MECP2基因大片段缺失致Rett綜合征表型分析

唐利芳 肖冰 徐燕 季星 蔣雯婷 劉曉青 陶炯

MECP2基因大片段缺失致Rett綜合征表型分析

唐利芳*肖冰*徐燕*季星*蔣雯婷*劉曉青*陶炯△

目的研究Rett綜合征（Rett syndrome,RTT）致病基因甲基化CpG結(jié)合蛋白2（Methyl-CpG-binding protein 2,MECP2）大片段缺失突變的3例患兒表型特征。方法對(duì)于編碼區(qū)未檢出致病突變而臨床表現(xiàn)疑為RTT的7例患兒采用定量PCR技術(shù)檢測(cè)MECP2基因有無(wú)缺失突變，隨后依據(jù)現(xiàn)行修訂診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行隨訪，明確患兒患病類型。結(jié)果 1例因不滿足診斷標(biāo)準(zhǔn)被排除。3例檢出大片段缺失突變，其中2例典型RTT，1例非典型RTT；余3例未檢出片段缺失。結(jié)論MECP2大片段缺失突變?yōu)镽TT常見(jiàn)致病原因且定量PCR對(duì)于常規(guī)突變篩查方法未檢出MECP2突變的患兒是一種簡(jiǎn)單快速的診斷方法。

Rett綜合征 定量PCR大片段缺失

Rett綜合征（Rett syndrome,RTT）是一種主要累及女性的X連鎖神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育疾病，發(fā)病率為1/10 000-1/15000[1]，臨床表現(xiàn)為出生后6～18個(gè)月出現(xiàn)精神發(fā)育停滯或倒退、喪失已獲得的技能，如語(yǔ)言、手的功用等，出現(xiàn)手的刻板動(dòng)作，可伴有智力低下、孤獨(dú)癥樣行為、癲癇、共濟(jì)失調(diào)等。95%～97%的典型RTT及50%～70%的非典型RTT可檢出甲基化CpG結(jié)合蛋白2（methyl-CpG-bingding protein 2,MECP2）基因的致病突變[2-3]。Scala等[4]對(duì)77例測(cè)序突變陰性的患兒檢測(cè)到16例大片段缺失突變，其中15例出現(xiàn)在典型RTT患兒中，提示缺失突變是典型RTT的一種常見(jiàn)突變類型。因常規(guī)測(cè)序方法易造成大片段缺失突變患兒漏檢，本試驗(yàn)運(yùn)用定量PCR技術(shù)對(duì)疑似RTT的7例患兒行缺失突變篩查并檢驗(yàn)該方法在臨床診斷中的可行性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象2011～2012年于新華醫(yī)院遺傳咨詢門診就診，臨床表現(xiàn)懷疑為RTT的7例女性患兒，其年齡2歲～8歲（中位年齡5歲）。經(jīng)染色體核型分析及MECP2基因常規(guī)測(cè)序檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)異常，依據(jù)2010年最新修訂診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]隨訪患兒以進(jìn)一步確認(rèn)是否患有該疾病及患病類型。

1.2 熒光定量PCR 應(yīng)用SYBR熒光定量PCR檢測(cè)MECP2拷貝數(shù)。引物由上海生工合成，5’-3’序列為：Exon2：上游ACAGACTCACCAGTTCCTGCTT，下游 GCCCTAACATCCCAGCTACCAT;Intron2-1：上游ATATCCCTGTTGTTGAGCGACT，下游CCCTGTTGACCTCTCTGATGG;Intron2-2：上游 CAACTCCAACTCCTGCTCCT，下游 AGTGGCAAGAGAGGTGATCC;Exon3：上游 TCAGAAGACCAGGACCTCCAG，下游 CTTCCGTGTCCAGCCTTCAG;Exon4：上游CCAAGGAGCCAGCTAAGACT，下游 TTGTCAGAGCCCTACCCATAAG;3’UTR：上游 GGAGTCCACTGGGGTGGCCTGACT，下游 CTCCTGGAGGGGACCCCTTGGACT;IRAK1：上游 ATCCTCAGCCTCCACCTTCCT，下 游 CCTCCTTGTCTCGAATCTTCCCT;HAS：上 游 AGCTATCCGTGGTCCTGAAC，下游 TTCTCAGAAAGTGTGCATATATCTG。分別以15例正常女性等量DNA混合樣本及13例正常男性等量DNA混合樣本為參照樣本，人血清白蛋白基因（Serum albumin,HSA）為內(nèi)參基因，通過(guò)引物濃度調(diào)節(jié)，使內(nèi)參和MECP2基因的擴(kuò)增效率保持基本一致。參照SYBR?Premix Ex TaqTM(TaKaRa Biotechnology，大連)配制反應(yīng)體系，置Applied Biosystems 7500熒光定量?jī)x，所有樣本均設(shè)3復(fù)管檢測(cè)，復(fù)管間標(biāo)準(zhǔn)差大于0.2時(shí)重新檢測(cè)。

