毛囊干細胞結(jié)合電紡納米絲素纖維構(gòu)建組織工程尿道膜片的體外研究

王平杜明軍解海博傅強

毛囊干細胞結(jié)合電紡納米絲素纖維構(gòu)建組織工程尿道膜片的體外研究

王平杜明軍解海博傅強

目的探索毛囊干細胞結(jié)合電紡納米絲素纖維，構(gòu)建組織工程尿道膜片的可行性。方法使用酶消化法分離兔毛囊細胞，利用流式細胞儀分選毛囊干細胞，體外原代培養(yǎng)擴增，計算細胞的最大擴增倍數(shù)及克隆形成率；使用流式細胞儀檢測細胞K19、p63、CD29的陽性表達率。將毛囊干細胞接種在電紡納米絲素纖維支架上，構(gòu)建組織工程尿道。應(yīng)用組織學(xué)、熒光染色法觀察組織工程尿道的體外構(gòu)建情況。結(jié)果兔毛囊干細胞與兔毛囊細胞的最大擴增倍數(shù)分別為（5.92±0.77）×104倍和（6.61±3.62）×103倍；兔毛囊干細胞與兔毛囊細胞的克隆形成率分別為（9.07±1.18）%和（3.95±1.01）%。K19、p63、CD29在毛囊干細胞中表達率分別為（89.36±6.69）%、（92.10±5.49）%和（89.98±6.89）%；在兔毛囊細胞中分別為（39.38±2.20）%、（40.78±2.61）%和（40.57±2.79）%；毛囊干細胞在支架上能形成復(fù)層上皮樣結(jié)構(gòu)，AE1/AE3染色陽性。結(jié)論兔毛囊干細胞結(jié)合電紡納米絲素纖維，能成功構(gòu)建組織工程尿道，可用于體內(nèi)修復(fù)的進一步研究。

毛囊干細胞靜電紡絲組織工程尿道

尿道損傷的修復(fù)一直是臨床不斷探索的問題，各種修復(fù)方法都有利有弊。組織工程技術(shù)為修復(fù)尿道缺損帶來了希望。毛囊干細胞的獲取相對容易，而且與表皮干細胞有著相似的生物學(xué)特性[1-2]。毛囊干細胞有可能替代表皮細胞成功構(gòu)建組織工程尿道。靜電紡絲材料具有高孔隙率、穩(wěn)定的質(zhì)量和良好的生物相容性。本研究擬探討毛囊干細胞結(jié)合電紡納米絲素纖維構(gòu)建組織工程尿道的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

健康清潔級2月齡新西蘭雄兔5只（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院實驗動物中心提供），體質(zhì)量(2.1±0.2)Kg。

1.1.2 實驗試劑

水溶性膠原蛋白（分子量6 000，AR級）、絲素膜（四川銘讓生物科技有限公司）；聚己內(nèi)酯（PCL，相對分子質(zhì)量8×104，美國Sigma-Aldrich公司）；六氟異丙醇（HFIP，美國Dupont公司）；胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶、高糖DMEM培養(yǎng)液、無血清KSFM培養(yǎng)液、無鈣鎂離子的磷酸緩沖液（美國Gibco公司）；Ⅰ型膠原酶（美國Worthington公司）；K19、P63、1-integrin鼠抗兔抗體（美國Abcam公司）；AE1/AE3抗體、FITC標記的抗鼠抗體（美國Santa Cruz公司）。

1.2 方法

1.2.1 分離、培養(yǎng)毛囊干細胞

將實驗兔以戊巴比妥30 mg/Kg耳緣靜脈注射麻醉后，在無菌條件下取兔雙側(cè)觸須部全層皮膚。組織置于含有青霉素的Hank's液中，再用Hank's液沖洗3次，鈍性分離單個毛囊組織。采用1%膠原酶從單個毛囊組織中獲取單個細胞，將消化后的單細胞，以2×108cells/L密度接種到培養(yǎng)瓶中，置于5% CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液，待細胞達到90%融合時按1∶3傳代。利用流式細胞儀分選毛囊干細胞，體外培養(yǎng)，細胞計數(shù)，計算最大擴增能力。

