邱恩超 于生元 李鳳鵬 劉若卓 董釗 姜磊 石宏 景向紅
鹽酸氟桂利嗪對(duì)大鼠皮層擴(kuò)布性抑制模型血漿CGRP及SP濃度的影響☆
邱恩超*于生元△李鳳鵬※劉若卓△董釗△姜磊△石宏◎景向紅◎
目的 建立偏頭痛大鼠皮層擴(kuò)布性抑制(cortical spreading depression,CSD)模型,研究鹽酸氟桂利嗪干預(yù)后對(duì)CSD及血漿降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin-gene related peptide,CGRP)、P物質(zhì)(substance P,SP)濃度的影響。方法大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、CSD組、氟桂利嗪干預(yù)組,利用氯化鉀溶液刺激法建立CSD模型,采用放射免疫技術(shù)測(cè)定大鼠血漿中的CGRP、SP濃度。結(jié)果對(duì)照組未記錄到CSD波;氟桂利嗪干預(yù)組與CSD組比較,CSD波的潛伏期延長(zhǎng)[氟桂利嗪干預(yù)組(167.90±25.18s)vs.CSD組(130.90±13.30s)](P<0.01),個(gè)數(shù)減少[氟桂利嗪干預(yù)組(4.50±1.84)vs.CSD組(8.50±2.07)](P<0.01),波幅降低[氟桂利嗪干預(yù)組(11.40±4.12mv)vs.CSD組(24.40±3.57 mv)](P<0.01);關(guān)于血漿CGRP濃度和SP濃度,CSD組(CGRP,32.95±11.61 pg/mL;SP,27.80±7.51 pg/mL)及氟桂利嗪干預(yù)組(CGRP,25.13±5.67 pg/mL;SP,19.45±6.10 pg/mL)均高于對(duì)照組(CGRP,14.44±6.39 pg/mL;SP,12.36± 4.22 pg/mL)(P<0.01),氟桂利嗪干預(yù)組(CGRP,25.13±5.67 pg/mL;SP,19.45±6.10 pg/mL)低于CSD組(CGRP,32.95± 11.61 pg/mL;SP,27.80±7.51 pg/mL)(P<0.05)。結(jié)論鹽酸氟桂利嗪能夠抑制CSD的發(fā)生,使大鼠CSD模型的血漿CGRP、SP濃度降低。
偏頭痛 皮層擴(kuò)布性抑制 降鈣素基因相關(guān)肽 P物質(zhì) 鹽酸氟桂利嗪
近來(lái),皮層擴(kuò)布性抑制學(xué)說(shuō)(cortical spreading depression,CSD)及神經(jīng)源性炎癥學(xué)說(shuō)成為偏頭痛發(fā)生機(jī)制研究的熱點(diǎn)[1]。多項(xiàng)研究說(shuō)明CSD可能是偏頭痛,至少是有先兆偏頭痛的病理生理基礎(chǔ)[2-3]。許多研究表明降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin-gene related peptide,CGRP)、P物質(zhì)(substance P,SP)作為三叉神經(jīng)血管反射系統(tǒng)的標(biāo)志性神經(jīng)肽,參與了神經(jīng)源性炎癥的發(fā)生,進(jìn)而導(dǎo)致偏頭痛發(fā)生[4-5]。然而CSD與神經(jīng)源性炎癥之間關(guān)系尚不明確,相關(guān)研究較少。臨床試驗(yàn)顯示鹽酸氟桂利嗪能夠有效預(yù)防偏頭痛發(fā)作[6-7],李鳳鵬等[8]發(fā)現(xiàn)鹽酸氟桂利嗪能夠有效抑制CSD,但是,其機(jī)制尚不完全清楚。因此,本研究建立大鼠偏頭痛CSD模型,給予鹽酸氟桂利嗪干預(yù),通過(guò)放射免疫技術(shù)對(duì)血漿CGRP和SP進(jìn)行檢測(cè),了解CSD對(duì)血漿CGRP和SP的影響及鹽酸氟桂利嗪抑制CSD后對(duì)血漿CGRP、SP的影響,進(jìn)而了解CSD與神經(jīng)源性炎癥之間的關(guān)系及鹽酸氟桂利嗪抑制CSD后可能通過(guò)何種機(jī)制來(lái)有效預(yù)防偏頭痛的發(fā)生。