表1 7例患兒RQ值

1.3 數(shù)據(jù)處理 SDS software version 1.4(Applied Biosystems,美國(guó))分析數(shù)據(jù)，采用 2-ΔΔCT方法計(jì)算MECP2相對(duì)基因拷貝數(shù)(relative quantity,RQ)。

2 結(jié)果

2.1 定量PCR結(jié)果 溶解曲線分析無(wú)非特異性擴(kuò)增，RQ結(jié)果，見(jiàn)表1。

2.2 診斷結(jié)果 3例患兒臨床表型見(jiàn)表2。病例1和3因滿足4個(gè)主要標(biāo)準(zhǔn)診斷為典型RTT,病例2滿足3條主要標(biāo)準(zhǔn)，7條診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷為非典型RTT，病例4、5為非典型RTT,病例6為典型RTT,病例7經(jīng)反復(fù)核實(shí)不滿足RTT特有的病程規(guī)律被排除。

2.3 病例資料 病例1：女，5歲，患兒系足月剖宮產(chǎn)，出生時(shí)無(wú)窒息缺氧史，頭圍34cm，3個(gè)月會(huì)抬頭，6個(gè)月獨(dú)坐，14個(gè)月扶走，邁步時(shí)寬步態(tài)，協(xié)調(diào)性差，2歲時(shí)不再走動(dòng)。1歲時(shí)無(wú)明顯誘因出現(xiàn)雙手抓握樣刻板動(dòng)作且逐漸加重。13個(gè)月時(shí)會(huì)講簡(jiǎn)單的詞語(yǔ)，15個(gè)月時(shí)失語(yǔ)，且聽(tīng)不懂簡(jiǎn)單指令，大小便不示意，表情淡漠，偶有眼神對(duì)視。18月時(shí)出現(xiàn)發(fā)作性屏氣，2歲時(shí)有陣發(fā)性哈氣樣呼吸。4歲時(shí)出現(xiàn)抽搐，服用抗癲癇藥（具體不詳）后控制良好?，F(xiàn)患兒仍無(wú)法行走，不會(huì)說(shuō)話，清醒時(shí)有磨牙，不時(shí)有自顧自發(fā)笑，睡眠時(shí)大笑，疼痛反應(yīng)消失，肌張力稍低下，下肢少許色素沉著，萎縮，肌電圖示神經(jīng)傳導(dǎo)速度輕度異常。頭顱MRI示雙側(cè)側(cè)腦室增大，透明隔間腔形成。腦電圖有尖波，尖慢波陣發(fā)。據(jù)此患兒表現(xiàn)診斷為典型RTT。病例2：女，5歲9個(gè)月，足月剖宮產(chǎn)，否認(rèn)孕期及分娩期異常，否認(rèn)神經(jīng)系統(tǒng)疾病家族史，出生時(shí)頭圍34 cm，3個(gè)月抬頭，7個(gè)月會(huì)坐，1歲時(shí)走路稍不穩(wěn)，但無(wú)姿勢(shì)異常，協(xié)調(diào)能力尚可，會(huì)叫“爸爸媽媽”，會(huì)簡(jiǎn)單表達(dá)一些詞句，能夠主動(dòng)抓取玩具，18月時(shí)出現(xiàn)無(wú)目的的絞手樣刻板動(dòng)作，不會(huì)抓握湯匙，行走能力喪失，只喜爬，主動(dòng)言語(yǔ)漸減少至消失，且與父母無(wú)眼神交流，脾氣不易控制，焦慮時(shí)常換氣過(guò)度，頭顱CT檢查未發(fā)現(xiàn)異常，現(xiàn)患兒已不會(huì)講話，不會(huì)走路，睡眠時(shí)易驚醒，尖叫，對(duì)疼痛反應(yīng)不敏感，脊柱有輕微側(cè)凸，肌張力稍低下，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)診斷為非典型RTT。病例3：女，3歲，患兒足月順產(chǎn)，無(wú)窒息缺氧史，粗大運(yùn)動(dòng)，精細(xì)運(yùn)動(dòng)及語(yǔ)言發(fā)育在1.5歲前與同齡兒相比無(wú)明顯異常，但其后出現(xiàn)快速倒退現(xiàn)象，走路不穩(wěn)，左右搖擺，平衡感差，協(xié)調(diào)能力不如前，下肢肌張力低下，久站不能，現(xiàn)患兒完全喪失行走能力，但仍會(huì)叫“爸爸媽媽”，會(huì)表達(dá)一些簡(jiǎn)單無(wú)意義的詞語(yǔ)，喜歡含手指，清醒時(shí)有嘆氣式呼吸，磨牙，流涎現(xiàn)象，手腳冰涼，睡眠時(shí)伴姿勢(shì)異常，對(duì)玩具沒(méi)有興趣，疼痛反應(yīng)不敏感，但無(wú)脊柱側(cè)凸及抽搐。據(jù)臨床表現(xiàn)診斷為典型RTT。