1.2.2 兔皮膚成纖維細胞分離、培養(yǎng)

按上述方法獲得兔全層皮膚，并將其中毛囊與表皮去除，再將真皮組織剪成直徑1～3 mm的組織塊，將組織塊按照一定間距鋪于直徑10 cm培養(yǎng)皿中，37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中靜置30 min，使組織塊更好貼壁，再向培養(yǎng)皿加入10 mL DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每3天換液，待細胞達到90%融合時按1∶3傳代。

1.2.3 靜電紡絲納米支架材料制備

將絲素膜、水溶性膠原蛋白粉末及聚己內(nèi)酯（PCL）按質(zhì)量比1∶1∶8共同溶于六氟異丙醇中（HFIP），PCL終濃度2%，將上述制備好的溶液置于12 G針頭注射器內(nèi)。針頭與自制的開放式滾筒接收裝置（直徑12 cm）之間的距離為12 cm。電紡條件為：流速3.2 mL/h，電壓12 KV，滾筒轉(zhuǎn)速300 r/min。將制好的納米纖維膜在通風櫥中過夜干燥后，環(huán)氧乙烷消毒，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 K19、p63、1-integrin流式細胞儀分析

以K19流式檢測為例，離心收集待測細胞，1%多聚甲醛固定15 min，PBS沖洗，Triton X-100作用15 min，PBS沖洗，鼠抗人K19單克隆抗體（1∶100）4℃孵育30 min，PBS沖洗，以FITC標記的抗鼠抗體（1∶100）4℃孵育30 min，PBS沖洗并調(diào)整體積至200～500 μL。以PBS代替一抗，重復(fù)以上步驟設(shè)定空白對照。每個樣本吸取約10 000個細胞，上流式細胞儀檢測。

1.2.5 組織工程尿道體外構(gòu)建與HE染色

將兔皮膚成纖維細胞按3×109cells/L密度滴注在電紡納米絲素纖維材料上，5%CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，再將毛囊干細胞按1×109cells/L密度滴注在材料上。將細胞-材料復(fù)合物置于KSFM培養(yǎng)液中培養(yǎng)1周，再改用氣液交界（Air-liquid interface）繼續(xù)培養(yǎng)至1個月。取組織工程尿道，一部分制備冰凍切片，另一部分經(jīng)4%多聚甲醛固定后，脫水、石蠟包埋，5 μm厚切片，HE染色觀察。

1.2.6 免疫熒光檢測AE1/AE3表達

將冰凍組織切片用PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定15 min，Triton X-100處理10 min，PBS洗滌3次，用含10%羊血清的BSA封閉，37℃孵育30 min，加入小鼠抗兔AE1/AE3單克隆抗體，4℃冰箱避光過夜，PBS洗滌3次，加入FITC標記的兔抗鼠IgG二抗，37℃孵育30～60 min，PBS洗滌3次，碘化丙啶避光襯染30～60 sec，PBS洗滌3次，暗光下熒光顯微鏡檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。所有實驗數(shù)據(jù)重復(fù)5次（n=5），并以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分選后毛囊干細胞形態(tài)觀察

倒置相差顯微鏡觀察，可見細胞呈鋪路石樣排列，培養(yǎng)3 d時細胞貼壁量少，分布不均勻（圖1A）。體外培養(yǎng)至14 d時細胞已完全融合（圖1B）。

2.2分選后干細胞最大擴增倍數(shù)與克隆形成率

根據(jù)細胞擴增能力的計算公式得出，毛囊干細胞可連續(xù)培養(yǎng)12代，最大擴增倍數(shù)為（5.92±0.77）×104倍，毛囊細胞可被連續(xù)培養(yǎng)10代，最大擴增倍數(shù)為（6.61±3.62）×103倍，兩者差異顯著（n=5，P<0.05）。兔毛囊干細胞的克隆形成率為（9.07±1.18）%，毛囊細胞的克隆形成率為（3.95±1.01）%，兩者存在統(tǒng)計學(xué)差異（n=5，P<0.05）（圖2）。

