低氧條件下載二甲基草酰甘氨酸電紡纖維促血管化及成骨性能研究*

李家穎 楊隆君 花艷麗 陳起新 孟慶琛 李斌，韓鳳選

骨損傷是常見(jiàn)的外科疾病，較小的骨損傷可以自行愈合，而當(dāng)骨缺損范圍較大時(shí)常無(wú)法自愈。組織工程技術(shù)為骨修復(fù)提供了新途徑，但骨修復(fù)材料移植后宿主血液難以滲透入支架，導(dǎo)致局部血供不足，故其修復(fù)效果較自體骨仍有差距。血管生成在骨發(fā)育和重建等過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[1-2]。因此，除骨組織工程支架材料的成骨性能外，其血管化也是促進(jìn)骨缺損修復(fù)的重要因素。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可有效促進(jìn)血管生成，同時(shí)，VEGF 也是參與骨修復(fù)過(guò)程的一種重要活性因子，其可通過(guò)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用參與骨修復(fù)過(guò)程[3]。但是，VEGF 的有效活性和長(zhǎng)效釋放制約著其在組織工程中的應(yīng)用。骨損傷后會(huì)導(dǎo)致?lián)p傷部位血供不足，從而在損傷部位形成低氧微環(huán)境[4]。損傷部位的低氧微環(huán)境可通過(guò)產(chǎn)生HIF-1上調(diào)組織中VEGF 的表達(dá)，促進(jìn)VEGF 介導(dǎo)的血管化，而間接促進(jìn)成骨[5-6]。低氧環(huán)境可降低胞內(nèi)堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）等成骨誘導(dǎo)因子的表達(dá)，而HIF-1 可在一定程度上促進(jìn)低氧環(huán)境中細(xì)胞的成骨分化[7]。HIF-1 是持續(xù)表達(dá)的，但在常氧條件下會(huì)迅速降解，參與其降解過(guò)程的一種主要酶是脯氨酰羥化酶（prolyl hydroxylase domain，PHD）。有報(bào)道稱(chēng)，抑制PHD活性可提高內(nèi)源性HIF-1 的表達(dá)水平[8]。目前，在眾多PHD抑制劑中，二甲基草酰甘氨酸（dimethyloxallyl glycine，DMOG）具有良好的促血管生成性能和低生物毒性，因而可作為良好的血管化藥物用于血管再生[9]。既往有研究表明，穩(wěn)定HIF-1 的表達(dá)可高效促血管化[10]。而且相比于VEGF，DMOG 不易失活且成本較低，更具應(yīng)用潛力。

靜電紡絲技術(shù)是一種可制備具有微納結(jié)構(gòu)聚合物材料的技術(shù)，其在組織工程領(lǐng)域應(yīng)用極其廣泛。由靜電紡絲技術(shù)制備的生物支架材料具有極高的比表面積及孔隙率，制備的紡絲纖維可通過(guò)負(fù)載不同的藥物或者生長(zhǎng)因子刺激胞外基質(zhì)的分泌，從而利于細(xì)胞黏附、增殖及特異性分化[11]。

聚L-丙交酯-己內(nèi)酯共聚物（PLCL）是一種可生物降解的高分子材料，具有良好的生物相容性及力學(xué)強(qiáng)度[12]，已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）許可進(jìn)入臨床應(yīng)用。因此，通過(guò)靜電紡絲技術(shù)制備得到PLCL 電紡纖維（P），然后用其負(fù)載DMOG，通過(guò)電紡纖維持續(xù)低劑量控釋DMOG，上調(diào)損傷部位HIF-1 表達(dá)，從而促進(jìn)損傷部位血管化，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)骨修復(fù)。

此外，目前在組織工程中，體外評(píng)價(jià)細(xì)胞黏附、增殖和分化行為一般在常氧環(huán)境（20%）下進(jìn)行，而正常骨組織的氧分壓為5%～12.5%。因此，現(xiàn)有研究在評(píng)價(jià)材料的體外成骨性能時(shí)，將材料置于常氧環(huán)境下培養(yǎng)的方式忽視了體內(nèi)骨缺損處低氧微環(huán)境的因素，其結(jié)果也有待通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)驗(yàn)證。相較于常氧環(huán)境，低氧環(huán)境下干細(xì)胞的增殖會(huì)增強(qiáng)，干性更容易維持。所以為了更真實(shí)地反映所構(gòu)建材料的體內(nèi)成骨潛能，我們將負(fù)載DMOG 的電紡纖維（PD）在低氧的微環(huán)境下培養(yǎng)BMSC，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)考察其血管化及成骨分化潛能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及材料

