5-氟尿嘧啶醇脂體抑制瘢痕成纖維細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

張錚沃雁張振毛小慧蘇薇潔濮哲銘張艷章一新

5-氟尿嘧啶醇脂體抑制瘢痕成纖維細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

張錚沃雁張振毛小慧蘇薇潔濮哲銘張艷章一新

目的構(gòu)建納米級(jí)載5-氟尿嘧啶醇脂體（5-FU ES），觀察其對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞的抑制作用。方法采用Touitou法制備5-FU ES懸液并進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。體外培養(yǎng)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，熒光素RhoB標(biāo)記醇脂體，進(jìn)行體外透細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，以水醇溶液為對(duì)照。激光共聚焦顯微鏡（CLSM）觀察不同作用時(shí)間后細(xì)胞內(nèi)熒光分布和強(qiáng)度。CCK-8檢測(cè)不同濃度5-FU ES對(duì)成纖維細(xì)胞活性的影響，計(jì)算載5-FU ES對(duì)成纖維細(xì)胞活性的半數(shù)抑制濃度（IC50）。CCK-8檢測(cè)醇脂體對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。結(jié)果制備所得5-FU ES粒徑為（87.5±5.4）nm，分散系數(shù)為0.151±0.27，包封率為（10.03±2.12）%。CLSM圖像顯示，醇脂體促進(jìn)RhoB進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，可見熒光分布和強(qiáng)度均較水醇溶液組增多增強(qiáng)；經(jīng)Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算單位面積光密度值，RhoB標(biāo)記醇脂體組（Rho ES）細(xì)胞內(nèi)熒光光密度顯著高于水醇溶液組（Rho HA）（P<0.01）。隨著5-FU濃度增加，5-FU HA和5-FU ES對(duì)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率逐漸增強(qiáng)；5-FU ES和5-FU HA對(duì)成纖維細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為（9.2582±1.2329）μg/mL和（18.0352±2.3145）μg/mL，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；同時(shí)，醇脂體本身對(duì)細(xì)胞活性無明顯抑制作用。結(jié)論醇脂體可有效攜帶5-FU向瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)遞送，促進(jìn)5-FU對(duì)成纖維細(xì)胞的活性抑制作用。醇脂體作為經(jīng)皮給藥載體，是一種安全有效的透細(xì)胞藥物載體。

醇脂體5-氟尿嘧啶增生性瘢痕成纖維細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)遞送

目前，瘢痕的治療方法眾多，但效果均不理想[1]。瘢痕內(nèi)藥物注射是目前常用的方法，但不良反應(yīng)較多，如過敏反應(yīng)[2]、皮膚萎縮[3]等，且注射過程疼痛劇烈，患者接受度低[4]。經(jīng)皮給藥能夠避免上述不良反應(yīng)，但因皮膚的屏障作用和瘢痕組織致密的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，造成藥物不易滲透進(jìn)入瘢痕組織，無法在局部形成有效的藥物濃度。隨著透皮研究的發(fā)展，醇脂體被證明是最為有效的透皮藥物載體之一[5-6]。

5-FU通過干擾瘢痕成纖維細(xì)胞DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，抑制細(xì)胞的增殖和膠原蛋白過度表達(dá)，以減輕瘢痕增生和膠原沉積[7-8]。也就是說，5-FU必須由外界進(jìn)入瘢痕組織，并進(jìn)入成纖維細(xì)胞內(nèi)才能發(fā)揮抑制瘢痕作用。我們?cè)谇捌隗w外透瘢痕研究中初步證實(shí)，載5-FU醇脂體可有效滲透入瘢痕組織，并在局部獲得較高的藥物滯留量[9-11]。但是，進(jìn)入瘢痕組織后的載藥醇脂體，能否進(jìn)一步克服細(xì)胞膜屏障，將5-FU遞送至成纖維細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮細(xì)胞抑制作用，尚有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

本研究采用熒光素標(biāo)記醇脂體，通過體外透瘢痕成纖維細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，以明確醇脂體是否能夠有效進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并檢測(cè)了載5-FU醇脂體對(duì)體外瘢痕成纖維細(xì)胞活性的影響，旨在為經(jīng)皮給藥治療瘢痕提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與方法

