高效液相色譜法測(cè)定靈芝提取物中尿苷和腺苷含量

席 桂 同

（中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院藥劑科，北京，100091）

中藥研究

高效液相色譜法測(cè)定靈芝提取物中尿苷和腺苷含量

席 桂 同

（中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院藥劑科，北京，100091）

目的：建立一種測(cè)定靈芝提取物中尿苷和腺苷含量的高效液相色譜法，測(cè)定不同產(chǎn)地靈芝提取物中的尿苷和腺苷的含量。方法：色譜柱：Diamonsil C18（2）（5μm，250 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相：乙腈－0.04 M KH2PO4＝9∶91；流速：1 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm，柱溫：35℃。結(jié)果：尿苷和腺苷分別在0.2～50μg·mL－1和0.1～20μg·mL－1范圍內(nèi)，峰面積與濃度的線性關(guān)系良好；尿苷和腺苷的平均準(zhǔn)確度均在99.91%～102.12%之間；日內(nèi)、日間精密度RSD均小于1.76%，樣品回收率均在94.42%～100.50%之間。6個(gè)不同產(chǎn)地的靈芝提取物中，以福建靈芝中尿苷含量和吉林靈芝中腺苷含量最高，其他5個(gè)產(chǎn)地靈芝中尿苷和腺苷含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：該方法特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，可用于測(cè)定靈芝提取物中的尿苷和腺苷含量，為靈芝提取物的評(píng)價(jià)提供參考和依據(jù)。

高效液相色譜法；靈芝提取物；尿苷；腺苷；含量測(cè)定

靈芝（Ganoderma lucidum）是一種樹(shù)生菌類，在中國(guó)作為一種治療藥草而具有超過(guò)2000年的使用歷史[1]。靈芝為紫芝或赤芝的干燥子實(shí)體[2]，主要含有三萜、生物堿、多糖、氨基酸和黃酮等多種成分[3]，具有較好地治療某些癌癥[4]、抗衰老[5]、抗炎、護(hù)肝、調(diào)節(jié)血脂、調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝[6]、抗高血壓等功效。近年來(lái)，其活性成分成為深入研究的主題，尿苷和腺苷為靈芝的主要有效成分[7]，由于靈芝提取物是靈芝類產(chǎn)品主要的來(lái)源[8]，因此對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控是十分有必要的。筆者建立了一種測(cè)定靈芝提取物中尿苷和腺苷含量的高效液相色譜法，并測(cè)定不同產(chǎn)地靈芝提取物中的尿苷和腺苷含量，旨在為靈芝提取物中有效成分尿苷和腺苷的測(cè)定提供參考和依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC－2010A型高效液相色譜儀（日本島津公司），紫外檢測(cè)器，LC－solution工作站；BS224S型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；KQ－300型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；KL－UP－Ⅱ型超純水機(jī)（臺(tái)灣艾柯公司）。

1.2 試藥 尿苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：887－200202）；腺苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110879－200202）；靈芝提取物（全國(guó)不同產(chǎn)地購(gòu)買(mǎi)的紫芝和赤芝實(shí)體，由西安康威生物工程有限公司采用統(tǒng)一的工藝提取，主要由水提、濃縮和干燥獲得）；磷酸二氫鉀（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析方法的建立

2.1.1 溶液的配制 尿苷貯備液：稱取尿苷對(duì)照品20 mg，于100 mL容量瓶中，加適量10%的甲醇溶液溶解后，繼續(xù)用10%甲醇溶液定容至刻度，搖勻，即得200 μg·mL－1的鳥(niǎo)苷貯備液，于冰箱中冷藏，備用。

腺苷貯備液：稱取腺苷對(duì)照品10 mg，于100 mL容量瓶中，加適量10%的甲醇溶液溶解后，繼續(xù)用10%甲醇溶液定容至刻度，搖勻，即得100μg·mL－1的腺苷貯備液，于冰箱中冷藏，備用。

樣品溶液：取靈芝提取物0.2 g，于25 m L容量瓶中，加入適量10%的甲醇溶液，超聲10 min后，繼續(xù)用10%甲醇溶液定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.22μm的有機(jī)系濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為樣品溶液，備用。

2.1.2 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（2）（5μm，250 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相：乙腈－0.04 M KH2PO4＝9∶91；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；進(jìn)樣體積：20μL。

2.1.3 特異性 分別取腺苷、尿苷儲(chǔ)備液稀釋20倍后的溶液及靈芝提取物樣品溶液按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，尿苷、腺苷分別于7.0 min、8.9 min左右出峰，峰形良好，且靈芝提取物中的內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)腺苷和尿苷的測(cè)定無(wú)干擾。（見(jiàn)圖1）

