醫(yī)學(xué)真菌菌株保藏方法概述

桑軍軍 鄧淑文 郭凱 潘煒華 廖萬(wàn)清

(1.上海長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所全軍真菌病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚科，上海 200003;2.上海市醫(yī)學(xué)真菌分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，上海 200003;3.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院血液科，上海 200433)

1 醫(yī)學(xué)真菌保藏的背景及意義

微生物菌種保藏是一項(xiàng)重要的微生物學(xué)基礎(chǔ)工作。為此，在國(guó)際上一些發(fā)達(dá)的國(guó)家中都設(shè)有相應(yīng)的菌種保藏機(jī)構(gòu)。例如:美國(guó)典型菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、荷蘭的真菌保藏中心 (Centraalbureau voor Schimmelcultures，CBS)、英國(guó)的國(guó)家典型菌種保藏所 (National CollectionofTypeCultures，NCTC)等。我國(guó)也設(shè)有多個(gè)菌種保藏中心，涉及工業(yè)、農(nóng)業(yè)及醫(yī)學(xué)等多個(gè)方面。例如中國(guó)普通微生物管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)。近10 a來(lái)，由于廣譜抗菌藥、糖皮質(zhì)激素、細(xì)胞毒性藥物、免疫抑制劑等藥物的廣泛應(yīng)用，以及各種器官移植術(shù)、導(dǎo)管介入治療、放射治療等多種醫(yī)療手段的開展，人為地改變了微生物與宿主之間的關(guān)系，造成了患者體內(nèi)菌群失調(diào)，為真菌感染提供了良好的環(huán)境［1］。隨著老齡化的加快、HIV感染患者增加、惡性腫瘤的發(fā)病率增加，真菌感染的易感人群也在增大［2］。各種抗真菌藥物的頻繁使用，導(dǎo)致真菌菌株的耐藥性越來(lái)越嚴(yán)重。所以對(duì)真菌病流行病學(xué)、致病機(jī)理、耐藥機(jī)理以及防治策略的研究尤為重要，而所有研究的基礎(chǔ)都建立在對(duì)醫(yī)學(xué)真菌的進(jìn)行有效的保藏。醫(yī)學(xué)真菌的保藏對(duì)研究其致病機(jī)理、耐藥趨勢(shì)、系統(tǒng)進(jìn)化都有重要意義。

2 醫(yī)學(xué)真菌保藏的原理及要求

醫(yī)學(xué)真菌保藏的原理同其他微生物的保藏原理相同。通過(guò)低溫、干燥、隔絕空氣等方法，降低真菌的新陳代謝，最大的延長(zhǎng)其保藏時(shí)間。理論上，只要至少滿足其中一個(gè)條件，就可以對(duì)菌種進(jìn)行保藏。

醫(yī)學(xué)真菌保藏的要滿足3個(gè)條件:1)保持菌株的純度和活性;2)維持形態(tài)學(xué)、生理學(xué)以及致病力的穩(wěn)定;3)保持基因的完整性，避免菌株變異。

3 醫(yī)學(xué)真菌保藏的方法

目前醫(yī)學(xué)真菌的保藏方法有很多種。主要有定期移植法、液體石蠟法、無(wú)菌蒸餾水法、濾紙法、冷凍保藏法、冷凍干燥保藏法等，可以把醫(yī)學(xué)真菌保藏總結(jié)為以下幾種方法。

3.1 傳代培養(yǎng)保藏法

傳代培養(yǎng)法是將菌種定期接種到適宜菌株生長(zhǎng)的培養(yǎng)基上，然后放入室溫或4℃保藏。斜面接種傳代保藏法是最常用的方法。它可用于實(shí)驗(yàn)室中各類醫(yī)學(xué)真菌的保藏，而且簡(jiǎn)單易行，且不要求任何特殊的設(shè)備。但是此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯、基因突變、菌株污染等現(xiàn)象。在臨床工作中，傳代培養(yǎng)法需要耗費(fèi)大量的時(shí)間和人力，而臨床上收集到的大量病原真菌很難按照其要求進(jìn)行定期的轉(zhuǎn)接。因此此法適用于少量菌株的短期保藏，不適宜大量菌株的長(zhǎng)期保藏。一般酵母菌于4℃保藏，每4～6個(gè)月移接1次;絲狀真菌 (霉菌)于4℃保藏，每6個(gè)月移接1次。

