流感病毒蛋白糖基化及其功能研究進展

丁小滿,俞慕華

流感病毒分為甲(A)、乙(B)、丙(C)3型，其中甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)亞型眾多，容易發(fā)生變異，可感染包括人在內(nèi)的各種動物像豬、馬、禽類、鳥類等，而且多次引起世界性大流行，一直受到人們的關注。本文綜述了甲型流感病毒外膜兩種重要糖蛋白(HA、NA)糖基化及其功能、研究方法等方面的進展。

1 流感病毒的糖蛋白

甲型流感病毒在病毒分類學上屬于正粘病毒科，基因組為分節(jié)段的單股、負鏈RNA。該病毒編碼的蛋白質(zhì)有糖基化和非糖基化之分，其中血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)是糖基化蛋白，都含有N-連接寡糖[1]，也是病毒表面的主要抗原，其余都是非糖基化蛋白。病毒蛋白糖基化在病毒糖蛋白的正確折疊、運輸、定位及構(gòu)象穩(wěn)定性等方面都發(fā)揮著重要作用，同時還參與調(diào)節(jié)流感病毒與宿主細胞表面糖鏈受體之間結(jié)合能力和特異性的功能[2-3]。

1.1血凝素糖蛋白

1.1.1HA的糖鏈受體結(jié)合特異性 HA是流感病毒最重要的表面糖蛋白，由病毒RNA 片段4 編碼，在病毒表面以三聚體的形式存在，包括胞內(nèi)尾巴、穿膜區(qū)、頸部和頭部4部分[4]。HA遠膜端三聚體球形頭部的受體結(jié)合位點(receptor binding site，RBS)識別宿主細胞膜上的糖蛋白或糖脂糖鏈末端的唾液酸(sialic acid，SA)多糖受體并與之相結(jié)合是A型流感病毒接觸和進入宿主細胞的關鍵。正常禽類流感病毒受體是α2-3唾液酸半乳糖(SAα2-3Gal)受體，其拓撲構(gòu)型是圓錐形。人類流感病毒的是α2-6唾液酸半乳糖(SAα2-6Gal)受體，其中短鏈的SAα2-6Gal受體呈圓錐形，而長鏈的SAα2-6Gal受體呈傘形，后者擴大了與RBS的結(jié)合[5-6]。進一步的研究發(fā)現(xiàn)唾液酸多糖受體含有一個五糖結(jié)構(gòu)，其中唾液酸(SA)和相鄰的半乳糖兩種糖分子構(gòu)象發(fā)生順時針扭轉(zhuǎn)則為α2-6 連鍵，形成SAα2-6Gal受體，逆時針扭轉(zhuǎn)則為α2-3 連鍵，形成SAα2-3Gal受體。說明唾液酸多糖受體的構(gòu)象變化使病毒HA對其識別的特異性也發(fā)生變化[7]。

1.1.2HA的功能及其糖基化對病毒的影響 HA主要在病毒侵染宿主細胞的早期發(fā)揮作用：一是HA的受體結(jié)合位點(RBS)和宿主細胞膜上的唾液酸(SA)多糖受體結(jié)合，從而啟動病毒感染過程[8]。二是具有與宿主細胞膜融合的活性，促使病毒進入宿主細胞。三是誘導保護性中和抗體的產(chǎn)生，抑制病毒增殖[9]。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)HA糖基化位點的增減及位置變化，HA上糖鏈結(jié)構(gòu)、數(shù)量的變化以及受體結(jié)合位點(RBS)附近糖鏈的修飾等不僅對病毒的增殖、毒力產(chǎn)生影響，還可以影響病毒與宿主細胞受體的結(jié)合能力等。

甲型流感病毒HA莖部的糖基化位點高度保守，可能是HA維持其功能必需的。不同毒株HA頭部的糖基化位點的結(jié)構(gòu)和數(shù)量則可以發(fā)生變化，可能是導致病毒多樣性的一個重要原因[2]。有研究表明，流感病毒HA頭部的糖蛋白糖基化位點數(shù)在病毒演化過程中具有增加的趨勢[1,10]。另外，HA的糖基化可以減少由于宿主先天性防御給病毒帶來的生存壓力，使病毒逃避宿主的免疫系統(tǒng)，維持病毒的生存。如HA的糖基化變化可以使病毒逃避T細胞的識別，HA頭部的N-連接多聚糖能夠掩蓋或修飾抗體識別的抗原位點[1,11]。國內(nèi)一些研究者通過構(gòu)建H5N1禽流感病毒某些糖基化位點的刪失模型，發(fā)現(xiàn)HA糖基化位點的改變還會影響病毒的增殖，并且在不同細胞中，影響是多樣性的[12]。