2.3 毛囊干細胞K19、p63、1-integrin陽性表達率

流式分析結(jié)果顯示，在富集毛囊干細胞中K19陽性細胞率為（89.36±6.69）%，p63陽性細胞率為（92.10±5.49）%，CD29陽性細胞率為（89.98±6.89）%；在毛囊細胞中K19陽性細胞率為（39.38±2.20）%，p63陽性細胞率為（40.78±2.61）%，CD29陽性細胞率為（40.57±2.79）%。兩種細胞K19、p63、CD29陽性細胞率均存在統(tǒng)計學(xué)差異（n=5，P<0.01）（圖3）。

2.4 靜電紡絲支架材料掃描電鏡觀察

掃描電鏡觀察顯示，納米靜電紡絲材料纖維均勻，孔隙連通（圖4A、4B）。接種成纖維細胞后，細胞與材料黏附良好，并可見細胞在材料上分泌細胞外基質(zhì)（圖4C、4D）。

2.5 毛囊干細胞與電紡納米絲素纖維構(gòu)建的組織工程尿道組織學(xué)與免疫熒光觀察

毛囊干細胞體外構(gòu)建1個月的組織工程尿道HE染色顯示，細胞在支架上能形成復(fù)層上皮樣結(jié)構(gòu)，黏膜下可見未完全降解的絲素纖維材料，而且黏膜下未見明顯瘢痕組織增生（圖5A）。上皮組織內(nèi)表達AE1/AE3，可見明顯綠色熒光表達（圖5B）。

圖1 毛囊干細胞體外培養(yǎng)觀察，F(xiàn)ig.1Histological observation of hair follicle stem cells in vitro

圖2 毛囊干細胞與普通毛囊細胞最大擴增倍數(shù)與克隆形成率的統(tǒng)計分析Fig.2Statistical results of maximum amplification factor and colony forming rate in hair follicle stem cells and normal hair follicle cells

圖3 毛囊干細胞與毛囊細胞K19、p63、CD29表達率的統(tǒng)計分析Fig.3Statistical results of K19,p63,CD29 expression in hair follicle stem cells and normal hair follicle cells

圖4 靜電紡絲支架材料掃描電鏡觀察Fig.4SEM observation of electro-spun nano silk fibers

圖5 組織工程尿道組織學(xué)觀察Fig.5Histological observation of tissue engineered urethra constructed

3 討論

近年來，組織工程尿道的研究取得了快速發(fā)展，尿道黏膜細胞[3]、口腔黏膜細胞[4]、表皮細胞[5]等都已經(jīng)成功地被用于構(gòu)建組織工程尿道。毛囊干細胞因與表皮干細胞具有相似的特性，并且易于獲取、易于擴增[6]，而被成功用于修復(fù)裸鼠皮膚缺損[7-8]。受此啟發(fā)，彭文標等[9]嘗試用毛囊干細胞修復(fù)兔尿道缺損，并取得成功。本研究中，我們也利用毛囊干細胞作為種子細胞構(gòu)建組織工程尿道。

生物材料作為組織工程另一不可或缺的要素，亦被廣泛研究。傳統(tǒng)組織工程尿道生物支架材料的研究主要涉及天然脫細胞基質(zhì)材料，如脫細胞膀胱黏膜下筋膜[10]、尿道脫細胞基質(zhì)[11]。天然脫細胞基質(zhì)材料生物相容性好，但來源有限，且質(zhì)量不穩(wěn)定，細胞成分脫離不徹底容易導(dǎo)致免疫排斥反應(yīng)。隨著生物材料的研發(fā)和技術(shù)工藝的改進，人工材料的優(yōu)勢已經(jīng)逐步超越了天然材料。靜電紡絲技術(shù)非常適合高孔隙率的膜片材料制備[12-13]，然而，目前關(guān)于靜電紡絲材料構(gòu)建組織工程尿道的報道尚不多見。