3.2 蒸餾水保藏法

蒸餾水保藏法是將菌種懸浮于無(wú)菌蒸餾水中，將容器密封，于室溫或4℃等溫度保藏。蒸餾水保藏法對(duì)于大部分醫(yī)學(xué)真菌的長(zhǎng)期保藏是十分有效的。Fernandez等［3］對(duì)102株保藏在蒸餾水中的組織胞漿菌和隱球菌(92%菌株保藏時(shí)間＞10 a)進(jìn)行復(fù)蘇，莢膜組織胞漿菌、新生隱球菌和格特隱球菌的成活率分別為 64.3%、79.1% 和 100%。Dana［4］在對(duì)在蒸餾水中5℃保藏20 a的69株擔(dān)子菌綱的菌株進(jìn)行復(fù)蘇，82.6%的菌株仍然有很強(qiáng)的活力。Bueno等［5］觀察了曲霉等26中絲狀真菌在蒸餾水中的保藏情況，在2 a內(nèi)全部都有活性，未發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)變化。Andrew等［6］對(duì)保藏在蒸餾水中2個(gè)月～21 a的179株真菌進(jìn)行了復(fù)蘇，其復(fù)蘇率達(dá)到了90%。章強(qiáng)強(qiáng)等對(duì)蒸餾水法和冷凍干燥法對(duì)78株菌株保藏情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，12 a后其生存率分別為89.7%和87.2%。結(jié)果表明，蒸餾水保藏法是簡(jiǎn)單、廉價(jià)和可靠的保藏方法［7］。但是也有研究顯示，菌株在蒸餾水長(zhǎng)期保藏其某些性狀可能會(huì)發(fā)生改變，例如形態(tài)學(xué)和一些酶類的改變。Katia等人對(duì)白念珠菌常溫蒸餾水保藏和SDA培養(yǎng)基保藏180 d前后進(jìn)行形態(tài)學(xué)和酶學(xué)的方法鑒定，其形態(tài)及酶的產(chǎn)生均有所改變［8］。蒸餾水保藏法長(zhǎng)期保藏對(duì)菌種形態(tài)學(xué)、生理學(xué)以及基因的影響還有待進(jìn)一步研究。對(duì)于條件有限的基層醫(yī)院或?qū)嶒?yàn)室，蒸餾水保藏法是一個(gè)經(jīng)濟(jì)有效的長(zhǎng)期保藏菌株的方法。

3.3 隔絕空氣法

隔絕空氣法是將礦物油、甘油、液體石蠟等對(duì)菌株生長(zhǎng)無(wú)害的基質(zhì)覆蓋于培養(yǎng)基上，是菌株浸入基質(zhì)中以達(dá)到隔絕空氣的目的。以礦物油保藏法為例，將瓊脂斜面或液體培養(yǎng)物浸入滅菌的礦物油，礦物油的用量以高出培養(yǎng)物1 cm為宜，并以橡皮塞代替封口，豎直放置于室溫下或4℃冰箱中保藏。保藏時(shí)間延長(zhǎng)一般為1～2 a。Manoel等人觀察了礦物油保藏對(duì)傘枝犁頭霉和布氏犁頭霉形態(tài)學(xué)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)礦物油不影響其營(yíng)養(yǎng)和無(wú)性生殖形態(tài)［9］。要注意的是，某些菌株能利用石蠟為碳源，還有些菌株對(duì)液體石蠟保藏敏感。所有可以利用基質(zhì)或?qū)|(zhì)敏感的菌株應(yīng)避免用此種方法保藏。此方法簡(jiǎn)便有效，不需要特殊的設(shè)備，不需要經(jīng)常轉(zhuǎn)種，可用于大部分醫(yī)學(xué)真菌的保藏，特別對(duì)難于冷凍干燥的絲狀真菌和難以在固體培養(yǎng)基上形成孢子的擔(dān)子菌等的保藏更為有效。但是保存時(shí)，需要直立放置，所占空間較大，且不便于攜帶和轉(zhuǎn)移。