表2 3例患兒臨床表型

3 討論

國(guó)際RTT臨床協(xié)會(huì)發(fā)布2010年RTT修訂診斷標(biāo)準(zhǔn)，在對(duì)2002年診斷標(biāo)準(zhǔn)做了必要的修改與簡(jiǎn)化后更易臨床醫(yī)生診斷，Percy等[6]大規(guī)模分析819例患者的病史驗(yàn)證了修訂標(biāo)準(zhǔn)的正確性。其中強(qiáng)調(diào)了明顯倒退史的重要性，不詳時(shí)應(yīng)慎重考慮或定期隨訪評(píng)估。如病例7據(jù)家長(zhǎng)所述：10個(gè)月時(shí)不會(huì)坐，不會(huì)爬樓梯，14個(gè)月時(shí)仍不會(huì)走，不會(huì)說(shuō)話，2歲9個(gè)月時(shí)患兒表現(xiàn)有好轉(zhuǎn)，可行走，會(huì)叫“爸爸媽媽”，而在持續(xù)3個(gè)月后言語(yǔ)能力再次喪失且伴有走路不穩(wěn)，否認(rèn)腦部疾病史及其他疾病家族史。因該患兒有一短暫而明顯的癥狀改善期，與RTT強(qiáng)調(diào)的病情進(jìn)展分期不同，雖滿足2條主要標(biāo)準(zhǔn)和5條支持標(biāo)準(zhǔn)，仍需排除。MECP2為RTT主要致病基因，但仍有符合RTT診斷標(biāo)準(zhǔn)的3%～5%的患者未檢測(cè)到該基因突變，如本實(shí)驗(yàn)中的3例患兒，其可能與另一致病基因細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶樣5(cyclin-dependent kinase-like 5，CDKL5)突變有關(guān)[7]。而無(wú)RTT臨床表現(xiàn)的患者可檢測(cè)到MECP2突變，如孤獨(dú)癥，Angleman綜合征，智力低下等，表明RTT診斷仍依據(jù)臨床表現(xiàn)，MECP2基因檢測(cè)結(jié)果輔助臨床診斷。