1.1 研究對(duì)象健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠30只,體重200~300 g,由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供,隨機(jī)分為對(duì)照組、CSD組、氟桂利嗪干預(yù)組各10只。試劑:2%滂胺天藍(lán)醋酸鈉溶液、3mol/L氯化鉀溶液(北京化學(xué)試劑公司);1mg/mL鹽酸氟桂利嗪生理鹽水懸濁液(西安楊森制藥有限公司);7.5%EDTA、抑肽酶、CGRP放免試劑盒、SP放免試劑盒(解放軍總醫(yī)院東亞放免研究所)。設(shè)備:腦立體定位儀、微電極放大器(日本光電工業(yè)株式會(huì)社);PowerLab計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(澳大利亞愛(ài)德公司);放免檢測(cè)儀器(上海核所日環(huán)光電儀器有限公司)。
1.2 大鼠CSD模型制備大鼠經(jīng)20%烏拉坦(1.2~1.5 g/kg)腹腔注射麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)上,暴露顱骨,于顱骨前囟前3mm、右側(cè)旁開(kāi)2mm處(A)及前囟后6mm,右側(cè)旁開(kāi)5mm處(B),進(jìn)行鉆孔(不損傷硬腦膜),分別為記錄CSD和給予氯化鉀溶液(或生理鹽水)刺激的位置[8]。氟桂利嗪干預(yù)組在氯化鉀溶液刺激前5min尾靜脈注射氟桂利嗪生理鹽水混懸液(1mg/Kg)[9]。將大鼠移至立體定位儀并固定,玻璃微電極(尖端直徑1μm)沖灌2%滂胺天藍(lán)醋酸鈉溶液,插入A孔皮層表面下1mm。開(kāi)啟CSD記錄系統(tǒng),穩(wěn)定后將浸有3 mol/L氯化鉀溶液或生理鹽水(<5μL/次)、直徑為2mm的濾紙片置于B孔,每10min更換1次,共6次,記錄CSD波[8]。
1.3 CSD的分析利用Chart軟件(www.ADInstruments.com)測(cè)定CSD波潛伏期、個(gè)數(shù)及波幅。
1.4 標(biāo)本的采集及血漿CGRP、SP濃度測(cè)定于大鼠右側(cè)頸外靜脈抽取2.5mL血放入離心管中,迅速加入EDTA 37.5μL,抑肽酶50μL,混勻后放置4℃離心機(jī)離心(3000轉(zhuǎn)/min,15 min),按CGRP、SP放免試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法CSD波潛伏期、個(gè)數(shù)及波幅用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t檢驗(yàn);血漿CGRP(pg/mL)、SP的濃度(pg/mL)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x± s)表示,采用方差分析。SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。檢驗(yàn)水準(zhǔn)ɑ=0.05。
2.1 電生理結(jié)果對(duì)照組未記錄到CSD波(圖1-A)。對(duì)于CSD組,每次氯化鉀溶液刺激枕葉皮層后3min左右可以引出0~3個(gè)CSD波,CSD波形主要為負(fù)向波,波幅10~30mv,持續(xù)1min左右(圖1-B)。氟桂利嗪干預(yù)組CSD波形與CSD組相似(圖1-C)。氟桂利嗪干預(yù)組與CSD組比較,第一個(gè)CSD波潛伏期延長(zhǎng),CSD波個(gè)數(shù)減少,CSD波的波幅降低(P<0.01,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)表1)。
2.2 血漿CGRP濃度(pg/m L)比較對(duì)照組、CSD組、氟桂利嗪干預(yù)組的血漿CGRP平均濃度分別為14.44±6.39(pg/mL)、32.95±11.61(pg/mL)、25.13±5.67(pg/mL),3組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),兩兩比較結(jié)果皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05;P<0.01)(見(jiàn)圖2)。
2.3 血漿SP濃度(pg/m L)比較對(duì)照組、CSD組、氟桂利嗪干預(yù)組的血漿SP平均濃度分別為12.36±4.22(pg/mL)、27.80±7.51(pg/mL)、19.45± 6.10(pg/mL),3組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),兩兩比較結(jié)果皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05,P<0.01)(見(jiàn)圖3)。