1.1 試劑、儀器

試劑：5-FU（上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司），大豆卵磷脂（磷脂酰膽堿，含量≥94%，德國(guó)Lipoid GmbH），羅丹明B（美國(guó)Sigma），細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)試劑盒（Cell counting kit-8，CCK-8）（日本同仁化學(xué)研究所），其余試劑均為分析純。

儀器：JEM-2012透射電子顯微鏡（日本JEOL Inc），F(xiàn)EF Sirion 200掃描電子顯微鏡（英國(guó)Oxford Inc），380zls NICOM激光粒度儀（美國(guó)PCS），激光掃描共聚焦顯微鏡（德國(guó)Leica Microsystems Heidelberg GmbH），2695高效液相色譜分析儀（美國(guó)waters），LiposoFast薄膜擠出儀和擠出模（加拿大Avestin Inc），CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Forma Scientific），恒溫?fù)u床（美國(guó)Forma Scientific）。

1.2 方法

1.2.1 醇脂體的制備和質(zhì)量評(píng)價(jià)

1.2.1.1 載5-FU醇脂體的制備

[12-13]的方法，秤取一定量的PC溶解于無水乙醇中作為油相，將5-FU溶于PBS（pH 7.4）中作為水相。室溫條件下，將水相以70 μL/sec注入油相中，以700 r/min的速度持續(xù)攪拌混合30 min，隨后超聲20～30 min。室溫冷卻靜置30 min。利用擠出儀將醇脂體混懸液通過50 nm孔徑的聚碳酸酯膜，制備得納米級(jí)載5-FU醇脂體懸液，其中含0.4%5-FU（w/v）、2%PC（w/v）和30%乙醇（v/v）。同上法制得RhoB標(biāo)記的醇脂體。

1.2.1.2 載5-FU醇脂體的質(zhì)量評(píng)價(jià)

用透射電鏡和掃描電鏡觀察5-FU醇脂體的形態(tài)。用激光粒度儀（波長(zhǎng)635 nm，25℃）檢測(cè)5-FU醇脂體的粒徑大小和分布。采用微柱離心法測(cè)量醇脂體的包封率（Entrapment efficacy，EE）[14]：取1 mL注射針筒，底部放置與針筒內(nèi)徑一致的圓形濾紙，加入用PBS溶脹的Sephadex G50凝膠，將裝好的注射器放入離心管內(nèi)，2 000 r/min離心3 min，除去多余PBS后形成凝膠柱；吸取5-FU醇脂體0.2 mL，加于柱頂，3 000 r/min離心5 min，收集洗脫液（T1）。于柱頂部加入相同體積PBS，3 000 r/min離心3 min，收集洗脫液（T2），重復(fù)該步驟8次，收集洗脫液（T3～T10），記為T2～10。利用高效液相色譜分析儀（High performance liquid chromatography，HPLC）分別檢測(cè)T1和T2～T10中5-FU含量。5-FU醇脂體的包封率為EE=m1/(m1+m2)×100%。其中：m1為包封在醇脂體中的5-FU的質(zhì)量，即洗脫液T1中5-FU質(zhì)量，m2為未包封在醇脂體中的5-FU的質(zhì)量，即反復(fù)加入PBS后收集到的洗脫液T2～T10的5-FU的質(zhì)量。

1.2.2 體外培養(yǎng)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞

本研究所用的人體增生性瘢痕均來自于我科住院患者，22～31歲女性，或患者知情同意。將切取的標(biāo)本用氯霉素溶液和無菌PBS溶液沖洗，去除標(biāo)本表皮及脂肪等皮下組織，將真皮層瘢痕組織剪碎成1 mm×1 mm×1 mm大小。將剪碎的組織移入50 mL無菌離心管中，加入約10倍于組織體積的0.3%無菌膠原酶溶液，密封，37℃振蕩器中消化3～4 h。過濾消化液,除去未消化的組織殘?jiān)?，過濾液1 500 r/min離心10 min，棄上清，離心管內(nèi)加入適量含10%FCS的DMEM培養(yǎng)液，吹打混勻成細(xì)胞懸液，移入無菌細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。原代細(xì)胞培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液，48 h后傳代；傳代培養(yǎng)細(xì)胞一般3 d更換培養(yǎng)液，當(dāng)貼壁細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底部時(shí)傳代。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞一般取第4～6代成纖維細(xì)胞。