3.4 載體保藏法

載體保藏法是將真菌吸附在適當(dāng)?shù)妮d體，如土壤、沙子、硅膠、濾紙、有孔玻璃珠、脫水明膠上，而后進(jìn)行干燥，以保藏菌種［10-11］。此法適用于產(chǎn)孢子或芽孢的微生物的保藏。以沙土保藏法和濾紙保藏法為例。沙土保藏法是將真菌孢子懸液加入滅菌的沙土中，經(jīng)真空干燥后，于低溫或常溫保藏，保存期可長(zhǎng)達(dá)十年。濾紙保藏法是將要要保藏的真菌孢子吸附在滅菌濾紙上，干燥后冷藏。其方法是將濾紙剪成小條，放入干燥的培養(yǎng)皿中滅菌。將培養(yǎng)好的菌種用滅菌脫脂乳或奶粉復(fù)原乳制成孢子懸液，用滅菌鑷子將準(zhǔn)備好的濾紙條在滅菌操作下浸入菌懸液中，取出后放入滅菌小試管中，在真空干燥機(jī)上抽干，冷藏。Renata等［12］觀察了沙土保藏法對(duì)雙相真菌的活性、形態(tài)學(xué)和二態(tài)性的影響，發(fā)現(xiàn)雙相真菌很難在土壤中長(zhǎng)期保藏。

3.5 冷凍保藏法

冷凍保藏法是將菌株放入低溫保藏的方法，可分為低溫冰箱保藏法 (-20℃、-40℃、-80℃)、干冰保藏法(約-70℃)和液氮保藏法 (-196℃)。通過(guò)冷凍，將真菌體內(nèi)水分凝結(jié)，從而降低其代謝速度，達(dá)到長(zhǎng)期保藏的目的。以-80℃冰箱保藏法為例，先離心收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期或穩(wěn)定期的真菌，用新鮮培養(yǎng)基懸浮后加入等體積的冷凍保護(hù)劑，混勻后分裝入冷凍管中，以1℃/min控制性降溫至-30℃左右，于-80℃超低溫冰箱中保藏。很多因素影響保藏菌株的活力、表型及其潛在的基因完整性，它們包括保藏溫度、保護(hù)劑的種類、保藏前的狀態(tài)、降溫速度、融解速度等［13］。一般而言，冷凍溫度愈低，效果愈好，液氮中保藏的菌種的存活率遠(yuǎn)比其他保藏方法高且回復(fù)突變的發(fā)生率極低。但是在冷凍的過(guò)程中，會(huì)出現(xiàn)凍傷的現(xiàn)象。凍傷來(lái)源于pH的改變、緩沖液的凝結(jié)、溶解的氣體、電解質(zhì)濃度變化、細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶、菌體收縮等因素。水凝結(jié)的物理效應(yīng)可以破壞細(xì)胞膜［14］，低溫過(guò)程中冰晶的產(chǎn)生可能會(huì)給細(xì)胞帶來(lái)致命的傷害。所以在保藏過(guò)程中，降溫和融解的過(guò)程是需要控制的，慢速的降溫和快速的融解可以得到較高的復(fù)活率。一般認(rèn)為-1℃/min對(duì)大多數(shù)醫(yī)學(xué)真菌都是安全的［14］。在菌種復(fù)活時(shí)，要盡快融解，可以放到菌種正常生長(zhǎng)溫度的水浴鍋里融解。為了保藏的結(jié)果更加令人滿意，通常在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護(hù)劑，例如甘油、海藻糖、DMSO等。Gujjari等［15］研究了啤酒酵母在4種保護(hù)劑 (DMSO、甘油、山梨醇、蔗糖)在2種溫度 (-80℃、液氮)下菌株保藏情況。8種不同保藏模式下的菌株分別在5個(gè)時(shí)間點(diǎn) (0、6、20、40、55個(gè)月)取出。以山梨醇為保護(hù)劑在-80℃保藏的菌株在20個(gè)月后，活力下降了90%，其余7種模式，都很好的保持了菌株的活力，這說(shuō)明山梨醇不適合作為啤酒酵母的保護(hù)劑，甘油、DMSO、蔗糖都可以作為有效的保護(hù)劑。為了驗(yàn)證不同模式對(duì)菌種DNA的可能影響，Gujjari觀察了一個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷株在保藏過(guò)程中回復(fù)突變的比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)-80℃保藏40個(gè)月和55個(gè)月后，其回復(fù)突變率顯著增高，而且突變率與活性的降低呈正相關(guān)性變化。液氮保藏則回復(fù)突變沒(méi)有隨時(shí)間有明顯的變化，液氮保藏優(yōu)于-80℃保藏。不過(guò)，冷凍法不適用于某些不耐低溫的菌株，如蛙糞霉屬以及毛癬菌屬的部分真菌 (如Trichophyton concentricum、Trichophyton schoenleinii等)［7，16］不適合低溫保藏。

