結(jié)核生物蛋白芯片在結(jié)核病早期診斷中的應(yīng)用

劉 偉

（吉林省白城市傳染病醫(yī)院，吉林 白城 137000）

結(jié)核生物蛋白芯片在結(jié)核病早期診斷中的應(yīng)用

劉 偉

（吉林省白城市傳染病醫(yī)院，吉林 白城 137000）

目的通過分析結(jié)核分枝桿菌LAM、16KD、38KD抗原的IgG抗體說明其檢出率和早期診斷意義。方法對(duì)2013年1月至2013年5月來白城市傳染病醫(yī)院門診和住院的就診229例患者分別應(yīng)用蛋白芯片法進(jìn)行定性檢測(cè)，隨機(jī)抽取其中96例陽性者進(jìn)行痰涂片抗酸染色法定性檢測(cè)。結(jié)果在229例血清檢測(cè)標(biāo)本中，結(jié)核抗體陰性標(biāo)本者114例，結(jié)核抗體陽性者115例，檢出的陽性率為50.22%。隨機(jī)選擇96例蛋白芯片法檢測(cè)陽性者做痰涂片抗酸染色法定性檢測(cè)，痰涂片陽性者僅為17例，陽性率僅為17.71%。結(jié)論作者認(rèn)為采用生物蛋白芯片技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)3種結(jié)核抗體，可提高其診斷結(jié)核病的敏感性和特異性，并作為結(jié)核病的血清學(xué)早期診斷方法之一。

結(jié)核分枝桿菌；LAM抗原；16KD抗原；38KD抗原；IgG抗體；蛋白芯片技術(shù)；早期診斷；痰涂片；比較性分析

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種常見慢性傳染病，可見于全身的各個(gè)組織器官，但以肺結(jié)核最多見。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球現(xiàn)有活動(dòng)性肺結(jié)核患者2000多萬，我國有4億人感染過結(jié)核菌，是世界上22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，患者人數(shù)居全球第二位。X線檢查、痰液微生物學(xué)檢查和蛋白芯片法是白城市傳染病醫(yī)院臨床診斷結(jié)核病的主要方法，其中蛋白芯片法是近年來蛋白質(zhì)組學(xué)研究中興起的一種新方向，其基本原理是以微孔濾膜為載體，利用微陣陳列技術(shù)將純化的結(jié)核菌脂阿拉伯甘露糖（LAM）蛋白，16KDa（rTPA16）和38KDa（rTPA38）等3種抗原固相于同一膜片上，在固相膜上使抗原抗體反應(yīng)快速進(jìn)行，在以免疫全作為標(biāo)志物在膜上顯色，然后放入芯片閱讀儀，在專門軟件的支持下對(duì)抗原點(diǎn)陣以灰度值進(jìn)行分析，以達(dá)到檢測(cè)結(jié)核桿菌的目的。本文以結(jié)核生物蛋白芯片法檢測(cè)2013年1月～5月期間來白城市傳染病醫(yī)院門診和住院的就診229例患者的血液標(biāo)本，在統(tǒng)計(jì)陽性率的基礎(chǔ)上，與痰液微生物定性檢查結(jié)果相比較?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源

以2013年1月至2013年5月來白城市傳染病醫(yī)院門診和住院的就診229例患者為研究對(duì)象，其中男性131例，女性98例。常規(guī)采集靜脈血液標(biāo)本待應(yīng)用蛋白芯片法檢測(cè)，并隨即選擇96例陽性者進(jìn)行痰涂片抗酸染色法檢測(cè)。

1.2 儀器及試劑

南京大淵生物技術(shù)工程有限責(zé)任公司生產(chǎn)的PBT-X4型生物芯片識(shí)別儀，結(jié)核分枝桿菌IgG抗體檢測(cè)試劑盒（蛋白芯片）。

1.3 操作方法

取靜脈血2 mL，分離血清，在芯片上標(biāo)記上樣品編號(hào)，在芯片盒窗口內(nèi)滴加200 μL試劑A，使膜表面完全浸濕；待血清完全滲入后，室溫放置1 min。將待檢血清100 μL加入窗口中，待血清完全滲入后，再滴加300 μL試劑B，待試劑B完全滲入后，滴加500 μL試劑C，待試劑C完全滲入后，最后滴加300 μL試劑D，反應(yīng)完畢后30 min內(nèi)將芯片放入芯片識(shí)別儀進(jìn)行結(jié)果分析，在確保沒有開啟任何應(yīng)用程序的情況下，把芯片盒內(nèi)的小光盒放入光驅(qū)，機(jī)器會(huì)自動(dòng)進(jìn)入生物芯片檢測(cè)軟件，然后按程序操作，并打印出分析結(jié)果。痰液微生物檢查主要采用涂片抗酸染色法，操作方法參見《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[1]。

