青藤堿對(duì)偏頭痛模型大鼠蛛網(wǎng)膜下腔炎性細(xì)胞的影響☆

羅國(guó)標(biāo) 劉曉麗 楊麗

青藤堿對(duì)偏頭痛模型大鼠蛛網(wǎng)膜下腔炎性細(xì)胞的影響☆

羅國(guó)標(biāo)*※劉曉麗△楊麗*

目的 觀察青藤堿(sinomenine，Sin)對(duì)偏頭痛模型大鼠蛛網(wǎng)膜下腔小血管周圍炎性細(xì)胞數(shù)的影響，探討Sin治療偏頭痛的抗炎作用。方法健康wistar大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、Sin低、中、高劑量干預(yù)組，每組10只。皮下注射硝酸甘油復(fù)制實(shí)驗(yàn)性偏頭痛動(dòng)物模型，藥物干預(yù)4 h后斷頭取腦干及其腦膜。HE染色,顯微鏡下觀察蛛網(wǎng)膜下腔小血管周圍炎性細(xì)胞數(shù)的變化，計(jì)數(shù)蛛網(wǎng)膜下腔小血管周圍單位面積(以視野為單位)炎性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果模型組大鼠蛛網(wǎng)膜下腔小血管周圍炎性細(xì)胞(以淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞為主)明顯增多，與空白組相比較，差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(28.10±2.28)vs.(1.60±1.07)，P＜0.01]；Sin高、中、低劑量組蛛網(wǎng)膜下腔小血管周圍炎性細(xì)胞明顯減少，與模型組相比較，差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[Sin高劑量組(2.60±1.43)、Sin中劑量組(5.10±1.37)、Sin低劑量組(9.10±0.88)vs.(28.10±2.28)，P＜0.01]。結(jié)論Sin可顯著減少硝酸甘油誘導(dǎo)的偏頭痛模型大鼠蛛網(wǎng)膜下腔小血管周圍炎性細(xì)胞數(shù)，抑制偏頭痛的無(wú)菌性神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)，提示Sin有治療偏頭痛的作用。

偏頭痛 青藤堿 蛛網(wǎng)膜下腔 炎性細(xì)胞

偏頭痛的病理生理機(jī)制尚未完全明了，目前有多種發(fā)病機(jī)制，其中神經(jīng)血管學(xué)說(shuō)認(rèn)為三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)激活后可誘發(fā)無(wú)菌性神經(jīng)源性炎癥(aseptic neurogenic inflammation，ANI)，而誘發(fā)偏頭痛[1]。研究發(fā)現(xiàn)偏頭痛患者腦脊液細(xì)胞因子的變化,為偏頭痛的神經(jīng)血管學(xué)說(shuō)提供了依據(jù)[2]。Sin是從中藥青風(fēng)藤Sinomenium acutum Rehd.etWils中提取的單體生物堿，具有明顯抗炎、抗免疫、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)咳等藥理作用，目前已廣泛用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。Sin能否抑制偏頭痛的ANI反應(yīng)，尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)皮下注射硝酸甘油(Nitroglycerin，NTG)復(fù)制實(shí)驗(yàn)性偏頭痛模型，予以Sin干預(yù)，觀察Sin對(duì)偏頭痛模型大鼠蛛網(wǎng)膜下腔小血管周圍炎性細(xì)胞數(shù)的影響，了解Sin是否可以減輕偏頭痛的ANI反應(yīng)，為Sin治療偏頭痛提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)wistar大鼠60只(由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(渝)2007-0005)，雌雄各半，體重(320±60)g，適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、偏頭痛模型組、Sin高、中、低劑量組，共6組，每組10只。

1.2 偏頭痛模型制作采用皮下注射硝酸甘油制作大鼠偏頭痛模型。健康wistar大鼠，皮下注射硝酸甘油(北京益民藥業(yè)有限公司，5mg/mL，批號(hào)：20100531)10 mg/kg，制作實(shí)驗(yàn)性偏頭痛模型。以注藥造模30min后大鼠出現(xiàn)雙耳發(fā)紅，前肢頻繁搔頭，擺頭，爬籠次數(shù)增多等煩躁不安的癥狀為模型復(fù)制成功的標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)注藥6～10min后大鼠均出現(xiàn)上述癥狀。若不給予藥物治療，上述現(xiàn)象持續(xù)約1～3 h不等?？瞻讓?duì)照組不任何處理。

1.3 給藥方法正清風(fēng)痛寧緩釋片(湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司，每片含鹽酸青藤堿60mg，批號(hào)：0903127)用生理鹽水配成藥液置于4℃冰箱備用,Sin治療組按Sin高、中、低劑量灌胃，藥量分別為200 mg/kg、150 mg/kg和100 mg/kg。上述藥物都用生理鹽水稀釋到同等的量灌胃，模型組給以等量生理鹽水灌胃。模型組、Sin治療組于注射硝酸甘油30min后按組灌胃給藥。