冷凍保藏法，特別是液氮超低溫保藏，存活率高，突變率低，保藏時(shí)間長(zhǎng)，是世界培養(yǎng)物保藏協(xié)會(huì)(WFCCs)推薦的方法之一，但是其缺點(diǎn)是培養(yǎng)物運(yùn)輸較困難，需要低溫冰箱，液氮罐等特殊設(shè)備。

3.6 冷凍干燥保藏法

冷凍干燥保存法是使微生物在冷凍狀態(tài)下，然后在真空減壓的情況下利用升華現(xiàn)象除去水份，是微生物在非劇烈，避免細(xì)胞直接損傷的情況下處于干燥、缺氧狀態(tài)，使細(xì)胞的新陳代謝減慢，從而達(dá)到長(zhǎng)期保藏的目的［17］。具體方法為將培養(yǎng)至穩(wěn)定期的真菌與保護(hù)劑 (例如脫脂牛奶)混勻后，取適量加入安瓿管中，在-40℃冰箱預(yù)凍2 h，置于冷凍干燥機(jī)上冷凍干燥8～20 h，熔封，測(cè)定真空度，合格后室溫或4℃保藏。在冷凍干燥的過(guò)程中為了盡量減少細(xì)胞損傷，加入保護(hù)劑十分必要，保護(hù)劑可分為小分子保護(hù)劑(如低聚糖類、醇類、緩沖鹽類、氨基酸和維生素類)和大分子保護(hù)劑 (如蛋白質(zhì)、多肽類和多糖類)。作為小分子保護(hù)劑，一般具有很強(qiáng)的親水性，分子結(jié)構(gòu)含有3個(gè)以上氫鍵，在冷凍或干燥過(guò)程中，可與菌體細(xì)胞膜磷脂中的磷酸基團(tuán)或菌體蛋白質(zhì)極性基團(tuán)形成氫鍵，保護(hù)細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的完整性。而大分子保護(hù)劑通過(guò)“包裹”形式保護(hù)菌體，同時(shí)，促進(jìn)低分子保護(hù)劑發(fā)揮作用［18］。保護(hù)劑類型的選擇主要取決于菌株。目前用的比較多的保護(hù)劑包括血清、脫脂牛奶、糖類、甘油、二甲亞砜、谷氨酸鈉等。冷凍干燥保藏技術(shù)適用于一些產(chǎn)孢子的真菌，特別是一些能夠產(chǎn)生子囊孢子和分生孢子的真菌，保藏周期可達(dá)到 20 ～ 40 a［19］。Bond［20］介紹了英國(guó)國(guó)家酵母菌保藏中心(NCYC)的保藏方法，并認(rèn)為真空冷凍干燥保藏法適用于絕大對(duì)數(shù)酵母。Tan等［21］介紹了荷蘭菌種保藏中心 (CBS)的保藏方法，冷凍干燥保藏法已用于50 000株菌株的保藏。張俊達(dá)等［22］觀察了常見(jiàn)醫(yī)學(xué)真菌真空冷凍干燥保藏后存活情況。結(jié)果顯示，皮膚癬菌的存活率達(dá)91.6%，酵母樣菌總存活率為83.5%，深部真菌總存活率為83.4%，腐生真菌總存活率為75%。但是冷凍干燥保藏法對(duì)真菌形態(tài)學(xué)，生理學(xué)以及基因水平的影響有待進(jìn)一步研究。Cavalcante等［23］用形態(tài)學(xué)，生物化學(xué)和隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA(RAPD)標(biāo)記的方法對(duì)8株冷凍干燥保藏的隱球菌進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)其形態(tài)，莢膜大小以及RAPD條帶均有變化。