PLCL（濟(jì)南岱罡生物工程有限公司）；醋酸鈣、磷酸二氫鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；二甲基草酰甘氨酸（DMOG，賽業(yè)生物科技有限公司）；無(wú)水乙醇（永華化學(xué)科技有限公司）；-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶和雙抗（碧云天生物技術(shù)有限公司）；4%多聚甲醛通用型組織固定液（科賽恩生物技術(shù)有限公司）；TritonX-100（Sigma-Aldrich）；鬼筆環(huán)肽（上海翊圣生物科技有限公司）；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）；OriCellSD 大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；ALP 染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；掃描電子顯微鏡（CarlZeiss）；f1 倒置熒光顯微鏡（EVOS）。

1.2 負(fù)載DMOG 的PLCL 電紡纖維的制備

配制含DMOG 為3%（wt/v），PLCL 為12%（wt/v）的六氟異丙醇溶液，進(jìn)行靜電紡絲即可獲得負(fù)載DMOG 的電紡纖維PD。以相同濃度的PLCL 溶液進(jìn)行電紡即可制備電紡纖維P。電紡條件為：流速為1.2 mL/h，電壓約10 kV，接收距離為10 cm。將制備的電紡纖維置于真空干燥箱中進(jìn)行干燥，以去除殘留的六氟異丙醇。

1.3 電紡纖維的形貌表征

經(jīng)導(dǎo)電膠將電紡纖維固定于樣品臺(tái)上，噴金45 s 后通過(guò)掃描電子顯微鏡（SEM）觀(guān)察電紡纖維的形貌。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

將大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）種于滅菌的電紡纖維P 和PD 表面（分別記為P 組和PD 組），用含有10%血清及1%雙抗的-MEM 培養(yǎng)基于37℃、5%CO2和常氧（20%O2）條件下進(jìn)行培養(yǎng)。此外，以接種在細(xì)胞培養(yǎng)板上的細(xì)胞作為對(duì)照組，記為Control 組。細(xì)胞貼壁后，各取一半種有BMSC 的電紡纖維P 和PD 樣品置于低氧細(xì)胞培養(yǎng)箱，在5%CO2和5%O2條件下中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 細(xì)胞形態(tài)觀(guān)察

細(xì)胞在電紡纖維P 和PD 表面培養(yǎng)3 d 后，分別用鬼筆環(huán)肽（phalloidin）和DAPI 進(jìn)行染色，然后于倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞在電紡纖維表面的形貌。

1.6 成骨及血管化檢測(cè)

將BMSC 種于細(xì)胞培養(yǎng)板中分別進(jìn)行普通培養(yǎng)和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，其中Control 組為普通培養(yǎng)組，以含10%血清及1%雙抗的-MEM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；Induction 組為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)組，以成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。將BMSC 種于電紡纖維表面，分P 和PD 組，以成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。分別于成骨誘導(dǎo)7 d和14 d后進(jìn)行堿性磷酸酶染色及茜素紅染色，并在不同時(shí)間點(diǎn)通過(guò)RT-PCR 測(cè)試成骨相關(guān)基因（ALP、Runx2、OCN、Col1）和血管生成相關(guān)基因（VEGF）的表達(dá)，評(píng)價(jià)不同電紡纖維的體外血管化及成骨性能。

2 結(jié)果

2.1 電紡纖維的形貌

通過(guò)靜電紡絲技術(shù)，分別制備了電紡纖維P 和PD。SEM結(jié)果顯示，P 為多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，纖維表面光滑；而PD 的纖維直徑有所增加，但依然具有良好的孔結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖1）。以上結(jié)果顯示所制備的電紡纖維P 和PD 均呈現(xiàn)出纖維堆積結(jié)構(gòu)并具有豐富的孔隙，從而有利于細(xì)胞黏附生長(zhǎng)及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換。

2.2 細(xì)胞在電紡纖維上的生長(zhǎng)