1.4 取材及標(biāo)本處理造模灌胃4 h后將大鼠用10%水合氯醛(0.35mL/100 g)腹腔注射法進(jìn)行全身麻醉后，仰臥固定，開(kāi)胸從左心室至主動(dòng)脈插管，剪開(kāi)右心耳，首先迅速灌注無(wú)菌生理鹽水200mL，然后灌注4℃4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液200mL，灌注后斷頭，取出整個(gè)完整腦組織，4℃4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液浸泡后，去除硬腦膜保留蛛網(wǎng)膜及軟腦膜，并分離腦干，在4%PFA磷酸鹽緩沖液中固定24 h，然后放入20%蔗糖-PBS液中，至組織塊下沉。標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，制成4μm切片，常規(guī)HE染色。

1.5 圖像分析奧林巴斯顯微鏡下:觀察每張切片蛛網(wǎng)膜下腔小血管周圍炎性細(xì)胞的變化，計(jì)數(shù)蛛網(wǎng)膜下腔小血管周圍40倍視野單位面積(以視野為單位)炎性細(xì)胞總數(shù)。全部標(biāo)本的HE染色切片均由兩名有經(jīng)驗(yàn)的病理科老師觀察復(fù)核。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法檢測(cè)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩樣本均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)，組間比較如滿足方差齊性用one-wayANOVA分析的LSD法,不滿足方差齊性用DunnettT3法分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)ɑ=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)觀察除空白對(duì)照組外，其余動(dòng)物造模后6～10min左右，均出現(xiàn)雙耳發(fā)紅，前肢頻繁搔頭、擺頭，爬籠次數(shù)增多，煩躁不安現(xiàn)象。治療組大鼠在給藥后，上述現(xiàn)象逐漸消失，趨于正常。模型組動(dòng)物上述現(xiàn)象持續(xù)約1～3 h，繼而出現(xiàn)蜷臥，活動(dòng)減少狀態(tài)。判定標(biāo)準(zhǔn)：模型制作后通過(guò)耳紅、撓頭、爬籠、煩躁不安等行為癥狀評(píng)價(jià)判定模型制作是否成功。成功的標(biāo)準(zhǔn)為模型動(dòng)物精神不振，眼睛瞇成線狀，體溫明顯下降，蜷縮少動(dòng)，肛門(mén)處有糞便堆積，體重逐日下降。此造模操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定可靠、表面效度高且短時(shí)間內(nèi)可大量復(fù)制，是目前抗偏頭痛藥物新藥研究的首選動(dòng)物模型[3]。

2.2 青藤堿對(duì)偏頭痛模型大鼠蛛網(wǎng)膜下腔小血管周炎性細(xì)胞數(shù)的影響以觀察蛛網(wǎng)膜下腔小血管周圍單位面積(以視野為單位)炎性細(xì)胞(以淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞為主)數(shù)的變化（見(jiàn)表1，圖1、圖2）。

從表1可得出，模型組大鼠蛛網(wǎng)膜下腔小血管周圍炎性細(xì)胞數(shù)(以淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞為主)明顯增多，與空白組相比較，差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；Sin各劑量組蛛網(wǎng)膜下腔小血管周圍炎性細(xì)胞數(shù)明顯減少，與模型組相比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；Sin高劑量組蛛網(wǎng)膜下腔小血管周圍炎性細(xì)胞數(shù)與空白組無(wú)差異(P＞0.05)，提示其劑量抑制偏頭痛的ANI反應(yīng)效果最佳。

3 討論

表1 各組大鼠蛛網(wǎng)下腔炎細(xì)胞數(shù)比較

圖1 各組動(dòng)物腦干蛛網(wǎng)膜下腔HE染色圖像。A、B、C、D、E分別顯示：空白組、模型組、Sin低劑量組、Sin中劑量組、Sin高劑量組(×400)

圖2 青藤堿對(duì)大鼠蛛網(wǎng)膜下腔炎性細(xì)胞的影響

偏頭痛是一種反復(fù)發(fā)作的原發(fā)性頭痛，是臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病。但其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明了。偏頭痛的血管學(xué)認(rèn)為偏頭痛與ANI有關(guān)。偏頭痛的神經(jīng)血管學(xué)說(shuō)認(rèn)為：三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)的激活可以誘發(fā)ANI。ANI表現(xiàn)為血管擴(kuò)張、血漿蛋白滲出、血管壁腫脹及肥大細(xì)胞脫顆粒。一般認(rèn)為ANI可以致痛[1]。在硬腦膜，ANI是由三叉神經(jīng)血管周圍纖維釋放各種血管活性神經(jīng)肽引起的，血管活性神經(jīng)肽的釋放引起血管擴(kuò)張，血漿蛋白滲出和促炎癥因子的釋放，如緩激肽、前列腺素和質(zhì)子[4]。NTG是一種脂溶性化合物，易透過(guò)血腦屏障，是NO的供體，NTG及其衍生物NO可增加硬膜細(xì)胞因子和iNOS的表達(dá)，產(chǎn)生ANI，而誘發(fā)偏頭痛。且NO具神經(jīng)毒性作用，可激發(fā)三叉神經(jīng)-血管反射，引起腦血管擴(kuò)張，產(chǎn)生偏頭痛。最近的研究結(jié)果表明炎性分子可能與偏頭痛的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，NO被認(rèn)為起到關(guān)鍵性作用的炎性分子[5]。注射NTG可引起大鼠硬腦膜遲發(fā)性炎癥反應(yīng)，并調(diào)節(jié)促炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-6產(chǎn)生[6]。炎性細(xì)胞因子能激活中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，而引起腦膜中中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞增多。研究證據(jù)表明：在ANI中細(xì)胞因子被認(rèn)為是疼痛介質(zhì)，它們可能引起偏頭痛的疼痛[7]。我們的觀察結(jié)果與何秋[8]等觀察的結(jié)果是一致的：空白對(duì)照組的大鼠蛛網(wǎng)膜下腔血管周無(wú)明顯炎性反應(yīng)，模型組的大鼠蛛網(wǎng)膜下腔血管周有大量淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及血管擴(kuò)張。Ucevler[9]等及梅海云[[10]等的研究也提示：?jiǎn)魏?巨噬細(xì)胞與偏頭痛的神經(jīng)源性疼痛有關(guān)，表明淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞等促炎性細(xì)胞因子確實(shí)存在于偏頭痛的神經(jīng)源性疼痛機(jī)制過(guò)程中。