HA上的糖基化位點及糖鏈結(jié)構(gòu)對流感病毒的糖鏈受體特異性和宿主范圍也有重要影響。當HA糖鏈結(jié)構(gòu)復雜程度逐步降低，HA 對宿主糖鏈受體的特異性也隨之降低，但親和力增強[2,13]。HA上糖基化位點與RBS之間的距離也會影響病毒與宿主細胞受體的結(jié)合，HA上的糖基化位點距離RBS越近，這些聚糖影響病毒結(jié)合受體的潛力越大[14]。最近研究者們發(fā)現(xiàn)H7N9的HA上150-Loop區(qū)的T160A突變，可導致一個N-糖基化位點的缺失，減弱了其與SAα2-3Gal受體的結(jié)合能力，導致該病毒對人類受體的結(jié)合能力增強[15-16]。

HA上糖鏈數(shù)量的變化還會影響病毒毒力。HA裂解位點附近[17]、HA受體結(jié)合位點附近糖鏈的增加會減弱病毒毒力，HA 球形頭部附近糖鏈的增加則會增強病毒毒力。同時糖鏈結(jié)構(gòu)的復雜程度也會影響病毒毒力[2]。

1.2神經(jīng)氨酸酶糖蛋白 NA為四聚體，呈蘑菇樣，是由病毒RNA片段6編碼的Ⅱ型糖蛋白。NA的一級結(jié)構(gòu)包括氨基端胞漿尾，非極性跨膜區(qū)、莖部和頭部。NA莖部含有豐富的糖，差不多占NA中寡糖的一半，剩下的糖鏈位于頭部的頂端和底部，還有一個寡糖位于亞單位界面處。NA作為甲型流感病毒表面主要的糖蛋白，對病毒的傳染性有多方面作用：可以從病毒感染的細胞上去除唾液酸殘基，有助于子代病毒顆粒的成熟和釋放，防止新生流感病毒聚集；在感染早期幫助病毒移至正確的受體結(jié)合位點等[18-19]。

目前國內(nèi)外在NA糖鏈結(jié)構(gòu)及糖鏈功能等方面的研究較少，一般多集中在其糖基化位點的研究。神經(jīng)氨酸酶可以改變流感病毒血凝素的糖基部分，從而增強一些毒株的毒力[20]。Hulse等[21]發(fā)現(xiàn)NA糖蛋白頭部附加的糖基化位點是H5N1高致病力的一個影響因素，這是因為NA的糖基化可以保護NA糖蛋白避免宿主蛋白酶的攻擊，從而擴大病毒宿主范圍，增加病毒毒力。

2 流感病毒糖蛋白的研究方法

關于流感病毒糖蛋白的研究內(nèi)容主要分為兩大類：一是流感病毒糖蛋白結(jié)構(gòu)分析，二是流感病毒糖蛋白糖基化位點分析。常用的方法有芯片技術、質(zhì)譜法以及一些生物信息學軟件分析技術等。

2.1糖芯片技術 糖芯片(glycan chip)是生物芯片的一種，又稱糖微陣列(carbohydrate microarray)。糖芯片具有高通量，高敏感性，長期穩(wěn)定性等特點[22]?；驹硎菍⒍鄠€不同結(jié)構(gòu)的糖分子通過共價或非共價作用固定于芯片上，用預處理的蛋白進行雜交，檢測雜交信號，對糖和蛋白質(zhì)之間的相互作用、發(fā)現(xiàn)新的糖結(jié)合蛋白、鑒定多糖結(jié)構(gòu)等方面進行分析[23-24]。

近年來在流感病毒的糖蛋白研究方法中應用最多的就是糖芯片技術。如Yang等[25]利用糖芯片分析了流感病毒H7N7 A/Netherlands/219/2003的重組HA，發(fā)現(xiàn)HA糖基化位點T125A的缺失降低了RBS與SAα2-3Gal受體的結(jié)合能力。Xu等[26]通過糖芯片分析H7N9的血凝素發(fā)現(xiàn)HA糖蛋白對人類SAα2-6Gal受體的結(jié)合能力比較弱，而對禽類SAα2-3Gal受體有優(yōu)先的強結(jié)合能力。說明目前流行的H7N9在人與人之間的傳播效率很低，還未完全適應人類。

2.2凝集素芯片技術 凝集素(lectin)是一種能與糖蛋白糖鏈特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，相同結(jié)構(gòu)的凝集素可識別相同的糖類，一種凝集素只與含有一種糖分子的受體結(jié)合[27]。以凝集素為基礎發(fā)展起來的分析蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)方法主要有親和層析法、流式細胞術和免疫組化法等[28]。這里介紹的凝集素芯片技術是2005年出現(xiàn)的一種新型的糖鏈分析技術[29]。