細(xì)胞在電紡纖維表面上培養(yǎng)3 d后的細(xì)胞骨架染色結(jié)果顯示，常氧培養(yǎng)條件下，BMSC 可在電紡纖維P 表面黏附生長(zhǎng)，且呈現(xiàn)一定的增殖趨勢(shì)，表明電紡纖維P 具有良好的生物相容性。相比于電紡纖維P，BMSC 在電紡纖維PD 表面形態(tài)更加鋪展，表明DMOG 的添加可提高電紡纖維P 的生物相容性，更利于細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)。在低氧培養(yǎng)條件下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，許多BMSC 在電紡纖維P 表面的鋪展受限，且細(xì)胞數(shù)量也不會(huì)隨時(shí)間而逐漸增多。而DMOG的加入可明顯促進(jìn)BMSC 在電紡纖維PD 表面的黏附和生長(zhǎng)，且細(xì)胞數(shù)量隨培養(yǎng)時(shí)間增多，表明電紡纖維PD 在低氧條件下可維持細(xì)胞活性（見(jiàn)圖2）。

2.3 體外成骨性能檢測(cè)

將BMSC 種于電紡纖維表面，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d 后進(jìn)行堿性磷酸酶染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，常氧培養(yǎng)條件下，電紡纖維PD可在一定程度上促進(jìn)堿性磷酸酶的表達(dá)，而低氧培養(yǎng)條件下，電紡纖維PD 表面細(xì)胞內(nèi)的堿性磷酸酶表達(dá)較弱（見(jiàn)圖3A）。但是，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d 后的茜素紅染色結(jié)果顯示，在常氧條件下，電紡纖維P 表面產(chǎn)生少量的鈣結(jié)節(jié)，負(fù)載DMOG后，電紡纖維PD 表面鈣沉積顯著增多（見(jiàn)圖3B）。而且，在低氧培養(yǎng)條件下，電紡纖維PD 表面的鈣沉積量幾乎可以覆蓋整個(gè)支架表面，遠(yuǎn)多于電紡纖維P 表面的鈣沉積量。

圖1 A、B.電紡纖維P 的SEM 圖；C、D.電紡纖維PD 的SEM 圖

圖2 常氧和低氧培養(yǎng)條件下，BMSC 在不同電紡纖維上的細(xì)胞骨架染色圖

圖3 常氧和低氧培養(yǎng)條件下，BMSC 在不同電紡纖維上的成骨分化情況：A.堿性磷酸酶染色；B.茜素紅染色

成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d及14 d后對(duì)細(xì)胞的成骨相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d 后，在常氧培養(yǎng)條件下，電紡纖維PD 表面生長(zhǎng)的細(xì)胞具有顯著的ALP 高表達(dá)趨勢(shì)。而低氧培養(yǎng)條件下，電紡纖維P 可上調(diào)ALP 表達(dá)，負(fù)載DMOG 后的電紡纖維PD 可進(jìn)一步促進(jìn)ALP 的表達(dá)（見(jiàn)圖4A）。常氧培養(yǎng)條件下，電紡纖維P 和PD 均可顯著上調(diào)Runx2 的表達(dá)，而兩者之間并無(wú)顯著差異。與常氧培養(yǎng)條件相比，電紡纖維P 和PD 在低氧培養(yǎng)條件下均可上調(diào)ALP 及Runx2 的表達(dá)。其中，負(fù)載DMOG 的PD 組可進(jìn)一步促進(jìn)低氧環(huán)境中細(xì)胞內(nèi)ALP和Runx2 的表達(dá)（見(jiàn)圖4B）。

成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d 后，在常氧培養(yǎng)條件下，電紡纖維P 可顯著上調(diào)Col1，加載DMOG 后，電紡纖維PD 可顯著上調(diào)Col1 的表達(dá)；在低氧培養(yǎng)條件下，電紡纖維PD 可上調(diào)Col1 的表達(dá)（見(jiàn)圖5A）。與Col1 表達(dá)不同的是，在常氧培養(yǎng)條件下，電紡纖維P 可顯著上調(diào)OCN 的表達(dá)，而DMOG的加入可進(jìn)一步促進(jìn)OCN 的表達(dá)；在低氧培養(yǎng)條件下，電紡纖維P 和PD 可顯著上調(diào)OCN 的表達(dá)，而DMOG 的加入并未顯著促進(jìn)OCN 的表達(dá)（見(jiàn)圖5B）。

2.4 體外血管生成性能檢測(cè)