表1 CSD組和氟桂利嗪干預(yù)組CSD波潛伏期、個(gè)數(shù)及波幅比較
圖1 各組大鼠的電生理圖A,對(duì)照組;B,CSD組;C,氟桂利嗪干預(yù)組(注:CSD,皮層擴(kuò)布性抑制)
圖2 各組血漿CGRP濃度比較(P<0.01;*氟桂利嗪干預(yù)組與CSD組比較P<0.05;**CSD組與對(duì)照組比較,氟桂利嗪干預(yù)組與對(duì)照組比較P<0.01)(注:CGRP,降鈣素基因相關(guān)肽;CSD,皮層擴(kuò)布性抑制)
圖3 各組血漿SP濃度比較(P<0.01;*氟桂利嗪干預(yù)組與CSD組比較P<0.05;**CSD組與對(duì)照組比較,氟桂利嗪干預(yù)組與對(duì)照組比較P<0.01)(注:SP,P物質(zhì);CSD,皮層擴(kuò)布性抑制)
偏頭痛是一種常見(jiàn)的原發(fā)性頭痛,中國(guó)偏頭痛患病率9.3%,38%的患者因中到重度頭痛需要治療[10],64.2%的患者因發(fā)作頻率≥1次/月需要預(yù)防性治療[11],羅國(guó)剛等研究發(fā)現(xiàn)頭痛程度重是偏頭痛并發(fā)焦慮/抑郁的主要危險(xiǎn)因素之一,疼痛程度較重、發(fā)作頻率較高、伴發(fā)焦慮/抑郁對(duì)患者造成很大的致殘性[12]。因此,偏頭痛發(fā)生機(jī)制的研究備受?chē)?guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。CSD學(xué)說(shuō)近來(lái)成為研究的熱點(diǎn),即大腦皮層受刺激后出現(xiàn)由刺激部位向周?chē)M織波浪式擴(kuò)布的皮層電活動(dòng)的抑制,興奮與抑制的擴(kuò)布過(guò)程可以解釋偏頭痛先兆先是刺激性繼之抑制性神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的特征及其擴(kuò)散的性質(zhì),說(shuō)明CSD可能是偏頭痛,至少是有先兆偏頭痛的病理生理基礎(chǔ)[2]。偏頭痛患者視覺(jué)先兆及貓CSD模型的功能磁共振成像(fMRI)研究均提示枕葉皮層fMRI信號(hào)強(qiáng)度起初增加,繼之下降,并緩慢持續(xù)向前部皮層擴(kuò)布,速率與CSD波一致,說(shuō)明CSD與偏頭痛先兆的發(fā)生有關(guān)[3,13]。本研究采用濾紙片浸潤(rùn)氯化鉀溶液刺激枕葉皮層法,在額葉記錄到CSD波,與李鳳鵬等[8]利用微量注射器注射氯化鉀刺激大鼠枕葉皮層記錄到CSD波一致,而生理鹽水刺激組未記錄到CSD波,說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)成功建立了偏頭痛的大鼠CSD模型。
鹽酸氟桂利嗪多年來(lái)用于臨床中偏頭痛的預(yù)防性治療[6,7],且與普萘洛爾聯(lián)用能有效并安全治療藥物過(guò)量性頭痛[14]。李鳳鵬等[8]建立偏頭痛大鼠CSD模型,在氯化鉀刺激枕葉皮層前30min給予腹腔注射鹽酸氟桂利嗪,發(fā)現(xiàn)CSD波受到抑制。Shimazawa等[9]研究發(fā)現(xiàn)鹽酸氟桂利嗪能夠抑制CSD引起的血流量下降。本研究采用氯化鉀刺激大鼠枕葉皮層前5min尾靜脈給予注射鹽酸氟桂利嗪,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CSD波潛伏期延長(zhǎng),個(gè)數(shù)減少,波幅下降,說(shuō)明鹽酸氟桂利嗪預(yù)防偏頭痛發(fā)作的機(jī)制可能是抑制了CSD的發(fā)生。另外,CSD的發(fā)生是基于K+和H+從細(xì)胞中釋放出來(lái),而Na+、Ca2+和Cl-與水分子一起進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),引起細(xì)胞腫脹,細(xì)胞外間隙相對(duì)減小[15-16],而鹽酸氟桂利嗪是一種鈣離子阻滯劑,分析鹽酸氟桂利嗪可能通過(guò)作用于離子通道而抑制CSD的產(chǎn)生。
