染料木素對非小細(xì)胞型肺癌A549/DDP細(xì)胞增殖和凋亡的影響①

任 彥 陸紅玲 宋永祥 李大玉 徐 剛 (遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心胸外科，遵義563099)

染料木素對非小細(xì)胞型肺癌A549/DDP細(xì)胞增殖和凋亡的影響①

任 彥 陸紅玲②宋永祥 李大玉②徐 剛 (遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心胸外科，遵義563099)

目的:觀察染料木素(genistein)對人非小細(xì)胞型肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)A549/DDP細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法:培養(yǎng)A549及A549/DDP細(xì)胞株，以A549細(xì)胞為對照。①M(fèi)TT法測定A549及A549/DDP細(xì)胞對順鉑的 IC50值、耐藥倍數(shù)及細(xì)胞增殖抑制率;②測定0、1.25、2.5、5.0、10、20、40、60、80 μg/ml染料木素作用48 h 對 A549/DDP 細(xì)胞增殖的抑制率及IC50值;③用6.25、12.5、25 μg/ml染料木素處理A549/DDP細(xì)胞24 h后，經(jīng)流式細(xì)胞計量儀檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果:①A549及A549/DDP細(xì)胞對順鉑的IC50值分別為33.6 μmol/L和76.9 μmol/L，耐藥倍數(shù)為2.3;細(xì)胞增殖抑制率隨順鉑濃度增加而逐漸加大;②染料木素對A549/DDP細(xì)胞生長的影響，隨染料木素濃度增加表現(xiàn)為先促增殖后抑制的作用，其對 A549 及 A549/DDP 細(xì)胞的 IC50值分別為 85.1 μg/ml和 80.2 μg/ml;③6.25、12.5、25 μg/ml染料木素作用于A549/DDP細(xì)胞24 h后，隨染料木素濃度的增加，停留于G2/M期的細(xì)胞數(shù)逐漸增多(P＜0.05)，同時A549/DDP細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。結(jié)論:染料木素可抑制A549/DDP細(xì)胞的生長，將細(xì)胞阻滯于G2/M期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

染料木素;人非小細(xì)胞型肺癌A549/DDP細(xì)胞;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡

肺癌是對人類健康和生命威脅最嚴(yán)重的腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率居各類惡性腫瘤的前列[1]。據(jù)報道，惡性腫瘤局部治療(手術(shù)或放療)前給予的化療，可明顯提高病人的生存率[2]。順鉑(Cisplatine，DDP)是非小細(xì)胞型肺癌(NSCLC)化療方案中的一線藥物，但其療效一直不盡人意，主要原因是肺癌耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生[3]。染料木素(Genistein)屬于異黃酮類化合物，具有多種生物學(xué)活性[4]。大量體外實(shí)驗(yàn)表明[5-10]，染料木素可抑制胃癌、宮頸癌、前列腺癌等癌細(xì)胞生長和刺激分化，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，具有一定的抗腫瘤作用。但關(guān)于染料木素對耐順鉑的人非小細(xì)胞肺癌A549/DDP細(xì)胞生長的影響少有報道。本實(shí)驗(yàn)采用A549/DDP細(xì)胞株為研究對象，觀察染料木素對A549/DDP細(xì)胞增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 非小細(xì)胞型肺癌A549及A549/ DDP細(xì)胞株(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院)，RP-

MI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone公司)，MTT試劑(Amresco公司)，順鉑(DDP，TCI東京化成工業(yè)株式會社)，染料木素(美國 Sigma公司，純度≥98%)，其余為國產(chǎn)試劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將A549/DDP細(xì)胞和 A549細(xì)胞分別接種于含10%胎牛血清及1%雙抗的完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d傳代1次。

1.2.2 MTT法檢測 A549/DDP細(xì)胞對順鉑的耐藥性:取對數(shù)生長期的A549和A549/DDP細(xì)胞，制成2.5 ×104ml－1的細(xì)胞懸液，按每孔 90 μl分別接種于96孔板中(空白對照組加入等體積不含細(xì)胞的培養(yǎng)液)，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁生長24 h，分別加入不同濃度的DDP工作液10 μl(DDP液的濃度依次為:0、1.25、2.5、5.0、10、20、40、80、160 μmol/L)，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔，再培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 mg/ml的 MTT 溶液 10 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，棄去 96 孔培養(yǎng)板中的液體，每孔加入200 μl DMSO，置搖床避光輕輕振搖10 min，在全自動酶標(biāo)儀波長為565 nm處測定吸光度值(OD值)。根據(jù)OD值計算出細(xì)胞生長抑制率、細(xì)胞半數(shù)抑制率(IC50)及耐藥倍數(shù)。