1.2.3 體外透瘢痕成纖維細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

取6孔板，每孔放置一片無菌蓋玻片。將成纖維細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度鋪種于6孔板中，置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將孔內(nèi)培養(yǎng)液換成無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)1 h，換成含血清培養(yǎng)液，每孔加入50 μL熒光標(biāo)記醇脂體懸液，分別培養(yǎng)1 h、4 h和8 h。對(duì)照組：含熒光素的30%水醇溶液（30%EtOH）；空白對(duì)照組：PBS溶液。培養(yǎng)終點(diǎn)，吸除孔內(nèi)溶液，用PBS洗滌3遍，每孔加入含10%胎牛血清（FCS）的PBS 2 mL，觀察前在蓋玻片上滴一滴70%甘油溶液消除氣泡，置于CLSM下觀察。參數(shù)設(shè)置：熒光素Rho B激發(fā)波長(zhǎng)為552 nm，發(fā)射熒光波長(zhǎng)為610 nm，為紅色熒光。放大倍率：63.0×1.40油鏡。

1.2.4 體外瘢痕成纖維細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 不同濃度5-FU醇脂體對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞的抑制作用

5-FU醇脂體體外培養(yǎng)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞。取24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入0.4×104cells/mL的細(xì)胞懸液1 mL。恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液，每孔加入800 μL新鮮培養(yǎng)液，分別向孔內(nèi)加入80 μL各組溶液，輕輕混勻。置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，72 h后取各組培養(yǎng)細(xì)胞，更換含10%（v/v）CCK-8試劑的新鮮培養(yǎng)液800 μL，混勻后放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1 h后取出，將各組孔內(nèi)上層溶液轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔溶液吸光度值（A值）。設(shè)置調(diào)零組和空白組，每組5個(gè)復(fù)孔，結(jié)果重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)組：5-FU濃度分別為2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL和40 μg/mL的醇脂體懸液；②對(duì)照組：5-FU濃度分別為2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL和40 μg/mL的水醇溶液；③空白對(duì)照組：不含5-FU的PBS溶液；④調(diào)零組：無細(xì)胞孔，加入溶液同空白組。

其中，AbsT=（實(shí)驗(yàn)組A值-調(diào)零組A值），AbsC=（空白組A值-調(diào)零組A值）。以5-FU濃度為橫坐標(biāo)，以細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為縱坐標(biāo)，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制50%時(shí)的各組溶液中的5-FU濃度，作為對(duì)成纖維細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.2.4.2 醇脂體對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

從實(shí)驗(yàn)1.2.4.1中得出5-FU ES對(duì)成纖維細(xì)胞有效抑制濃度，在該濃度下用CCK-8法檢測(cè)空載醇脂體懸液作用72 h后，對(duì)成纖維細(xì)胞活性的影響。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.15 -FU醇脂體的質(zhì)量評(píng)價(jià)

5-FU ES為完整的球形或橢球形囊泡，粒徑在100 nm以內(nèi)，大小均一（圖1）。激光粒度儀測(cè)得的5-FU ES的平均粒徑為（87.5±5.4）nm，多項(xiàng)分散系數(shù)（PDI）為0.151±0.27。包封率為（10.03±2.12）%。

2.2 體外透瘢痕成纖維細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，醇脂體組細(xì)胞內(nèi)熒光分布逐漸增多增強(qiáng)，而水醇溶液組細(xì)胞內(nèi)熒光也有增多趨勢(shì)，但熒光強(qiáng)度始終較弱，明顯低于醇脂體組（圖2）。通過單位面積光密度的計(jì)算，醇脂體組細(xì)胞內(nèi)熒光光密度始終明顯高于水醇溶液組（圖3），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 體外瘢痕成纖維細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)