靜電紡絲的技術(shù)優(yōu)勢在于，通過控制電場強度、紡絲液濃度可以使纖維粗細均勻[14]，通過控制滾筒接收裝置轉(zhuǎn)速，可以控制材料的孔隙率[15]。我們在預(yù)實驗中結(jié)合已有的文獻報道，確定了絲素膜、水溶性膠原蛋白粉末及PCL的質(zhì)量比為1∶1∶8，通過今后實驗的不斷探索，該制備條件還有可能得到進一步的優(yōu)化。

毛囊干細胞來源于毛囊，構(gòu)建成組織工程尿道后如果長出毛發(fā)，那就有可能重新導(dǎo)致尿道梗阻，而這是絕對要避免的。在已有的研究報道中，毛囊干細胞構(gòu)建的組織工程尿道經(jīng)過3個月的觀察，未見尿道中有毛發(fā)或結(jié)石形成[9]。研究認為，毛囊干細胞雖然來自于毛囊，但屬于毛囊中的上皮成分，應(yīng)向上皮組織定向分化，而毛發(fā)生長必須依賴毛囊中的間質(zhì)細胞成分與上皮細胞共同起作用。為了得到明確的結(jié)論，我們對體外構(gòu)建組織工程尿道又進行了組織學(xué)以及免疫組化染色觀察，結(jié)果顯示，在所有可檢測到的視野中未見毛囊組織結(jié)構(gòu)。本研究中，我們僅體外嘗試了構(gòu)建組織工程尿道膜片，對于管狀尿道的構(gòu)建并用于體內(nèi)實驗還需要進一步開展。

綜上所述，我們認為兔毛囊干細胞結(jié)合電紡納米絲素纖維能成功構(gòu)建組織工程尿道，可用于體內(nèi)修復(fù)的進一步研究。

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Study of Constructing Tissue Engineered Urethra Membrane Using Hair Follicle Stem Cells and Nano Silk Fiber in Vitro

WANG Ping1,DU Mingjun1,XIE Haibo1,FU Qiang2.1 Department of Urology,Shanghai Electric Power Hospital, 200050 Shanghai,China;2 Department of Urology,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai Sixth People's Hospital,200233 Shanghai,China.Corresponding author:FU Qiang(E-mail:jamesqfu@yahoo.com.cn).

ObjectiveTo explore feasibility of constructing tissue engineered urethra membrane using hair follicle stem cells and nano silk fiber.MethodsHair follicle stem cells were isolated by enzymatic digestion and fluorescent cell sorting, then cultured in vitro.The maximum amplification factor and colony forming rate were calculated;K19,p63,CD29 positive expression rate were tested by flow cytometry.The hair follicle stem cells were then seeded on electro-spun nano silk fibers to construct tissue engineered urethra.The construction of tissue engineered urethra in vitro was observed by histological observation and fluorescence staining.ResultsThe maximum amplification factor of rabbit hair follicle stem cells and normal hair follicle cells were(5.92±0.77)×104times and(6.61±3.62)×103times,and the colony forming rate were(9.07±1.18)%and (3.95±1.01)%respectively.The expression rate of K19,p63,CD29 in hair follicle stem cells were(89.36±6.69)%,(92.10±5.49)%, (89.98±6.89)%,and in normal hair follicle cells were(39.38±2.20)%,(40.78±2.61)%,(40.57±2.79)%.Stratified epithelium-like structure were formed after hair follicle stem cells seeded on the nano silk fibers,and AE1/AE3 staining was positive.ConclusionRabbit hair follicle stem cells combining with electro-spun nano silk fibers can successfully construct tissue engineered urethral,which can be used for the further study of in vivo repair.

Hair follicle stem cells;Electrostatic spinning;Tissue engineering;Urethra

Q813.1+2

A

1673－0364（2014）02－0069－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.02.002

國家自然科學(xué)基金項目（30973016）。

200050上海市上海電力醫(yī)院泌尿外科（王平，杜明軍，解海博）；200233上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院泌尿外科。

傅強（E-mail：jamesqfu@yahoo.com.cn）。