圖1 典型HPLC色譜圖

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 精密吸取尿苷和腺苷對(duì)照品貯備液適量混勻，用水逐級(jí)稀釋成尿苷濃度為50、20、10、5.0、2.0、1.0、0.5、0.2μg·mL－1，腺尿苷濃度為20、10、5.0、2.0、1.0、0.5、0.2、0.1μg·mL－1的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。按“2.1.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以峰面積（X）為橫坐標(biāo)，以濃度（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得尿苷線性回歸方程為：Y＝34 561X－72.892 3（R＝0.999 98），腺苷線性回歸方程為Y＝29 805X－109.341 7（R＝0.999 98），結(jié)果表明，尿苷和腺苷分別在0.2～50μg·mL－1和0.1～20μg· m L－1范圍內(nèi)，峰面積與濃度的線性關(guān)系良好。

2.1.5 定量下限 以標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低濃度點(diǎn)為定量下限，則尿苷的定量下限（LLOQ）為0.2μg·mL－1（S/N＞10），腺苷的定量下限為0.1μg·mL－1。用10%的甲醇溶液配制濃度分別為0.2μg·m L－1的尿苷溶液和0.1μg·mL－1的腺苷混合溶液6份，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣分析，記錄峰面積。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算尿苷和腺苷的濃度，考察樣品的準(zhǔn)確度和RSD。結(jié)果表明，尿苷樣品平均準(zhǔn)確度為100.7%，RSD為0.95%，腺苷樣品的平均準(zhǔn)確度為99.89%，RSD為1.03%，符合含量測(cè)定的要求。

2.1.6 準(zhǔn)確度 用10%甲醇溶液配制低、中、高濃度的尿苷（0.5、5.0、40μg·mL－1）和腺苷（0.2、2.0、16 μg·mL－1）混合溶液5份，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣分析，記錄峰面積。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算尿苷和腺苷的濃度，以測(cè)得值與理論值的比計(jì)算準(zhǔn)確度，結(jié)果顯示，低、中、高濃度的尿苷平均準(zhǔn)確度在99.91%～101.01%之間，RSD均小于1.48%；低、中、高濃度的腺苷平均準(zhǔn)確度在100.41%～102.12%之間，RSD均小于1.03%，滿足含量測(cè)定要求。

2.1.7 精密度 用10%甲醇溶液配制低、中、高濃度的尿苷（0.5、5.0、40μg·mL－1）和腺苷（0.2、2.0、16 μg·mL－1）混合溶液5份，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣分析，記錄峰面積。1日內(nèi)連續(xù)測(cè)定5次，連續(xù)測(cè)定3 d。結(jié)果尿苷的日內(nèi)、日間精密度RSD均小于1.76%，腺苷的日內(nèi)、日間精密度RSD均小于1.82%。

2.1.8 加樣回收率 取已知含量的靈芝提取物（尿苷1.103 mg/g、腺苷0.769 mg/g）0.2 g，分別按照其含量的80%、100%、120%精密加入尿苷和腺苷貯備液適量，各平行3份，按“2.1.1”項(xiàng)下方法配制樣品溶液，進(jìn)樣分析，以（測(cè)得量－樣品中的量）/加入量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果尿苷低、中、高濃度的加樣回收率均在96.24%～100.50%之間，RSD值均小于1.78%，腺苷低、中、高濃度的加樣回收率均在94.42%～99.86%之間，RSD值均小于1.69%。（見(jiàn)表1、表2）

2.1.9 穩(wěn)定性 用10%的甲醇溶液分別配制低、中、高濃度的尿苷（0.5、5.0、40μg·mL－1）和腺苷（0.2、2.0、16μg·mL－1）混合溶液各5份，于4℃冰箱中放置，并分別于0、12、24、48 h取樣，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件分析。記錄不同放置時(shí)間點(diǎn)尿苷和腺苷的峰面積，并與0小時(shí)的峰面積相比較，觀察放置過(guò)程中樣品的變化情況。結(jié)果3個(gè)濃度的尿苷和腺苷在不同時(shí)間的含量RSD均小于1.76%，表明尿苷和腺苷溶液4℃放置48 h基本穩(wěn)定，提示尿苷和腺苷樣品于4℃條件下放置48 h內(nèi)測(cè)定完即可。

表1 HPLC－UV法測(cè)定靈芝提取液中尿苷含量的回收率（n＝3）

表2 HPLC－UV法測(cè)定靈芝提取液中腺苷含量的回收率（n＝3）

2.2 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行處理。計(jì)量資料采用“均值±SD”表示，組間差異采用t檢驗(yàn)。P＞0.05，代表差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P＜0.05，代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P＜0.01，代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 不同產(chǎn)地靈芝提取物中尿苷和腺苷的含量測(cè)定（n＝3，mean±SD）

2.3 樣品含量測(cè)定 取來(lái)自6個(gè)不同來(lái)源地的靈芝提取物各3批，按照“2.1.1”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，經(jīng)“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算靈芝提取物中尿苷和腺苷的含量。結(jié)果表明，產(chǎn)自福建的靈芝中尿苷含量較其他5個(gè)產(chǎn)地的均高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，但其他5個(gè)產(chǎn)地之間靈芝中尿苷含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，產(chǎn)自吉林的靈芝中腺苷含量顯著高于另外其他5個(gè)產(chǎn)地的靈芝，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，但其他5個(gè)產(chǎn)地間靈芝中腺苷含量的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，從結(jié)果中可以看出，同一產(chǎn)地的不同批靈芝提取物中，尿苷和腺苷的含量以及含量的總量均存在一定的差異。（見(jiàn)表3）。