偏頭痛動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)三叉神經(jīng)節(jié)激活后釋放CGRP、SP等神經(jīng)肽,進(jìn)而介導(dǎo)腦膜內(nèi)的神經(jīng)源性炎癥,導(dǎo)致血管擴(kuò)張、血漿蛋白滲出、肥大細(xì)胞脫顆粒,且CGRP、SP的濃度與上述表現(xiàn)的程度一致[5],此為偏頭痛發(fā)生機(jī)制的神經(jīng)源性炎癥學(xué)說(shuō)。關(guān)于偏頭痛CSD與神經(jīng)源性炎癥之間關(guān)系的研究較少,二者關(guān)系尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)CSD組大鼠血漿CGRP、SP濃度較對(duì)照組增高,說(shuō)明CSD可能通過(guò)一定機(jī)制激活了三叉神經(jīng)血管反射系統(tǒng)導(dǎo)致三叉神經(jīng)節(jié)釋放CGRP、SP,參與并維持頭痛的發(fā)生;氟桂利嗪干預(yù)組大鼠的CSD發(fā)生受抑制后,相應(yīng)的血漿CGRP、SP濃度下降,說(shuō)明三叉神經(jīng)血管反射的激活減弱,反向推測(cè)進(jìn)一步說(shuō)明CSD可能通過(guò)激活三叉神經(jīng)血管反射來(lái)導(dǎo)致偏頭痛的發(fā)作。另外,鹽酸氟桂利嗪通過(guò)抑制CSD的發(fā)生降低了大鼠血漿CGRP、SP的濃度,也進(jìn)一步說(shuō)明鹽酸氟桂利嗪可能通過(guò)抑制CSD的發(fā)生來(lái)有效預(yù)防偏頭痛的發(fā)作。
[1] De Simone R,Ranieri A,Montella S,et al.Cortical spreading depression and central pain networks in trigeminal nucleimodulation:time for an integrated migraine pathogenesis perspective [J].Neurol Sci,2013,34(S1):S51-55.
[2] Le?o AAP,Morrison RS.Propagation of spreading cortical depression[J].JNeurophysiol,1945,8(1):33-45.
[3] Hadjikhani N,Sanchez del Rio M,Wu O,et al.Mechanisms of migraine aura revealed by fMRI in human visual cortex[J].Proc Natl Acad SciUSA,2001,98(8):4687-4692.
[4] 朱曉鳳,韓月臣,熊文萍,等.熱凝腦膜中動(dòng)脈對(duì)硝酸甘油致偏頭痛大鼠血CGRP和SP含量的影響[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2011,25(10):460-462,468.
[5] Theoharides TC,Donelan J,Kandere-Grzybowska K,et al.The role of mast cells in migraine pathophysiology[J].Brain Res Rev,2005,49(1):65-76.
[6] Reveiz-Herault L,Cardona AF,Ospina EG,et al.Effectiveness of flunarizine in the prophylaxis ofmigraine:a meta-analytical review of the literature[J].Rev Neurol,2003,36(10):907-912.
[7] 于生元,董釗,李焰生,等.鹽酸氟桂利嗪預(yù)防性治療偏頭痛療效性和安全性[J].中國(guó)疼痛醫(yī)學(xué)雜志,2007,13(4): 199-201.
[8] Li F,Qiu E,Dong Z,et al.Protection of flunarizine on cerebral mitochondria injury inducedby cortical spreading depression under hypoxic conditions[J].JHeadache Pain,2011,12(1):47-53.
[9] Shimazawa M,Hara H,Watano T,et al.Effects of Ca2+channelblockers on cortical hypoperfusion and expression of c-Fos-like immunoreactivity after cortical spreading depression in rats[J]. Br JPharmacol,1995,115(8):1359-1368.