1.2.3 MTT法測定染料木素對A549和A549/DDP細(xì)胞的增殖抑制率 A549及A549/DDP細(xì)胞處理同前。在96孔板中分別加入10 μl不同濃度的染料木素工作液(0、1.25、2.5、5.0、10、20、40、60、80 μg/ml)作用48 h。按上述方法，測定染料木素對細(xì)胞的IC50值及細(xì)胞增殖抑制率。

1.2.4 流式細(xì)胞計量儀檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期將A549/DDP細(xì)胞(1×105細(xì)胞/ml)接種于6孔培養(yǎng)板中，分別用不同濃度的染料木素(0、6.25、12.5、25 μg/ml)處理24 h 后，消化收集細(xì)胞。加入預(yù)冷無水乙醇慢搖5次，放入4℃保存。18 h后取出細(xì)胞加入RNase，置37℃孵箱反應(yīng)30 min后取出，加入濃度為1 mg/ml的碘化丙啶(PI)，避光反應(yīng)30 min后，用流式細(xì)胞計量儀檢測細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期的分布情況。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測結(jié)果 ①用不同濃度 DDP作用A549/DDP和 A549細(xì)胞48 h后，與A549細(xì)胞相比，A549/DDP細(xì)胞對DDP作用不敏感，當(dāng)DDP濃度＞20 μmol/L后，細(xì)胞生長才出現(xiàn)明顯抑制(見圖1)。所計算出兩種細(xì)胞IC50值分別為76.9和33.6 μM，耐藥倍數(shù)為2.3。②不同濃度染料木素作用A549/DDP和A549細(xì)胞48 h后，MTT結(jié)果顯示，隨藥物濃度增加，兩種細(xì)胞生長均呈現(xiàn)出先誘導(dǎo)后抑制的作用，以A549細(xì)胞生長變化較大(見圖2)。兩種細(xì)胞的 IC50值分別為 85.1 和 80.2 μg/ml，二者比較無統(tǒng)計學(xué)差異。

圖1 不同濃度DDP作用A549和A549/DDP細(xì)胞48 h后細(xì)胞生長的抑制率Fig.1 Inhibition ratio of A549/DDP after 48 hours treatment with different concentration of DDP

圖2 不同濃度染料木素作用A549和A549/DDP細(xì)胞48 h后細(xì)胞生長的抑制率Fig.2 Inhibition ratio of A549/DDP after 48 hours treatment with different concentration of genistein

表1 染料木素作用A549及A549/DDP細(xì)胞24 h的細(xì)胞凋亡情況(%)Tab.1 Apoptotic rate of A549 and A549/DDP after 24 hours treatment with genistein

圖3 不同濃度染料木素作用于A549及A549/DDP細(xì)胞24 h的DNA組方圖Fig.3 DNA content figure of A549 and A549/DDP cells after 24 hours treatment with genistein

表2 染料木素作用于A549及A549/DDP細(xì)胞24 h各細(xì)胞周期的細(xì)胞數(shù)Tab.2 Cell counts of A549 and A549/DDP in cell cycle after 24 hours treatment with genistein

圖4 不同濃度染料木素作用A549及A549/DDP的細(xì)胞周期分析圖Fig.4 Cell cycle analysis figure of A549 and A549/DDP after 24 hours treatment with different concentration genistein

2.2 流式細(xì)胞計量儀檢測染料木素對 A549和A549/DDP細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響 染料木素作用A549和A549/DDP細(xì)胞24 h后，隨染料木素濃度增加，細(xì)胞凋亡比例有增加趨勢(表1)，組方圖提示細(xì)胞DNA含量減少，并出現(xiàn)凋亡特有的標(biāo)志，即“G1亞峰”，見圖3。細(xì)胞周期檢測結(jié)果提示，隨染料木素濃度增加，停滯于G2/M期的細(xì)胞數(shù)逐漸增多，見表2、圖4。

3 討論

盡管目前對癌癥的治療手段和方法越來越多，但大部分惡性腫瘤的治療仍不理想，肺癌也是如此。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，肺癌術(shù)后5年生存率為15%，而在我國甚至低于10%[2]。因此，綜合治療仍然是NSCLC治療的主要方法。順鉑具有廣泛的抗瘤譜，是NSCLC化療方案中的一線藥物。然而，腫瘤細(xì)胞固有的以及獲得性的耐藥問題，嚴(yán)重阻礙了藥物的作用，影響化療的預(yù)后[11]。染料木素屬于具有弱雌激素樣作用的異黃酮類化合物，存在于人及動物食用的各種植物中，具有多種生物學(xué)活性，是大豆有效抑癌成分之一[4]。大量研究已經(jīng)證明，染料木素具有廣泛的抗惡性細(xì)胞增殖作用，能誘導(dǎo)惡性細(xì)胞的分化，抑制細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和侵襲以及腫瘤的轉(zhuǎn)移[12-15]。