冷凍干燥保藏法法是醫(yī)學(xué)真菌菌種長(zhǎng)期保藏的最為有效的方法之一，大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10 a之久而不喪失活力，而且經(jīng)凍干后的菌株無(wú)需進(jìn)行冷凍保藏，便于運(yùn)輸，但操作過(guò)程復(fù)雜，需要冷凍干燥機(jī)等設(shè)備條件。

4 總 結(jié)

根據(jù)世界培養(yǎng)物保藏協(xié)會(huì) (WFCCs)的指南，不同的微生物要根據(jù)其自身特點(diǎn)選擇適宜的保藏方法以保持其最佳活性和純度。為了最大限度的減少菌種丟失的可能性，每個(gè)菌株至少用兩種方法保藏，其中至少有一種保藏方法為冷凍干燥保藏或者保藏到液氮中或-140℃的超低溫保藏 (http://www.wfcc.info/guidelines/)。與菌株保藏相關(guān)的工作也十分重要。每一個(gè)要分配一個(gè)唯一的編碼，用形態(tài)學(xué)的方法或者ITS測(cè)序鑒定到種，盡量包含更多的信息，包括生長(zhǎng)曲線、顯微照片、代謝資料、基因指紋圖譜等。保藏之前必須要檢測(cè)其純度，菌株的活力應(yīng)該在保藏前、保藏中和復(fù)活后進(jìn)行被檢測(cè)并記錄。為了確保沒(méi)有生理學(xué)或基因水平的改變，可以對(duì)生長(zhǎng)速率、形態(tài)學(xué)也可以進(jìn)行代謝和基因水平的評(píng)估［17］。

雖然目前超低溫保藏法和冷凍干燥保藏法是長(zhǎng)期保存微生物菌種的最安全、可靠的方法，但是不同種屬的菌種又有其特異性。Crespo等［24］觀察了-80℃保藏、冷凍干燥法、蒸餾水保藏法、傳代法對(duì)馬拉色菌保藏的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有-80℃保藏能成功的復(fù)活所有的菌株。Deshmukh［25］對(duì)239菌皮膚癬菌通過(guò)斜面?zhèn)鞔?、蒸餾水懸浮法、礦物油法、二氧化硅干燥法、土壤保藏法以及冷凍干燥保藏法進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果說(shuō)明一些簡(jiǎn)單的方法如蒸餾水懸浮法，斜面接種法等復(fù)活率也達(dá)到了令人滿意的效果。各個(gè)單位和實(shí)驗(yàn)室保藏條件也不盡相同，要根據(jù)自己的實(shí)際選擇最科學(xué)，經(jīng)濟(jì)和有效的保藏方法。

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