[10] Yu S,Liu R,Zhao G,etal.The prevalence and burden of primary headaches in China:a population-based door-to-door survey [J].Headache,2012,52(4):582-591.
[11] Liu R,Yu S,He M,et al.Health-care utilization for primary headache disorders in China:a population-based door-to-door survey[J].JHeadache Pain,2013,14(1):47-54.
[12] 羅國(guó)剛,馬玉青,茍靜,等.偏頭痛患者伴發(fā)焦慮/抑郁及功能殘疾的臨床研究[J].中國(guó)神經(jīng)精神疾病雜志,2012,38 (8):477-481.
[13] James MF,Smith MI,Bockhorst KHJ,et al.Cortical spreading depression in the gyrencephalic feline brain studied bymagnetic resonance imaging[J].JPhysiol,1999,519(2):415-425.
[14] 趙紅如,張群英,蔡秀英,等.不同藥物聯(lián)合治療藥物過(guò)度使用性頭痛的療效及安全性[J].中國(guó)神經(jīng)精神疾病雜志,2012,38(4):229-233.
[15] Kraig RP,Nicholson C.Extracellular ionic variations during spreading depression[J].Neuroscience,1978,3(11):1045-1059.
[16] Dreier J.The role of spreading depression,spreading depolarization and spreading ischemia in neurological disease[J].Nat Med,2011,17(4):439-447.
The effects of flunarizine hydrochloride on plasma calcitonin gene-related peptide and substance Plevels after cortical spreading depression in rats.
QIU Enchao,YU Shengyuan,LI Fengpeng,LIU Ruozhuo,DONG Zhao,JIANG Lei,SHI Hong,JING Xianghong.
Department of Neurology,The First Affiliated Hospital,Chinese PLA General Hospital,51 Fucheng Road,Haidian District,Beijing 100048,China.Tel:010-66848043.
ObjectiveTo explore the effects of flunarizine hydrochloride on plasma calcitonin gene-related peptide and substance Plevels after CSD in a ratmigrainemodel of cortical spreading depression(CSD).MethodsThirty adult ratswere randomly and evenly divided into three groups:controlGroup,CSD group and flunarizine group.The CSD waveswere evoked by application of potassium chloride on brain surface with filter paper.Funarizine hydrochloride was intravenously administered to rats fiveminutes prior to application of potassium chloride.The plasma levels of CGRP and SP weremeasured by using radioimmunity assay.Statistical analyseswere performed using two-sample t test and analysis of variance.ResultsCSD waveswere absent in control group whereas CSD waveswere induced in CSD and flunarizine groups.The latency of the first CSD wave was longer in flunarizine group(167.90±25.18 s)than in CSD group(130.90±13.30 s)(P<0.01).The number of CSD waves was smaller in flunarizine group(4.50±1.84)than in CSD group (8.50±2.07)(P<0.01).The amplitude of CSD waves was lower in flunarizine group(11.40±4.12 mv)than in CSD group (24.40±3.57mv)(P<0.01).The levels of CGRP and SP in both CSD group(CGRP,32.95±11.61 pg/mL;SP,27.80±7.51 pg/mL)and flunarizine group(CGRP,25.13±5.67 pg/mL;SP,19.45±6.10 pg/mL)were higher than in control group (CGRP,14.44±6.39 pg/mL;SP,12.36±4.22 pg/mL)(P<0.01).The levels of CGRP and SP in flunarizine group(CGRP, 25.13±5.67 pg/m L;SP,19.45±6.10 pg/mL)were lower than those in CSD group(CGRP,32.95±11.61 pg/mL;SP,27.80± 7.51 pg/mL)(P<0.05).ConclusionsFlunarizine hydrochloride can inhibit CSD and reduce the plama levelsof CGRPand SP in the rat modelofCSD.
Migraine Cortical spreading depression Calcitonin gene-related peptide Substance P Flunarizine hydrochloride
R747.2
A
2013-10-06)
(責(zé)任編輯:李立)
10.3936/j.issn.1002-0152.2014.04.005
☆國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào):81171058)
*解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(北京 100048)
△解放軍總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科
※沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科
◎中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所