凝集素芯片可以對糖蛋白結(jié)構(gòu)進行快速、高通量、高靈敏度的分析[30]?；驹?將各種已知聚糖結(jié)合特異性的凝集素固定于醛基化、環(huán)氧化或經(jīng)其他方式修飾后的玻璃片基上，再與標記過的生物樣品孵育反應，經(jīng)后續(xù)處理后，以檢測待檢測樣品的糖結(jié)構(gòu)。該技術常用于檢測一些癌細胞表面糖鏈的表達[31]。Wang等[32]將凝集素與芯片技術相結(jié)合對禽類和人類流感病毒HA上的多糖抗原進行研究，其他學者還利用凝集素芯片技術對克隆表達后的糖蛋白血凝素上糖鏈結(jié)構(gòu)進行分析[33]。

2.3質(zhì)譜技術 質(zhì)譜技術常用于糖基化位點的分析。經(jīng)典的質(zhì)譜分析技術首先采用酶法或者化學方法把糖鏈與肽鏈分開，再分別在氨基酸序列水平或者糖鏈水平進行分析。該技術對糖鏈的糖基化位點分析前，一般先對糖基化位點進行特異的質(zhì)量標記，使之與理論質(zhì)量有一個差異，然后通過質(zhì)譜分析檢測到這種差異，判斷是在哪個氨基酸殘基上發(fā)生了這種變化，最終確定糖基化位點[34]。

目前該策略所用到的切割糖鏈的方法有糖肽酶F(PNGase F)酶法、內(nèi)切β-N-乙酰葡糖胺酶H(Endo H)酶法、β-消除-米氏加成反應等。其中PNGase F 酶法常用于流感病毒糖蛋白的研究中[35]，也是目前糖蛋白研究中應用最為廣泛的一種N-糖蛋白鑒定方法。糖肽酶F幾乎可以切除糖蛋白中所有N-連接糖鏈，同時使天冬酰胺轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼?，造成相對分子質(zhì)量增加0.98，從而起到質(zhì)量標記N-糖基化位點的作用。這種方法雖然簡便，但缺點是不能區(qū)分自發(fā)脫氨基和酶促去糖基化，使得測定結(jié)果會產(chǎn)生誤差[34,36]。糖鏈被切割后常用的質(zhì)譜分析方法有基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)、電噴霧離子化質(zhì)譜( ESI-MS)、多級串聯(lián)質(zhì)譜技術等。

Chan等[37]在禽流感病毒(包括H7N9)感染豬離體組織的相關糖組學分析上就用到了質(zhì)譜技術。他們將高致病性、低致病性禽流感病毒分別感染豬的氣管和肺離體組織并進行病毒培養(yǎng)。一段時間后，在進行病毒的多糖提取前，所有組織先放在液氮中快速凍結(jié)。N-連接多糖的提取利用PNGase F進行消化，反向C18 Sep-Pak(水)色譜法進行純化，然后將產(chǎn)物進行MALDI-TOF-MS分析。研究發(fā)現(xiàn)禽流感病毒易結(jié)合的SAα2-3Gal受體主要在豬的下呼吸道細支氣管表達，而在氣管、主支氣管含量較少，說明豬不容易成為禽流感傳播給人的中間宿主。

2.4生物信息學軟件分析技術 近年來，國內(nèi)外很多研究者也利用一些新型的生物信息學軟件對流感病毒的HA、NA潛在的糖基化位點進行預測分析。

如Li等[38]將亞歐和美洲地區(qū)的H7N9流感病毒的HA、NA氨基酸序列提交至NetNGlyc 1.0 Server在線分析軟件，預測其糖基化位點。研究發(fā)現(xiàn)所有H7N9病毒HA蛋白的糖基化位點完全一致。亞歐地區(qū)NA有7個糖基化位點，美洲地區(qū)NA有6～7個糖基化位點。在52位糖基化位點，亞歐地區(qū)為NTS、NAS或NVS，美洲地區(qū)為NAS，兩個地區(qū)NA的其他糖基化位點均相同。他們還對我國7株新型H7N9病毒HA、NA蛋白的糖基化位點進行分析，發(fā)現(xiàn)與亞歐地區(qū)非人感染的H7N9病毒相比，7株新型H7N9病毒HA、NA蛋白的糖基化位點并未發(fā)生改變。所以推測病毒糖基化位點在此次流行的H7N9禽流感病毒致病性及宿主特異性改變上發(fā)揮作用較小。

3 結(jié) 語

目前，國內(nèi)外在流感病毒蛋白糖基化及其功能等方面的研究還有待進一步深入，一些應用于流感病毒糖蛋白研究的相關技術也需要完善，但也取得了顯著的成果。流感病毒糖蛋白HA、NA的變異對其增殖、毒力、宿主特異性等有重要影響。未來還可能出現(xiàn)新的流感病毒突變株，還需要繼續(xù)在這些方面對其進行研究，為流感的防治提供新的手段。

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