Sin是從中藥青風(fēng)藤中提取的單體生物堿，具有明顯抗炎、抗免疫、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)咳等藥理作用。有研究認(rèn)為Sin抑制巨噬細(xì)胞的炎性物質(zhì)前列腺素F(PGF)和白三烯合成，降低細(xì)胞中NO合成是其抗炎機(jī)制[11]。梁瑞燕等[12]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究表明：Sin對(duì)IL-1β基因表達(dá)有較強(qiáng)的抑制作用，并認(rèn)為Sin可能是通過(guò)抑制炎癥性細(xì)胞因子的產(chǎn)生而發(fā)揮其抗炎作用。研究表明，Sin通過(guò)抑制前列腺素的合成和COX-2的活性而達(dá)到抑制急、慢性炎癥反應(yīng)的作用；研究證實(shí)，Sin可通過(guò)抑制炎性細(xì)胞因子如IL-1β、IL-2、IL-8、TNF-α等的表達(dá)及合成而產(chǎn)生抗炎作用；Sin還能有效抑制巨噬細(xì)胞釋放IL-1及TNF-α，從而有效抑制了新一輪炎癥的啟動(dòng)[13]；Sin具有鎮(zhèn)痛作用，其鎮(zhèn)痛作用弱于嗎啡，作用部位在中樞[11]。綜上所述，Sin具有抑制炎性細(xì)胞因子的釋放，從而抑制偏頭痛的ANI反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，NTG可引起模型組大鼠蛛網(wǎng)膜下腔血管周炎性細(xì)胞明顯增多，Sin各劑量干預(yù)組上述反應(yīng)明顯減輕，Sin高劑量組與空白組比較無(wú)差異。因此我們推測(cè)：Sin具有減輕偏頭痛的ANI反應(yīng)，從而達(dá)到治療偏頭痛的作用，可能是其治療偏頭痛的作用機(jī)制之一。

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Effects of sinomenine on inflammatory cells of subarachnoid in a rat model of migraine.

LUO Guobiao,LIU Xiaoli，Yang Li.
Department of Neurology,The Affiliated Hospital of Zunyi Medicine College,Zunyi 563099,China.Tel: 0855-8218920.

ObjectiveTo examine the effects of sinomenine(Sin)on inflammatory cell numbers of subarachnoid small perivascular and explore the role of anti-inflammatory of Sin in the treatment of migraine in a rat model of migraine.MethodsHealthy wistar ratswere random ly divided into 6 groups：normalgroup,modelgroup and Sin low dose group,Sin middle dose group and Sin high dose group.The ratmigrainemodelwas established by subcutaneously administration of nitroglycerin.The brain andmater of ratswere decapitated follo wing 4 h of medical intervention.HE stainingwas used to stain inflammatory cells and inflammatory cells within perivascular spaceswere counted under lightmicroscope.ResultsCompared to normal group,the inflammatory cells(mainly lymphocyte andmonocyte) within perivascular spaceswere increased significantly in model group[(28.10±2.28)vs.(1.60±1.07)，P＜0.01)]；The inflammatory cells in all three Sin groupswere significantly reduced compared withmodel group[Sin high dose group(2.60±1.43)、Sinmiddle dose group (5.10±1.37)、Sin low dose group(9.10±0.88)vs.(28.10±2.28)，P＜0.01].ConclusionsSin can significantly reduce inflammatory cells within perivascular spaces in the ratmodel of migraine,suggesting thatSin can effectively treatmigraine.

Migraine Sinomenine Subarachnoid Inflammatory cells

R651.1

A

2013-10-09）

（責(zé)任編輯：李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.04.002

☆貴州省省長(zhǎng)基金項(xiàng)目(黔省專合字(2008)112號(hào))

*貴州省遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(遵義 563099)

※現(xiàn)在為貴州省黔東南州人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

△貴州省遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科