3 討論

3.1 樣品溶液的制備 參考常用的中藥有效成分樣品溶液的制備方法[9]，并結(jié)合尿苷和腺苷的基本理化性質(zhì)，本文預(yù)實(shí)驗(yàn)中分別對(duì)溶劑（10%、20%和50%的甲醇溶液）和超聲時(shí)間（10、20、40 min）進(jìn)行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)以10%甲醇為溶劑時(shí)，制備的樣品中尿苷和腺苷含量最高，且樣品中雜質(zhì)對(duì)有效成分的測(cè)定無(wú)干擾。同時(shí)，超聲處理發(fā)現(xiàn)不同超聲時(shí)間下樣品中尿苷和腺苷的含量基本一致，無(wú)顯著性差異，因此，最終樣品制備時(shí)選擇了10%的甲醇超聲10 min。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng) 采用高效液相色譜－紫外分光光度法測(cè)定尿苷和腺苷時(shí)，選用的波長(zhǎng)多為254 nm[10－11]和260nm[12]。為進(jìn)行進(jìn)一步的確證，本研究在200～400 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)尿苷、腺苷溶液以及樣品溶液進(jìn)行紫外吸光度的掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在262 nm處尿苷有最大的吸收值，而在260 nm處腺苷有最大的吸收值，考慮到樣品中尿苷的含量大于腺苷的含量，最終以260 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 流動(dòng)相 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[13]，采用甲醇和水的梯度洗脫能將尿苷、腺苷及提取物中的其他成分有效分離，但梯度洗脫的時(shí)間較長(zhǎng)，通常在約40 min[14]，且色譜柱的平衡本身需要一定的時(shí)間。因此，為尋找一種更加快速、簡(jiǎn)便的分析條件，本研究分別考察了甲醇－0.5%磷酸溶液（10∶90）、乙腈－0.5%磷酸水溶液（10∶90）、甲醇－0.04M KH2PO4（9∶91）、乙腈－0.04 M KH2PO4（9∶91）4種流動(dòng)相。結(jié)果表明，以乙腈－0.04 M KH2PO4（9∶91）為流動(dòng)相時(shí)，所得的色譜圖峰形良好，且分離效果佳，所以最終確定流動(dòng)相為乙腈－0.04 M KH2PO4＝9∶91。

3.4 提取物中的尿苷和腺苷含量 從表3中的樣品測(cè)定結(jié)果可以看出，同一產(chǎn)地不同批次的靈芝提取物中尿苷及腺苷含量均存在一定程度的差異，這可能是和藥材的質(zhì)量、投料是否足量以及提取工藝穩(wěn)定性相關(guān)。因此，制定量化的指標(biāo)是控制靈芝提取物內(nèi)在質(zhì)量和保證其臨床療效的有效途徑。

綜上所述，本文采用高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地的靈芝提取物中尿苷和腺苷的含量，該方法不但操作簡(jiǎn)便、可行，且專屬性強(qiáng)、精密度及準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，分析時(shí)間短，可作為尿苷和腺苷定量分析的一種手段，為尿苷和腺苷的測(cè)定提供了參考和依據(jù)。

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（2014－01－23收稿 責(zé)任編輯：曹柏）

Determ ination of Uridine and Adenosine Content of Ganoderma Lucidum Extract by HPLC

Xi Guitong
（Pharmacy Departmentof Xiyuan Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100091，China）

Objective：To establish a HPLCmethod to determ ine uridine and adenosine content of Ganoderma lucidum extract，and determine content ofuridine and adenosine in Ganoderma lucidum extract in different habitats.Methods：The chromatographic column was Diamonsil C18（2）（5μm，250×4.6 mm）；themobile phase acetonitrile was-0.04 M KH2PO4＝9：91；the flow rate was 1 mL，min－1；the detection wavelength was260 nm；the column temperature was35℃.Results：The range of uridine and adenosine was respectively in 0.2～50μg·m L－1and 0.1～20μg·mL－1，and the linear relationship between concentration and peak area were good；the average accuracy of uridine and adenosine were both between 99.91 to 102.12%；day and inter day RSD were less than 1.76%，and sample recovery rate werewithin 94.42%to100.50%.Among the extract of Ganoderma lucidum in the6 differentareas，the highest uridine content contained in Ganoderma lucidum in Fujian and highestadenosine content appeared in Jilin，and there were no statistical differences of uridine and adenosine content of Ganoderma lucidum in the other 5 places.Conclusion：Themethod is specific，accurate，reproducible，and can be used for determination of uridine and adenosine in ganoderma extract，which provides the reference and basis for evaluation of Ganoderma lucidum extract.

High performance liquid chromatography；Ganoderma lucidum；Uridine；Adenosine；Content determination

R284.2

A

10.3969/j.issn.1673－7202.2014.07.030