本實(shí)驗(yàn)采用的是耐順鉑的人非小細(xì)胞性肺癌細(xì)胞株A549/DDP，與 A549細(xì)胞相比，A549/DDP對順鉑的耐藥倍數(shù)為2.3，可應(yīng)用于本實(shí)驗(yàn)的后續(xù)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，染料木素作用A549及A549/ DDP 細(xì)胞時，IC50值分別為 85.1 μg/ml和 80.2 μg/ ml，二者比較無統(tǒng)計學(xué)差異，表明染料木素對兩種細(xì)胞株的作用一致。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果觀察到，隨著染料木素濃度的逐漸增加，細(xì)胞周期開始出現(xiàn)改變，結(jié)果顯示25 μg/ml的染料木素作用于細(xì)胞24 h后，DNA含量比未用藥時明顯減少(圖3)，停滯于G2/M期的細(xì)胞數(shù)增多，細(xì)胞開始出現(xiàn)凋亡，推測染料木素可以使A549/DDP細(xì)胞于G2/M調(diào)控點(diǎn)阻滯。此外本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)染料木素濃度為0～20 μg/ml時，對A549及A549/DDP細(xì)胞均有促進(jìn)增殖作用(對A549細(xì)胞作用更明顯)，而當(dāng)染料木素濃度大于20 μg/ml時，兩株細(xì)胞開始呈現(xiàn)劑量依賴性生長抑制現(xiàn)象(見圖2)。有文獻(xiàn)報道染料木素可能是雌激素受體的調(diào)節(jié)劑，通過與雌激素受體(ER)結(jié)合，表現(xiàn)出雌激素活性和抗雌激素活性[16]，這兩種重要的生物學(xué)活性對于癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展起著關(guān)鍵作用。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測，由于染料木素結(jié)構(gòu)與雌二醇具有一定的相似性，染料木素可能先發(fā)揮其弱雌激素樣活性，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖;隨著染料木素濃度的逐漸增高，繼而發(fā)揮其抗雌激素活性，從而起到抑制癌細(xì)胞生長的作用。但上述實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象尚有待進(jìn)一步研究。

本文借此向中科院生物物理研究所衛(wèi)濤濤研究員、姜鵬濤博士對本實(shí)驗(yàn)研究提供的幫助表示衷心的感謝。

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[收稿2013-11-25 修回2013-12-12]

(編輯 許四平)

Effects of genistein on proliferation and apoptosis of human non-small cell lung cancer cell line A549/DDP

REN Yan，LU Hong-Ling，SONG Yong-Xiang，LI Da-Yu，XU Gang.Department of Thoracic Cardiac Surgery，the Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Zunyi 563099，China

Objective:To observe the effects of genistein on proliferation and apoptosis of human non-small cell lung cancer cell line A549/DDP.Methods①M(fèi)TT assay was applied to evaluate the resistance index of A549/DDP cell line to cisplatin and half inhibitory concentration(IC50).②Inhibition rate of A549/DDP cell proliferation and IC50value were evaluated by MTT assay after treatment with 0，1.25，2.5，5.0，10，20，40，60，80 μg/ml genistein for 48 hour respectively.③A549/DDP cell cycle and apoptosis were evaluated by flow cytometry after treatment with 6.25，12.5，25 μg/ml genistein for 24 hours respectively.Results①In exposing to cisplatin，the IC50of A549 and A549/DDP was 33.6 μmol/L and 76.9 μmol/L respectively.The resistance index was 2.3.Cell growth inhibition rate increased following the cisplatin concentration increasing gradually.②A549/DDP growth inhibition rate increased at first and later decreased gradually following treatment with the genistein dose increased.The IC50of A549 and A549/DDP was about 85.1 μg/ml and 80.2 μg/ml respectively.③After treatment with 6.25，12.5，25 μg/ml genistein for 24 hours，there were more A549/DDP cells arresting and showing apoptosis along with the genistein dose increased.ConclusionGenistein can inhibit A549/DDP proliferation，cause A549/DDP arresting in G2/M phase and induce A549/DDP cell apoptosis with dose dependently.

Genistein;Human non-small cell lung cancer cell line A549/DDP;Proliferation;Apoptosis

R735.1

A

1000-484X(2014)05-0669-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.022

①本文受貴州省科學(xué)技術(shù)基金(No.黔科合J字LKZ[2010]20)資助。

②遵義醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，遵義563099。

任 彥(1988年－)，女，住院醫(yī)師，主要從事肺癌的發(fā)病機(jī)理及防治的研究。

及指導(dǎo)教師:徐 剛(1966年－)，男，主任醫(yī)師，主要從事肺癌的發(fā)病機(jī)理及防治的研究。