目前檢測(cè)MECP2缺失突變的定量方法有定量PCR，MLPA，變性高效液相色譜(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)，Southern blot。DHPLC需行多重PCR，因引物濃度較敏感而易影響結(jié)果現(xiàn)已很少使用，Southern blot因操作步驟繁瑣，花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，所需DNA量大，低通量等限制了在臨床的推廣應(yīng)用，現(xiàn)廣泛應(yīng)用的成熟技術(shù)有定量PCR和MLPA,前者因經(jīng)濟(jì)成本低，檢測(cè)時(shí)間短，結(jié)果可靠，在檢測(cè)MECP2相對(duì)簡(jiǎn)單的基因結(jié)構(gòu)和高頻的缺失突變熱點(diǎn)時(shí)該方法具有一定的優(yōu)勢(shì)。Ariani等[8]運(yùn)用熒光標(biāo)記的TaqMan探針行多重PCR反應(yīng)詳細(xì)論述了該方法的敏感性與準(zhǔn)確性并檢測(cè)出1例缺失與1例重復(fù)，提議其可作為補(bǔ)充DHPLC的一種簡(jiǎn)單可靠的常規(guī)篩查方法，Laccone等[9]采用SYBRGreen定量PCR在170例患兒中（140例疑似RTT和30例典型RTT）檢出15例大片段缺失突變，本實(shí)驗(yàn)使用同樣的方法在6例患兒中檢測(cè)到3例缺失突變，占我科室確診為RTT患者12%(3/25)的比例，其與大規(guī)模統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)測(cè)得的總?cè)笔z測(cè)率11.9%相符，表明定量PCR因在一定程度上降低了缺失突變的漏檢率而應(yīng)用于臨床檢測(cè)的必要性。

Archer等[10]采用定量PCR及MLPA技術(shù)在110例MECP2突變篩查陰性的患兒檢測(cè)到37.8%的典型RTT和7.5%的非典型RTT有單個(gè)，多個(gè)或全部外顯子缺失，其中大于80%的缺失包含外顯子3和/或4，4例包含IRAK1基因。 Zhang等[11]在對(duì)我國(guó)365例RTT患者中檢測(cè)出6.7%的大片段缺失，其中95.2%為外顯子3和/或4缺失，外顯子1缺失1例，19例包含外顯子4的缺失傾向區(qū)（deletion prone region,DPR），本實(shí)驗(yàn)3例均有外顯子3，4缺失，且均包含DPR，1例攜有IRAK1基因片段缺失，表明MECP2基因內(nèi)存在斷裂熱點(diǎn)。Laccone等[9]認(rèn)為外顯子4的DPR與內(nèi)含子2中高達(dá)27.8%的Alu重復(fù)序列與穩(wěn)定性相關(guān)，Todorov等[12]認(rèn)為此區(qū)域內(nèi)的回文結(jié)構(gòu)為易突變結(jié)構(gòu)域可引起重復(fù)突變和復(fù)雜重排，但具體作用機(jī)制仍不清楚。

MECP2蛋白作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子可促進(jìn)神經(jīng)元成熟和突觸形成，研究發(fā)現(xiàn)截?cái)嗟鞍自隗w內(nèi)降解速度可能較快致功能喪失而影響患者表型[13]。在基因型與表型關(guān)系的研究中，因評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)不同，樣本量差異，年齡因素等影響，結(jié)果有時(shí)不完全一致，有學(xué)者認(rèn)為大片段缺失突變較錯(cuò)義突變，C-末端截短突變總體嚴(yán)重程度較高[14-16]。在缺失范圍這一影響因素中，Scala等[4]認(rèn)為外顯子1和2缺失與3或/和4缺失，有無(wú)IRAK1缺失嚴(yán)重程度評(píng)分均無(wú)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而Hardwick[17]等認(rèn)為包含有IRAK1缺失的6例患兒嚴(yán)重程度明顯高于無(wú)缺失的6例患兒。本實(shí)驗(yàn)病例2缺失范圍最廣，且累及IRAK1，但患兒臨床表現(xiàn)相對(duì)較輕，這可能與下游靶基因腦源性神經(jīng)因子基因(brain derived neurotrophic factor,BDNF)的多態(tài)性相關(guān)[18]。本實(shí)驗(yàn)因研究樣本過(guò)少，無(wú)法統(tǒng)計(jì)分析，因而不能明確基因型與表型間的關(guān)系。綜上所述，MECP2大片段缺失為RTT的一種常見(jiàn)致病突變，運(yùn)用定量PCR這一簡(jiǎn)單，快速的基因診斷方法在一定程度上提高了此突變類型的檢出率從而為臨床確診RTT提供了基因水平的診斷依據(jù)。

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R749.9

A

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.04.010

*上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院上海兒科醫(yī)學(xué)研究所遺傳室（上海 200092）

△ 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬中國(guó)福利會(huì)國(guó)際和平婦幼保健院產(chǎn)前診斷室

（E-mail:taojiong＠hotmail.com）

2013-04-14）

（責(zé)任編輯:李立）

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