筆者進(jìn)一步對(duì)電紡纖維的體外促血管化性能進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，常氧培養(yǎng)7 d 后，電紡纖維P 可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)VEGF表達(dá)，負(fù)載DMOG 的電紡纖維PD 可進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)VEGF 表達(dá)。低氧培養(yǎng)7 d 后，電紡纖維P 與電紡纖維PD的促VEGF 表達(dá)能力比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖6A）。常氧培養(yǎng)14 d 后，電紡纖維PD 仍然具有顯著的促VEGF 表達(dá)能力，而電紡纖維P 的促血管化能力下降。而低氧培養(yǎng)14 d 后，相對(duì)于電紡纖維P，電紡纖維PD 具有較強(qiáng)的促VEGF 表達(dá)能力，可顯著促血管化（見(jiàn)圖6B）。

圖4 BMSC 在不同電紡纖維和氧含量培養(yǎng)條件下體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d 后成骨相關(guān)基因的表達(dá)情況。A.ALP；B.Runx2

圖5 BMSC 在不同電紡纖維和氧含量培養(yǎng)條件下體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d 后成骨相關(guān)基因的表達(dá)情況。A.Col1；B.OCN

圖6 BMSC 在不同電紡纖維和氧含量培養(yǎng)條件下體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d 和14 d 后血管相關(guān)基因VEGF 的表達(dá)情況。A.7 d；B.14 d

3 討論

骨損傷后，損傷部位因?yàn)槿狈ρ┒纬傻脱跷h(huán)境，通過(guò)上調(diào)缺氧組織中VEGF 的表達(dá)可促進(jìn)血管化，從而利于骨損傷修復(fù)。因此，如何通過(guò)促進(jìn)血管化實(shí)現(xiàn)骨再生是一個(gè)重要挑戰(zhàn)。

本研究通過(guò)靜電紡絲技術(shù)制備得到PLCL 電紡纖維，用其負(fù)載DMOG 持續(xù)控釋藥物，以期通過(guò)促血管化實(shí)現(xiàn)促成骨。結(jié)果表明，本研究制備的電紡纖維具有良好的孔隙結(jié)構(gòu)。將BMSC 種于材料表面后，細(xì)胞可在電紡纖維P 和PD表面鋪展良好，展現(xiàn)出良好的生物相容性。尤其是在低氧培養(yǎng)條件下，細(xì)胞仍然可在電紡纖維PD 表面鋪展良好，表明DMOG 的加入可顯著促進(jìn)細(xì)胞黏附生長(zhǎng)。進(jìn)一步對(duì)種植在不同纖維上的BMSC 進(jìn)行低氧和常氧條件的成骨誘導(dǎo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)常氧培養(yǎng)條件下，與電紡纖維P 相比，負(fù)載DMOG的電紡纖維PD 可顯著促進(jìn)成骨相關(guān)基因ALP、Runx2、Col1及OCN 的表達(dá)。不僅如此，在低氧培養(yǎng)條件下，電紡纖維PD 仍可維持上述成骨相關(guān)基因的高表達(dá)，并通過(guò)茜素紅染色表明其可產(chǎn)生更多的鈣沉積，表明PD 展現(xiàn)出良好的體外成骨性能。此外，負(fù)載DMOG 后的電紡纖維PD 也能促進(jìn)血管化相關(guān)基因VEGF 的表達(dá)，有效促進(jìn)血管化。以上結(jié)果表明，負(fù)載DMOG 的電紡纖維有利于在骨損傷的低氧環(huán)境中促進(jìn)成骨和血管，從而具有更好的骨修復(fù)潛能。綜上所述，通過(guò)電紡纖維持續(xù)釋放DMOG，可在體外低氧環(huán)境下促進(jìn)血管化和干細(xì)胞的體外成骨分化，該生物支架材料具有良好的生物相容性及體外成骨性能，可作為優(yōu)異的骨修復(fù)材料用于骨組織工程。

本研究制備的負(fù)載DMOG 的PLCL 電紡纖維能在低氧條件下支持BMSC 的黏附生長(zhǎng)，與未負(fù)載DMOG 的電紡纖維相比能更好地促進(jìn)BMSC 的血管化及成骨分化，預(yù)期將能更好地在骨損傷低氧微環(huán)境中發(fā)揮促成骨作用。