1.4 結(jié)果判定

LAM、16KDa、38KDa的IgG抗體有任一指標(biāo)為陽性，均確定為結(jié)核分枝桿菌感染。如IgG抗體均為陰性，提示未感染結(jié)核分枝桿菌。

2 結(jié) 果

2.1 蛋白芯片法檢測(cè)結(jié)果

在229例血清檢測(cè)標(biāo)本中，結(jié)核抗體陰性標(biāo)本者114例，結(jié)核抗體陽性者115例，檢出的陽性率為50.22%。其中，16Kda、38Kda和LAM均陽性者10例，單純16Kda陽性者4例，單純38Kda陽性者5例，單純LAM陽性者19例，16Kda和LAM陽性者6例，38Kda和LAM陽性者71例。

2.2 蛋白芯片法與痰涂片抗酸染色法定性檢測(cè)結(jié)果比較

在115例蛋白芯片法陽性標(biāo)本中，隨機(jī)選擇96例進(jìn)行痰涂片抗酸染色法定性檢測(cè)，其中痰涂片陽性者為17例，陽性率僅為17.71%。

3 討 論

結(jié)核病是世界衛(wèi)生組織和我國重點(diǎn)防治的重大傳染病之一[2]。早期結(jié)核病患者均有非特異性的一般癥狀，目前在肝臟、胰腺、腎臟、腹膜和骨骼等組織器官感染結(jié)核分枝桿菌的機(jī)會(huì)較高，肺外結(jié)核的發(fā)病率越來越高，有時(shí)傳統(tǒng)的診斷方法的假陰性率較高，致使大量結(jié)核病患者未能及時(shí)被及時(shí)診斷而延誤治療時(shí)機(jī)，這是目前結(jié)核病病死率急劇升高的重要原因之一。因此，如何早期診斷結(jié)核病，成為提高人群尤其是高危人群和患患者群健康水平一個(gè)重要手段，是結(jié)核病第二級(jí)預(yù)防的重要手段和措施。由于痰吐法、培養(yǎng)法和皮試法等診斷手段有的所需時(shí)間長(zhǎng)，有的檢出陽性率低，因此，世界衛(wèi)生組織要求各個(gè)國家和地區(qū)進(jìn)一步開發(fā)新的體外診斷試劑，生物蛋白芯片技術(shù)為一種重要的手段之一。

生物蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌抗體較敏感和特異的純化抗原為細(xì)胞壁LAM、16KDa蛋白和38KD蛋白，LAM是構(gòu)成結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁的重要組成成分，其特異性強(qiáng)，能刺激結(jié)核感染者產(chǎn)生抗體。16KDa蛋白是有潛力的免疫診斷抗原，38KDa蛋白為脂蛋白，其與細(xì)胞膜或菌體表面的脂肪結(jié)構(gòu)相連。結(jié)核病的免疫特征是細(xì)胞免疫功能低下，體液免疫功能增強(qiáng)。當(dāng)治療有效，感染控制后，LAM、16KDa、38KDa抗體水平下降。

生物蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的基本原理為：本文結(jié)果表明，229例門診及住院結(jié)核病患者的結(jié)核分枝桿菌抗體檢出率均高，尤其是LAM陽性者較高（為106例），占陽性總數(shù)的92.17%，提示血清LAM抗體是診斷結(jié)核病的重要標(biāo)志之一[3]，其診斷的特異性較高[4]；本文結(jié)果說明生物蛋白芯片技術(shù)能動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)這3種結(jié)核抗體，可用于結(jié)核病的藥物治療選擇的客觀依據(jù)；本文還顯示LAM、38KDa抗體檢出率隨結(jié)核病患者的年齡增加而升高，可能與年齡增加機(jī)體抵抗力或免疫力下降。在115例標(biāo)本中蛋白芯片法陽性標(biāo)本中，隨機(jī)選擇96例痰涂片抗酸染色法定性檢測(cè)，其中痰涂片陽性者為17例，陽性率僅為17.71%。說明，生物蛋白芯片技術(shù)有助于結(jié)核病的早期診斷。