隨著5-FU濃度增加，5-FU HA和5-FU ES對(duì)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率逐漸增強(qiáng)，尤其5-FU濃度在10 μg/mL及以上時(shí)，可顯著抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)（圖4）。5-FU ES對(duì)成纖維細(xì)胞的抑制作用大于5-FU HA，差異顯著（P＜0.05）。通過計(jì)算得出，5-FU HA及5-FU ES對(duì)成纖維細(xì)胞活性的IC50分別為（18.035±2.056）μg/mL及（9.258±1.397）μg/mL，差異顯著（P＜0.05）。制備10 μg/mL 5-FU ES及相同體系的空載ES，比較兩組作用72 h后對(duì)成纖維細(xì)胞活性的影響，其中空白對(duì)照組、ES組、5-FU ES組A值分別為（0.687±0.029）、（0.643±0.317）、（0.191±0.010）。比較發(fā)現(xiàn)5-FU ES組較空白對(duì)照組和ES組A值明顯下降（P＜0.05），而ES組與空白對(duì)照組沒有明顯差異（P＞0.05）（圖5）。

圖1 透射電鏡和掃描電鏡下載5-FU醇脂體的形態(tài)Fig.1TEM and SEM observation of 5-FU Ethosomes

圖2 Rho醇脂體和Rho水醇溶液體外透瘢痕成纖維細(xì)胞CLSM熒光分布圖片（88×）Fig.2CLSM images of intracellular fluorescence in scar fibroblasts following delivery of RhoB labeled carrier in vitro(88×)

圖3 Rho醇脂體和Rho水醇溶液透細(xì)胞1～8 h后，細(xì)胞內(nèi)單位面積光密度值Fig.3The intracellular OD value of unite area at different incubation time in RhoB labled ethosomal suspensions and RhoB labled hydroalcoholic solution

圖4 不同濃度5-FU醇脂體和5-FU水醇溶液對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.4The effect of different concentrations of 5-FU ES and 5-FU HA on the growth of Fibroblasts

圖5 5-FU醇脂體和空白醇溶液對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞的影響（*：與ES比較P＜0.05）Fig.5 The effect of 5-FU ES and ES on the growth of scar fibroblasts(*:P＜0.05,compared to ES)

3 討論

5-FU是一種具有抗代謝活性的胸腺嘧啶類似物，已被證實(shí)是一種較好的抗瘢痕藥物[15]。醇脂體是一種新型脂質(zhì)囊泡透皮載體，由Touitou等[12-13]在2000年首次提出。醇脂體囊泡的高度變形能力使其在透皮過程中能通過比自身粒徑小的空隙，從而攜帶活性藥物到達(dá)皮膚的深層，進(jìn)而發(fā)揮藥理學(xué)作用[16]。因此，利用醇脂體將抗瘢痕藥物經(jīng)皮遞送至瘢痕組織，將為瘢痕治療提供一種新的方便安全的給藥方式。我們前期的研究表明，粒徑在納米尺度范圍的醇脂體可有效攜帶5-FU進(jìn)入瘢痕組織，并表現(xiàn)了較高的藥物滯留量，證明醇脂體是一種有效的透瘢痕藥物載體[9-11]。

細(xì)胞膜為半透膜，僅允許特定的分子透過，而阻止其他分子進(jìn)入細(xì)胞，尤其是水溶性分子[17]，5-FU不能自由通過細(xì)胞膜。因此，當(dāng)載5-FU醇脂體滲透角質(zhì)層進(jìn)入皮膚深層后，醇脂體能否進(jìn)一步促進(jìn)5-FU進(jìn)入成纖維細(xì)胞發(fā)揮抑制作用尚不明確。

為了檢測(cè)醇脂體能否促進(jìn)水溶性分子的細(xì)胞內(nèi)遞送能力，本實(shí)驗(yàn)采用水溶性熒光素標(biāo)記醇脂體，作用于體外培養(yǎng)的人體增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，觀察醇脂體能否促進(jìn)熒光分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[18]。結(jié)果顯示，醇脂體可快速高效地將熒光素分子遞送至細(xì)胞內(nèi)。脂質(zhì)體粒徑在50～100 nm范圍內(nèi)與細(xì)胞的相互作用方式主要是“內(nèi)吞”作用[17]，本研究中的醇脂體粒徑在該范圍內(nèi)，我們推測(cè)醇脂體組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯增加，可能是由于包封在醇脂體內(nèi)的水溶性分子通過細(xì)胞對(duì)載藥醇脂體的“內(nèi)吞”大量進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的。該結(jié)果提示，當(dāng)載藥醇脂體滲透角質(zhì)層進(jìn)入皮膚深層后，醇脂體和活性藥物可能經(jīng)此途徑進(jìn)入細(xì)胞而發(fā)揮作用。

