MTT 比色法測定加樣后24h 的細(xì)胞存活率見表1。各陽性對照組細(xì)胞存活率為7.5%左右，陰性對照組細(xì)胞存活率均大于95%，各實(shí)驗(yàn)組50%浸提液組細(xì)胞存活率均高于同組100%浸提液組細(xì)胞存活率，說明本實(shí)驗(yàn)體系適用于該試驗(yàn)樣品細(xì)胞毒性的判定。從表1 看出，A 浸提介質(zhì)組細(xì)胞存活率為68.6%，與空白組和陰性對照組比較，細(xì)胞存活率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。B、C、D 浸提介質(zhì)組細(xì)胞存活率差別不大，都在90%左右，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。以上結(jié)果說明用不同的浸提介質(zhì)浸提醫(yī)用護(hù)理墊，對其體外細(xì)胞毒性結(jié)果有直接影響。

圖1.L-929 細(xì)胞與4種浸提介質(zhì)及對照組共培養(yǎng)24 h 的細(xì)胞形態(tài)（倒置相差顯微鏡，×100）

表1.護(hù)理墊各組加樣后24h 的細(xì)胞存活率（mean±SD,n=5）

3.討論

目前醫(yī)用護(hù)理墊廣泛地應(yīng)用于臨床，適用于醫(yī)院手術(shù)，癱瘓病人，大小便失禁，產(chǎn)婦護(hù)理等。為保證其使用的安全性，選擇合適的方法進(jìn)行生物學(xué)評價(jià)是必要的步驟。體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)具有操作簡單、易標(biāo)準(zhǔn)化、周期短、敏感性強(qiáng)且能定量分析等優(yōu)點(diǎn)，是醫(yī)療用品生物安全性評價(jià)體系中最重要的檢測指標(biāo)之一。目前GB/T16886.5-2003[3]和ISO 10993-5:2009 中規(guī)定了3 類試驗(yàn)方法，即浸提液試驗(yàn)、直接接觸試驗(yàn)以及間接接觸試驗(yàn)。浸提液實(shí)驗(yàn)是將樣品材料浸提液直接加入到細(xì)胞培養(yǎng)器皿，與細(xì)胞共培養(yǎng)一段時(shí)間，觀察浸提液中的溶出物對細(xì)胞毒性的影響。研究者認(rèn)為醫(yī)用材料中一些易溶出物質(zhì)是引起毒性反映的主要原因。根據(jù)國內(nèi)外評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，浸提介質(zhì)可選擇含/不含血清培養(yǎng)基、生理鹽水等。

在醫(yī)用材料生物學(xué)評價(jià)的具體實(shí)踐中，浸提介質(zhì)的選擇對細(xì)胞毒性評價(jià)結(jié)果的影響是否存在差異目前相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道不多。為探索不同浸提介質(zhì)對評價(jià)結(jié)果的影響，本實(shí)驗(yàn)采取浸提試驗(yàn)，制備不同浸提介質(zhì)的浸提液，用ISO 10993-5:2009附錄C 規(guī)定的MTT 比色法來評價(jià)護(hù)理墊的細(xì)胞毒性。我們在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，A 浸提介質(zhì)組使細(xì)胞生長受到明顯抑制，細(xì)胞存活率相對于空白組僅為68.6%，根據(jù)ISO 10993-5:2009 的判斷標(biāo)準(zhǔn)，樣品具有潛在細(xì)胞毒性，而B、C、D 浸提介質(zhì)組與各自空白組比較，細(xì)胞大量增殖，生長狀態(tài)良好，細(xì)胞存活率均在90%左右。以上結(jié)果說明護(hù)理墊用不同的浸提介質(zhì)處理，對評價(jià)其細(xì)胞毒性結(jié)果存在差異。分析可能的原因是血清在浸提前、后加入導(dǎo)致：A 浸提介質(zhì)組為含血清培養(yǎng)基，在浸提時(shí)加入和護(hù)理墊相互作用；B 浸提介質(zhì)組是不含血清的培養(yǎng)基，浸提結(jié)束補(bǔ)加入10%的血清。C、D 浸提介質(zhì)組分別是不含血清培養(yǎng)基和生理鹽水，浸提結(jié)束后用含20%血清的2×MEM培養(yǎng)基等比稀釋。血清的主要作用是提供氨基酸、維生素等細(xì)胞生長必須的營養(yǎng)物質(zhì)；提供激素和各種生長因子；提供結(jié)合蛋白；提供促接觸和伸展因子使細(xì)胞體壁免受機(jī)械損傷。因此血清在一定程度上可促進(jìn)細(xì)胞增殖[4]。護(hù)理墊一般由三部分組成，頂層是親水無紡布，吸水層是木漿棉和高分子吸水樹脂，底層是防漏PE/PP 膜。我們推測護(hù)理墊在浸提過程中，吸水層的木漿棉和高分子吸水樹脂吸附了部分血清中的促細(xì)胞生長因子，使細(xì)胞增殖能力降低。而B、C、D 浸提介質(zhì)組血清在浸提結(jié)束后補(bǔ)充加入，其成分和濃度不受浸提過程的影響而發(fā)生變化，仍能促進(jìn)細(xì)胞生長。對于醫(yī)用護(hù)理墊，不同浸提介質(zhì)其細(xì)胞毒性結(jié)果不一致，是否是血清和吸水層造成的差異還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

Oshima[5]認(rèn)為不同的浸提條件和浸提方式所制備的材料溶出物在細(xì)胞敏感程度上并無顯著差異。鄺輝等[6]評價(jià)了不同的浸提介質(zhì)對一次性使用球囊擴(kuò)張導(dǎo)管體外細(xì)胞毒性的影響，發(fā)現(xiàn)不同浸提液之間的OD 值雖然存在差異，但不影響該產(chǎn)品的細(xì)胞毒性分級。浸提是一個(gè)復(fù)雜的過程，受時(shí)間、溫度、表面積與體積比、浸提介質(zhì)以及材料的相平衡的影響。由于醫(yī)用材料的多樣性，直接或間接接觸人體引起體內(nèi)環(huán)境的變異性，材料與機(jī)體作用的復(fù)雜性等，因此根據(jù)醫(yī)用材料本身的理化特性及其用途，正確選擇試驗(yàn)方法及相關(guān)參數(shù)是十分重要的。本試驗(yàn)認(rèn)為，在評價(jià)醫(yī)用材料的細(xì)胞毒性時(shí)，一定要注明所選擇的試驗(yàn)參數(shù)和浸提介質(zhì)，對于醫(yī)用護(hù)理墊，如何更科學(xué)、更準(zhǔn)確地評價(jià)其細(xì)胞毒性有待進(jìn)一步研究。

[1]ISO 10993-5:2009,Biological evaluation of medical devices – Part 5:Tests for in vitro cytotoxicity[s].

[2]ISO 10993-12:2009,Biological evaluation of medical devices – Part 12:Sample preparation and reference materials[s].

[3]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T16886.5-2003 醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)第5 部分體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)[S].

[4]司徒鎮(zhèn)強(qiáng),吳軍正,細(xì)胞培養(yǎng)[M].世界圖書出版社,2007:2009.

[5]Oshima H,Nakamura M.A study on reference standard for cytotoxicity assay of biomaterials[J].Biomed Mater Eng,1994,4(4):327.

[6]鄺輝,劉堯,曹蘋,等.不同浸提介質(zhì)對一次性使用球囊擴(kuò)張導(dǎo)管體外細(xì)胞毒性評價(jià)的影響[J].生物醫(yī)學(xué)工程研究,2011,30(2):113-115.