綜上觀點(diǎn)，作者認(rèn)為采用生物蛋白芯片技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)3種結(jié)核抗體，可提高其診斷結(jié)核病的敏感性和特異性，并作為結(jié)核病的血清學(xué)診斷方法之一。生物蛋白芯片技術(shù)應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌抗體的檢測(cè)，不僅可以快速準(zhǔn)確地檢測(cè)血清中的相關(guān)各種抗體，而且還可以在不同人群中篩查出不同的抗體類型，為臨床結(jié)核病尤其是肺外結(jié)核的診斷及預(yù)后估測(cè)等提供重要的依據(jù)。

生物蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌抗體適用于：①用于活動(dòng)性結(jié)核病菌感染引起的疾病特異性抗體檢測(cè)，可作為結(jié)核病的血清學(xué)診斷方法之一。②非活動(dòng)性感染及接受過卡介苗接種者。③痰涂片、培養(yǎng)檢測(cè)為陰性的人群檢測(cè)。④肺部其他疾病的鑒別診斷和結(jié)核病化療后的動(dòng)態(tài)觀察。

應(yīng)用該方法時(shí)，對(duì)標(biāo)本有嚴(yán)格要求：①靜脈血清體積應(yīng)在150 μL以上；②溶血標(biāo)本和高脂血樣本不適宜本方法；③新鮮血樣在2～8 ℃環(huán)境下存放不要超過48 h；④長(zhǎng)期保存的樣本應(yīng)在-20 ℃以下保存，避免冷凍和反復(fù)凍融。

在檢測(cè)過程中應(yīng)注意：①2～8 ℃環(huán)境下取出的芯片和試劑需在室溫下平衡10 min方可使用。②每盒芯片配套1張校正光盤，只對(duì)該盒內(nèi)的芯片有效，不能與其他芯片混用；芯片反應(yīng)窗口膜不能損傷或受潮。③芯片陽性控制點(diǎn)不顯色，說明已經(jīng)失效，應(yīng)取一新芯片重做。④殘余標(biāo)本和用過的芯片，按照生物危險(xiǎn)品進(jìn)行常規(guī)消毒處理。⑤操作時(shí)必須戴手套，檢測(cè)完畢徹底洗手。⑥眼部如接觸任何試劑，立即大量清水沖洗，如仍有不適，應(yīng)立即就醫(yī)。

該方法的優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在：①檢測(cè)速度快，適合快速診斷要求。試劑穩(wěn)定，不同的檢測(cè)單位和不同批號(hào)的試劑檢測(cè)可獲得穩(wěn)定一致的結(jié)果。②可以單人份操作，既可以方便患者又可以節(jié)約試劑。③結(jié)果的判斷采用芯片識(shí)別儀避免了人為主觀誤差。其缺點(diǎn)表現(xiàn)在：①價(jià)格相對(duì)昂貴，不適用于大規(guī)模血清流行病學(xué)調(diào)查。②標(biāo)本必須新鮮，對(duì)于黃疸血清和溶血標(biāo)本亦可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。③重癥結(jié)核患者，當(dāng)其免疫力極度低下時(shí)可能無法檢出抗體。

對(duì)結(jié)核病做出快速而準(zhǔn)確的診斷，一直是臨床工作中的重點(diǎn)和難點(diǎn)，探索更有特異性、敏感性、實(shí)用性的實(shí)驗(yàn)診斷的指標(biāo)和方法具有重要的意義。本文的觀察結(jié)果表明，生物蛋白芯片技術(shù)是可被選擇的手段之一，對(duì)結(jié)核病的早期診斷有一定意義。

[1] 中國防癆協(xié)會(huì).結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程[J].中國防癆雜志, 1996,18:18-31.

[2] 張秀珍,胡云建,陳東科.結(jié)核病實(shí)驗(yàn)診斷進(jìn)展[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2005,28(8):865-866.

[3] 汪偉明,周國平,張鋼.血清LAM-IgG抗體對(duì)結(jié)核病的診斷價(jià)值[J].中國血液流變學(xué)雜志,2001,11(3):219-220.

[4] 孔忠順,管波清,古淑香,等.血清抗脂阿拉伯甘露糖及38kDa抗體檢測(cè)對(duì)涂陰肺結(jié)核及肺外結(jié)核診斷價(jià)值[J].中國防癆雜志, 2002,24(3):140-142.

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1671-8194（2014）13-0197-02