體外細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，成纖維細(xì)胞的活性隨著5-FU濃度的加大而衰減，即存在明顯的劑量依賴性。5-FU濃度在5～20 μg/mL范圍內(nèi)，對(duì)成纖維細(xì)胞的抑制作用最為明顯。而醇脂體本身對(duì)體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)無明顯抑制作用，說明5-FU醇脂體細(xì)胞活性的抑制作用是由5-FU產(chǎn)生的。因此，體外培養(yǎng)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中對(duì)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)活性起決定性作用的是5-FU，且相同5-FU濃度下，5-FU醇脂體對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞的抑制作用較水醇溶液明顯增強(qiáng)。結(jié)合體外透細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，原因可能為醇脂體通過將更多的5-FU遞送至細(xì)胞內(nèi)而發(fā)揮針對(duì)成纖維細(xì)胞的抑制作用。

4 結(jié)論

本研究表明，醇脂體能夠促進(jìn)水溶性藥物5-FU通過細(xì)胞膜屏障進(jìn)入瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)，提高對(duì)成纖維細(xì)胞的抑制作用。本文雖未完整闡述醇脂體與瘢痕成纖維細(xì)胞的相互作用機(jī)制，但為醇脂體作為藥物載體在瘢痕治療中的應(yīng)用，提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Inhibitory Effects of Ethosomes Encapsulated with 5-Fluorouracil on Human Hypertrophic Scar Fibroblasts

ZHANG Zheng,WO Yan,ZHAGN Zhen,MAO Xiaohui,SU Weijie,PU Zheming,ZHANG Yan,ZHANG Yixin.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200011,China.Corresponding author:ZHANG Yixin(E-mail:zhangyixin6688@163.com).

ObjectiveTo establish ethosomes encapsulated with 5-Fluorouracil and to explore the inhibitory effects of 5-FU on human hypertrophic scar fibroblasts.MethodsEthosomes encapsulated with 5-Fluorouracil was prepared by Touitou method and was evaluated.Human hypertrophic scar fibroblasts were cultured in vitro,the penetration of the fluorescent probes into fibroblasts was examined by CLSM,and hydroalcoholic solution was set as control group.The effect of ethosomes encapsulating different concentration of 5-FU on fibroblast viability was tested by cell counting kit-8(CCK-8),and the median inhibitory concentration(IC50)was calculated.The effect of ethosomes on fibroblast viability was tested by CCK-8.ResultsThe particle size of 5-FU encapsulated ethosomes was(87.5±5.4)nm,the polydispersion index was 0.151±0.27, and the encapsulation efficiency of 5-FU was(10.03±2.12)%.CLSM micrographs showed that ethosomes facilitated the penetration of RhoB into the cell,as evident from the high intensity fluorescence.In comparison,when incorporated in hydroalcoholic solution,very weak fluorescence was detected.The optical density(OD)of unit area was calculated through the Image-Pro Plus 6.0 image analysis software,and the OD value of ethosomal group was distinguished higher than hydroalcoholic group(P<0.01).With the increase of the concentration of 5-FU,growth inhibition rate of fibroblast affected by 5-FU HA and 5-FU ES was gradually enhanced.The IC50 of 5-FU encapsulated ethosomes and 5-FU hydroalcoholic solution to fibroblasts were(9.2582±1.2329)μg/mL and(18.0352±2.3145)μg/mL,respectively,the difference between the two groups was distinguished(P<0.05).Meanwhile,ethosomal carrier was not toxic to the cultured cells.ConclusionEthosomes can effectively enhance intracellular delivery of 5-FU,as a result can enhance the inhibitory effect of 5-FU on fibroblast viability.Meanwhile,ethosomal carrier was not toxic to the cultured cells.Ethosomes as percutaneous drug delivery carriers,are also a promising candidate for the delivery of biological and chemical compounds to cultured cells.

Ethosomes;5-fluorouracil;Hypertrophic scar;Fibroblast;Intracellular delivery

R619+.6

A

1673－0364（2014）02－0077－05

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.02.004

國(guó)家自然科學(xué)基金（81071569）。

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。

章一新（E-mail：zhangyixin6688@163.com）。